ISOLASI DAN ANALISIS FLAVONOID

I. TUJUAN

Diharapkan mahasiswa mampu melakukan isolasi dan anlisis flavonoid.

II. DASAR TEORI

Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok fenol yang terbesar yang

ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu dan
biru dan sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan.
Flavonoid merupakan pigmen tumbuhan dengan warna kuning, kuning jeruk, dan
merah dapat ditemukan pada buah, sayuran, kacang, biji, batang, bunga, herba,
rempah-rempah, serta produk pangan dan obat dari tumbuhan seperti minyak
zaitun, teh, cokelat, anggur merah, dan obat herbal. Flavonoid juga dikenal
sebagai vitamin P dan citrin, dan merupakan pigmen yang diproduksi oleh
sejumlah tanaman sebagai warna pada bunga yang dihasilkan. Bagian tanaman
yang bertugas untuk memproduksi flavonoid adalah bagian akar yang dibantu
oleh rhizobia, bakteri tanah yang bertugas untuk menjaga dan memperbaiki
kandungan nitrogen dalam tanah.Senyawa ini berperan penting dalam menentukan
warna, rasa, bau, serta kualitas nutrisi makanan. Tumbuhan umumnya hanya
menghasilkan senyawa flavonoid tertentu. Keberadaan flavonoid pada tingkat
spesies, genus atau familia menunjukkan proses evolusi yang terjadi sepanjang
sejarah hidupnya. Bagi tumbuhan, senyawa flavonoid berperan dalam pertahanan
diri terhadap hama, penyakit, herbivori, kompetisi, interaksi dengan mikrobia,
dormansi biji, pelindung terhadap radiasi sinar UV, molekul sinyal pada berbagai
jalur transduksi, serta molekul sinyal pada polinasi dan fertilitas jantan.

Senyawa flavonoid untuk obat mula-mula diperkenalkan oleh seorang

Amerika bernama Gyorgy (1936). Secara tidak sengaja Gyorgy memberikan
ekstrak vitamin C (asam askorbat) kepada seorang dokter untuk mengobati
penderita pendarahan kapiler subkutaneus dan ternyata dapat disembuhkan.
Mc.Clure (1986) menemukan pula oleh bahwa senyawa flavonoid yang diekstrak
dari Capsicum anunuum serta Citrus limon juga dapat menyembuhkan
pendarahan kapiler subkutan. Mekanisme aktivitas senyawa tersebut dapat
dipandang sebagai fungsi “alat komunikasi‟ (molecular messenger) dalam proses
interaksi antar sel, yang selanjutnya dapat berpengaruh terhadap proses
metabolisme sel atau mahluk hidup yang bersangkutan, baik bersifat negatif
(menghambat) maupun bersifat positif (menstimulasi).

Flavonoid merupakan kelompok senyawa fenolik terbesar yang ditemukan di

alam dan berasal dari tumbuhan tingkat tinggi.  Flavonoid mempunyai kerangka
dasar dengan 15 atom karbon, dimana dua cincin benzen (C6) terikat pada satu
rantai propan (C3) sehingga membentuk suatu susunan (C6-C3-C6) dengan struktur
1,3-diarilpropan. Senyawa-senyawa flavonoid terdiri dari beberapa jenis,
bergantung pada tingkat oksidasi rantai propan dari sistem 1,3-diarilpropan
[Achmad, 1985]. Agar mudah, cincin diberi tanda A, B, dan C,atom karbon
dinomori menurut sistem penomoran yang menggunakan angka biasa untuk cincin
A dan C, serta angka “beraksen” untuk cincin B.

Flavonoid adalah senyawa yang tersusun dari 15 atom karbon dan terdiri dari
2 cincin benzen yang dihubungkan oleh 3 atom karbon yang dapat membentuk
cincin ketiga. Flavonoid dibagi menjadi 3 macam, yaitu:

1. Flavonoid yang memiliki cincin ketiga berupa gugus piran. Flavonoid ini
disebut flavan atau fenilbenzopiran. Turunan flavan banyak digunakan
sebagai astringen (turunan tanin).
2. Flavonoid yang memiiliki cincin ketiga berupa gugus piron. Flavonoid ini
disebut flavon atau fenilbenzopiron. Turunan flavon adalah jenis flavonoid
yang paling banyak memiliki aktivitas farmakologi.
3. Flavonoid yang memiiliki cincin ketiga berupa gugus pirilium. Flavonoid
ini disebut flavilium atau antosian. Turunan pirilium biasa digunakan
sebagai pewarna alami. Kerangka dasar karbon pada flavonoid merupakan
kombinasi antara jalur sikhimat dan jalur asetat-malonat yang merupakan
dua jalur utama biosintesis cincin aromatik.
Struktur Flavonoid

