PERCOBAAN V

Judul : Pemisahan Pigmen dari Tanaman

Tujuan : Pada akhir percobaan ini mahasiswa harus paham mengenai
1. Cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan.
2. Pengenalan isolasi bahan alam yang bermolekul besar.
3. Analisa senyawa bahan alam (berwarna) dengan menggunakan
KLT dan kromatografi kolom
Hari/tanggal : Rabu / 7 Mei 2014
Tempat : Laboratorium Kimia PMIPA FKIP UNLAM Banjarmasin

I. DASAR TEORI
Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang,
umumnya berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi
cahaya matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya
berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri
(misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ
fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun.
Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen)
antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun
klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya
adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut
non polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan
klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid
pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar
dibandingkan klorofil a. Adapun struktur dari kedua jenis klorofil ini adalah sebagai
berikut :


Gambar Struktur klorofil a

Gambar Struktur klorofil b

Karoten C
40
H
56
adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem
ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan
10 % alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non
polar, akan tetapi mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten juga
ada dua jenis yaitu a-karoten dan -karoten, yang membedakan kedua struktur ini
adalah posisi ikatan rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya adalah sebagai
berikut :







Gambar Struktur -karoten











Gambar Struktur -karoten

Xantofil C
40
H
50
O
2
adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan
xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih
larut dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten.
Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil
memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah
sebagai berikut :


Gambar Struktur xantofil

Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna merah,
biru atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari
daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering
sampai halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan
urutan kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol. Adapun
struktur umum dari antosianin adalah sebagai berikut :

Gambar Struktur umum antosianin
Adapun salah satu teknik pemisahan pigmen dari tanaman adalah dengan
menggunakan kromatografi kolom. Kromatografi kolom merupakan teknik
kromatografi yang paling awal ditemukan dari mekanismenya, kromatografi kolom
merupakan terapan atau absobsi yang tidak boleh larut dalam fasa gerak, ukuran
partikel fasa diam harus seragam. Zat pengotor yang terdapat pada fasa diam dapat
menyebabkan absobsi tidak reversible sebagai fasa diam digunakan alumina, silika
gel, arang, bauksit, magnesium karbonat, kalsium karbonat, talk, pati, sekelator,
gula dan tanah diatom. Fasa gerak pada kromatografi kolom dapat berupa pelarut
tunggal atau campuran beberapa pelarut polar dan nonpolar. Umumnya senyawa
nonpolar dengan berat molekul lebih cepat meninggalkan fasa diam (Soebagio,
2000:81-82).
Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen pigmen warna
dari daun. Pada kromatografi kolom ini digunakan kolom dengan adsorben silika
gel karena kolom yang dibentuk dengan silica gel memiliki tekstur dan struktur
yang lebih kompak dan teratur. Silika gel dalam bentuk tetrahedral raksasa,
sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu
menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal.

Daun Sirih Merah
Tumbuhan sirih merah (Piper
porphyrophyllum N.E.Br.) digunakan
dalam berbagai jenis pengobatan di
Malaysia seperti pada pengobatan sakit
kepala dan sakit tulang, dada sesak, lepra,
sakit perut pada anak-anak, untuk wanita setelah melahirkan, serta untuk penyakit
kulit yg disebut sopak. Tumbuhan ini ditemukan pada saat pengobatan gajah yang
terluka akibat terkena tembakan (Burkill, 1935).
Adapun kandungan dari daun sirih merah yang berhubungan dengan pigmen
warnanya adalah sebagai berikut:
1. Flavonoid
Flavonoid berfungsi sebagai pigmen pemberi warna pada bunga dan buah.
Flavonoid yang termasuk antosianidin adalah berwarna merah, biru, dan ungu.
Flavonoid juga terdapat pada daun, yaitu sebagai pelindung pada tumbuhan
untuk melawan pengaruh buruk radiasi ultraviolet.
2. Antosianin
Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan tersebar luas dalam
tumbuhan, digunakan sebagai pembentuk dasar pigmen merah, ungu dan biru pada
tanaman, terutama sebagai ewarna bunga dan buah-buahan. Antosianidin yang
paling umum adalah sianidin yang menyebabkan warna merah lembayung
3. Khalkon
Khalkon merupakan pigmen fenol kuning yang berwarna coklat kuat dengan sinar
ultraviolet bila dikromatografi kertas dan di uapi dengan ammonia maka warnanya
berubah atau tetap. Khalkon menunjukkan puncak yang lebar antara 365-390 nm
didaerah spektrum tampak.

II. ALAT DAN BAHAN
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini, antara lain :
1. Kolom konvensional :1 buah
2. Gelas ukur 10 ml : 4 buah
3. Gelas ukur 50 ml : 1 buah
4. Gelas kimia 100 ml : 2 buah
5. Gelas kimia 200 ml : 1 buah
6. Corong biasa : 1 buah
7. Batang pengaduk : 1 buah
8. Spatula : 1 buah
9. Tabung reaksi : 4 buah
10. Rak tabung reaksi : 1 buah
11. Pipet tetes : 4 buah
12. Lumpang dan alu : 1 buah
13. Statif dan klem : 1 buah
14. Rotatory evaporator : 1 buah
15. Gunting : 1 buah
16. Lampu UV : 1 buah
17. Erlenmeyer : 1 buah
18. Hair dryer : 1 buah

Bahan-bahan yang diperlukan dalam percobaan ini, antara lain :
1. Sampel daun sirih merah (Piper porphyrophyllum N.E.Br.)
2. Glass wool
3. Sebuk Al
2
O
3
(alumina)
4. Kertas saring
5. Petroleum benzena
6. Kloroform
7. Metanol
8. Etanol
9. Plat KLT silika gel
10. Pipa kapiler

III. PROSEDUR KERJA
A. Ekstraksi Sampel
1. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu.
2. Menambahkan 20 mL etanol, mengaduk sampai merata.
3. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong.
4. Memekatkan larutan dengan menggunakan rotavapor sampai larutan tinggal
setengah mL.