Istilah flavonoida diberikan untuk senyawa-senyawa fenol yang berasal dari

kata flavon, yaitu nama dari salah satu flavonoid yang terbesar jumlahnya dalam
tumbuhan. Senyawa-senyawa flavon ini mempunyai kerangka 2-fenilkroman,
dimana posisi orto dari cincin A dan atom karbon yang terikat pada cincin B dari
1.3-diarilpropana dihubungkan oleh jembatan oksigen sehingga membentuk
cincin heterosiklik yang baru (cincin C).
Senyawa-senyawa flavonoid terdiri dari beberapa jenis tergantung pada tingkat
oksidasi dari rantai propana dari sistem 1,3-diarilpropana. Flavon, flavonol dan
antosianidin adalah jenis yang banyak ditemukan dialam sering sekali disebut
sebagai flavonoida utama. Banyaknya senyawa flavonoida ini disebabkan oleh
berbagai tingkat alkoksilasi atau glikosilasi dari struktur tersebut.
III. BAHAN DAN ALAT

BAHAN :

 Serbuk daun singkong

 Air suling
 Metanol
 Amonia
 Hcl 2N
 Natrium sulfat anhidrat
 Asam asetat 15%
 n-butanol
 Pereaksi sitroborat
 KMNO4
 Lempeng selulosa

ALAT :

 Panci infus
 Erlenmeyer 250 ml
 Gelas ukur
 Beaker glass
 Corong gelas
 Corong pisah
 Cawan porselen
 Tabung reaksi
 Vial
 Seperangkat KLT
IV. CARA KERJA

A. Isolasi rutin dari daun ketela pohon

50 gram serbuk daun singkong, dimasukkan Saring campuran melalui corong buchner
dalam panci infus dan di tambah 400 ml sehingga diperoleh filtrat jernih dan pindahkan
air,didihkan selama 30’. ke dalam erlenmeyer 250ml.

Tuangkan larutan dengan hati-hati supaya Simpan pada almari es selama 1 minggu
kristal tidak tertuang, kemudian saring sehingga terbentuk kristal amorf putih
kristal yang ada pada erlenmeyer melalui kekuningan.
kertas saring yang ditara.

jika kristal masih menempel pada dasar erlen

Keringkan kertas saring bersama endapan
maka bilas dengan air suling dingin, cuci
pada suhu 50° C hingga kering dan timbang
kristal dg 10 ml air es.

Ambil sedikit dengan ujung spatel kecil,

larutkan dala, 2 capuran metanol-air sama
banyak (sari 1)
.
B. Hidrolisis rutin menjadi glikon dan aglikonnya

Masukkan secara enap dan tuang filtrat ke tabung

Ambil kurang lebih 0,1 g padatan dan
reaksi, tambahkan 15-20 ml HCl 2 N dalam beaker
masukkan ke dalam beaker glass +
glass, enap tuang dan masukkan filtrat ke tabung reaksi
tambahkan metanol max 5 ml

Jika cairan banyak yang menguap Taruh corong kecil berisi kapas diatas tabung
tambahkan 5 ml air suling yang panas untuk mengurangi penguapan dan lakukan
didalamnya refluks selama 1 jam

Tuangkan cairan hidrolisis yg sudah Tambahkan 20 ml dietil eter, kocok lembali

dingin dari tabung raksi ke dalam lapisan air asamny dg 20 ml dietil eternya
corong pisah dengan yang pertama

Uapkan eternya tanpa pemanasan dan

Saring sari eter melalui kertas saring yang berisi
larutkan residu yg didapat dalam 2 ml
1 gr natrium sulfat anhidrat ke dalam cawan
metanol (sari 2)
porselin

Uapkan lapisan air asam hasil

hidrolisis pada cawan porselin diatas
penangas air sehingga cairan kira-kira
tinggal 1 ml (sari 3)
 C. Analisis Hasil Isolasi

Hitung randemen kristal yang diperoleh

Amati organoleptis yang didapat dan

lakukan analisia umum flavonoid pada
kristal dan hasil hidrolisis

Lakukan identifikasi dengan cara KLT

dengan 2 kondisi kemudian dibandingkan
harga Rf dan warna yang terbentuk

Analisis kualitatif I :

Fase diam : selulosa

Fase gerak : asam asetat 15 %

Cuplikan : sari 1 ,2 ,3 dan pembanding larutan rutin dalam

metanol 50% sebanyak 3 totolan kecuali sari 3 10 totolan

Deteksi : sinar UV 366,uap amonia dibawah sinar tampak dan

UV 366, pereaksi sitroborat panaskan 100◦C selama 5’

Analisis kuantitatif II :

Fase diam : selulosa

Fase gerak : n-butanol : asam asetat 15 % : air (4:1:5)

Cuplikan : sari 1 ,2 ,3 dan pembanding larutan glukosa dan

ramnosa 1% sebanyak 3 totolan kecuali sari 3 dan pembanding
10 totolan

Deteksi : sinar UV 366, uap amonia (untuk flavonoid) dan

larutan penyemprot kalium permanganat basa untuk gula catat
harga Rf dan warna yg terbentuk
 D. Analisis Penggolongan Flavonoid

Serbuk daun tempuyung dengan pembanding Sebanyak 1 gr sampel dipanaskan dalam 100
kuersetin dan rutin ml air suling dan dididihkan selama 15’

Kemudian disaring dan diperoleh filtrat A,

Ditambahkan serbuk magnesium, asam
sebanyak 5 ml filtrat A dimasukkan tabung
hidroklorida pekat, dan amil alkohol
reaksi

Hasil positif flavonoid ditunjukkan dengan

Campuran dikocok kuat dan dibiarkan
warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan
memisah
amil alkohol

Flavon : Jingga sampai merah

Flavanol : merah sampai merah tua

Flavanon : merah tua sampai magenta

V. HASIL DAN PEMBAHASAN

Identifikasi KLT

Fase diam : selulosa

Fase gerak : asam asetat 15%

Cuplikan Rf Warna noda Pereaksi

Visual UV 254 nm UV 366 nm
Sari 1 0,571 Tidak Ad peredam Berfluooresensi Kuning
terlihat warna Coklat coklat
Sari 2 : fraksi 0,543 Tidak Ada peredam Berfluoresensi Putih
air terlihat warna Coklat Coklat kekuningan
muda
Fraksi etil 0,542 Tidak Ada peredam Berfluoresensi Kuning
terlihat warna ada Coklat
peredam
warna Coklat
muda
Rutin 0,535 Tidak Ada peredam Berfluoresensi Putih
terlihat warna Coklat Coklat kekuningan
Quersetin 0,657 Tidak Ada Berfluoresensi Kuning
terlihat wperedam Kuning
warna
kuning

Fase diam : selulosa

Fase gerak : butanol : asam asetat : aquadest ( B A W )

cuplikan Rf Warna noda Pereaksi

Visual UV 254 UV 366 nm
nm
Sari 1 0,500 Kuning Ada Berfluoresensi kuning
peredaman kuning
Coklat
Fase air 0,314 Tidak Ada Berfluoresensi Putih
terlihat peredaman coklat kekuningan
coklat
Fase etil 0,571 Tidak Ada Berfluoresensi kuning
terlihat peredaman berfluoresensi
Kuning kuning
Glukosa 0,628 Kuning Ada Berfluoresensi Kuning
peredaman kuning
kuning

Analisis golongan flavonoid

Sampel Uji shinoda +/-

Filtrat ketela pohon Coklat +
Jambu biji Jingga +
Tempuyung Jingga +
Quersetin Merah +
Rutin Kuning +

PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini akan dilakukan isolasi rutin dari daun ketela
pohon. Rutin merupakan salah satu glikosida flavonoid yang bersifat polar Hasil
dari isolasi rutin ketela pohon ini akan dianalisis dengan mengidentifikasi dengan
KLT. Analisis ada 2 yaitu secara kualitatif dan kuantitatif. Pada analisis kualitatif
menggunakan fase diam selulosa, fase gerak asam asetat 15%,totolan
menggunakan ketela pohon,fase air,fase etil,rutin,dan quersetin. Kemudian
dideteksi dengan cara visual, UV 254nm,UV 366nm dan pereaksi sitroborat. Pada
hasil yang sudah dicoba ini, menunjukan bahawa totolan yang menunjukan Rf
yang paling tinggi yaitu quersetin dan paling rendah yaitu rutin. Quersetin pada
sampel masih dalam bentuk glikosidanya. Bentuk glikosida ini bersifat
polar.Sedangkan pada pengamatan visual ini semua totolan tidak terlihat oleh
mata. Sedangkan pada UV 254nm lempeng akan berfluoresensi sedangkan sampel
akan tampak gelap. Penampakan noda akan dipengaruhi interaksi sinar UV
dengan indikator fluoresensi yang ada pada lempeng.pada UV 254nm ini sari
1,rutin, quersetin terjadi peredaman berwarna kuning. Karena terjadi interaksi
antara sinar UV dengan indikatornya.Pada UV 366nm noda akan berfluoresensi
dan lempeng akan bewarna gelap. Penampakan noda dipengaruhi karena adanya
interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat . pada sinar UV
366nm juga sama dengan UV 254 nm,bahwa yang bewarna kuning hanyalah
quersetin. Ini menunjukan bahawa hanya sedikit terjadi interaksi . selanjutnya
diberi pereaksi semprot sitroborat,semuanya dapat terlihat oleh
pereaksi.Selanjutnya menggunakan analisis kualitatif, dimana menggunakan fase
diam selulosa, fase gerak : n butanol: asam asetat 15%: air,dengan totolan sari
1,fase air, fase etil,dan glukosa. Pada ke empat totolan ini Rf yang paling tinggi
adalah glukosa dan paling rendah adalah fase air. Pada pengamatan secara visual
hanya fase air dan fase etil saja yang tidak bisa terlihat. Sedangkan pada sinar UV
254 nm ini yang bewarna coklat hanyalah pada ketela pohon dan fase
air,sedangkan pada UV 366 nm yang bewarna coklat itu pada fase air saja. Pada
pereaksi semua sampel terlihat dan ada warnanya. Mungkin jika terjadi
ketidaksesuain warna dari beberapa totolan ini mungkin bisa jadi diakibatkan
karena pencampuran reagen yang kurang cermat dan alat yang tidak steril.

Kromatografi lapis tipis merupakan teknik kromatografi yang digunakan

untuk memisahkan campuran yang tidak volatil. KLT memberikan fleksibillitas
yang lebih besar dalam hal memilih fase gerak. Pada KLT ini menggunakan fase
diam selulosa. Selulosa dapat memisahkan senyawa hidrofil . pola kromatogram
bertujuan untuk memberikan gambaran awal koposisi kandungan kimia
berdasarkan pola KLT pada kromatogram ,flavonoid merupakan senyawa
metabolit sekunder yang terdapat pada tanamanhijau kecuali alga. Flavonoid
lazim banyak ditemukan pada tumbuhan seperti flavon dan flavonol dengan C dan
O glikosida,isoflavon,flavonon. Golongan flavon,flavonol dan flavonon dapat
ditemukan pada aglikon. Pada quercetin termasuk senyawa kelompok flavonol
besar,quercetin dan glikosida berada dalam jumlah 60-75% dari flavonoid.

Analisis golongan flavonoid dengan menggunakan uji shinoda ini

digunakan untuk mengetahui ada tidaknya flavonoid pada suatu tanaman tertentu.
Pada hasil filtrat ketela pohon positif mengandung flavonoid dengan adanya
warna coklat. Pada jambu biji dan tempuyung positif adanya flavonoid dengan
berubahnya warna jingga. Pada quersetin positif adanya kandungan flavonoid
dengan berubahnya warna menjadi merah .dan rutin juga mengandung flavonoid
dengan berubahnya warna menjadi kuning. Ini menunjukan bahwa semua sampel
yang kita uji ini sudah positif mengandung flavonoid. Dimana flavonoid ini
merupakan salah satu golongan fenol yang terdapat diberbagai macam tumbuhan.
VI. KESIMPULAN

Pada percobaan diatas dapat disimpulkan bahwa ketela pohon

mengandung senyawa rutin dengan pengamatan pada UV 254,UV 366 dan
menggunakan pereaksinya. Sedangkan pada uji shinoda semua sampel yang
digunakan ini positif mengandung flavonoid dengan berubah warna.
VII. DAFTAR PUSTAKA

Robinson,Trevor.1995.Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi.ITB :

Bandung
Sastrohamidjojo,Harjoko.1996.Sintesis Bahan Alam . Gadja Mada
University Press : Yogyakarta
J.B. Harborne, Metode Fitokimia, Penuntun cara modern menganalisis
tumbuhan, (Terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro),
Penerbit ITB, Bandung, 1987
LAMPIRAN