B. Pembuatan Kromatografi Kolom
1. Menyiapkan kolom gelas 50 mL, tinggi 20 cm dan diameternya 1,5 cm.
yang bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran.
2. Memasukkan glass wool kedalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm.
3. Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm.
4. Membuat adonan dari 25 g alumina (Al
2
O
3
) dengan 25 mL etanol.
5. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm sambil
mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka, serta secara sedikit
demi sedikit (jangan ada gelembung udara).
6. Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan
alumina dalam kolom dan memasukkan glass wool.

C. Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan
1. Membuka kran dan membiarkan pelarut (etanol) turun hingga mendekati
penyerap (adonan Al
2
O
3
).
2. Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut
etanol turun mendekati penyerap (adonan Al
2
O
3
).
3. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan
kepolarannya yaitu petroleum benzena, kloroform, etanol dan metanol. Jika
permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap.
4. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi
yang bersih.
5. Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom
kaca.
6. Melakukan proses KLT dengan larutan pengembang yang sesuai.





IV. HASIL PENGAMATAN
No. Perlakuan
Hasil Pengamatan
1.


2.

3.

4.




5.



6.
Menggerus 10 lembar daun sirih
merah dan menambahkan 20 mL
etanol
Menyaring dengan corong

Memekatkan filtrat dengan
rotavapor
Mengkromatografi kolom dengan
empat pelarut



Perbandingan eluen dalam KLT
Petroleum benzen : kloroform :
etanol : metanol ( 2 mL : 2 mL : 2
mL : 2 mL)
Melakukan KLT, menyinari dengan
lampu/sinar UV dan menghitung
nilai Rf
Rf 1 : pelarut petroleum benzen
Rf 2 : pelarut kloroform
Rf 3 : pelarut etanol
Rf 4 : pelarut metanol
Campuran


Filtrat : ekstrak daun sirih merah
Residu : ampas daun sirih merah
Ekstrak pekat

Petroleum benzen : larutan bening
Kloroform : larutan bening
Etanol : larutan bening
Metanol : larutan berbias hijau
kekuningan
Gelas jenuh akan eluen





Nilai Rf :
Rf 1 : -
Rf 2 : -
Rf 3 :

Rf 4 :

V. ANALISIS DATA
Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari sampel daun, yaitu daun
sirih merah menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut yaitu
petroleum benzen, kloroform, metanol, dan etanol. Setelah itu menguji masing-
masing ekstrak pelarut dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT untuk
menentukan jenis pigmen yang terkandung dalam daun tersebut.

A. Ekstraksi Sampel Daun
Pertama-tama melumatkan sampel daun dengan lumpang dan alu, lalu
mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. Pelumatan ini bertujuan
menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut
dalam pelarut etanol, sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan
untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat
terekstrak. Etanol efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian
besar pigmen tumbuhan seperti klorofil, karoten, dan xantofil memiliki sifat
diantara polar dan non polar sehingga dapat larut dalam etanol yang merupakan
pelarut semipolar. Namun proses ekstraksi ini harus dilakukan dengan cepat
karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis
reaksi antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam daun akan
berkurang. Reaksinya adalah sebagai berikut.
Etanol + klorofil fitol + etil klorofilida
Setelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung
pigmen tanaman, sedangkan residunya dibuang. Larutan hasil ekstrak dengan
etanol ini, selanjutnya dipekatkan hingga separuh volume mula-mula.

B. Penyiapan Kolom Kromatografi
Selanjutnya membuat kolom kromatografi, dimana langkah pertama yang
dilakukan adalah membuat adonan Al
2
O
3
dengan pelarut etanol sehingga
terbentuk adonan alumina. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina
mengandung titik aktif Al-OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH
akan dapat terikat kuat dengan alumina jadi adonan alumina yang merupakan fase
diam akan lebih homogen. Adonan alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil
mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara, kolom harus
bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses
pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran
noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT.
Dalam hal ini alumina Al
2
O
3
yang digunakan sebagai adsorben atau fase
diamnya, karena Al
2
O
3
lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. Selain itu,
sebelum dimasukkan alumina, bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll,
hal ini bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun
dari kolom karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat
menahan alumina, tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir.
Saat mengisi kolom, kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga
diperoleh fase diam (alumina) yang padat. Setelah itu bagain atas kolom juga
diberi glass woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat
tersaring. Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan
setelah selesai, kran kolom ditutup.

C. Pemisahan Pigmen Daun Sirih Merah
Setelah kolom kromatografi siap dipakai, ekstrak sampel daun di masukkan
ke dalam kolom. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka
krannya. Di sini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan
mulai menetes. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung
reaksi dan mengganti tabung reaksinya ketika warna yang keluar dari kolom
berubah. Larutan berawarna ini adalah pigmen dari daun sampel. Adapun pelarut
yang digunakan adalah berdasarkan kepolaran yang paling kecil yaitu petroleum
benzen, kloroform, etanol dan metanol. Pelarut ini digunakan pada kromatografi
kolom secara berurutan.
Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. Kita
misalkan di dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil, ketika petroleum benzen
kita masukkan ke dalam kolom, klorofil dalam ekstrak daun akan larut di
dalamnya dengan kecepatan yang sama dengan fase geraknya (petroleum benzen)
dan keluar paling pertama, berarti klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada
alumina. Ini dapat terjadi karena alumina adalah senyawa polar sedangkan klorofil
adalah senyawa yang tergolong non polar. Karoten yang merupakan senyawa
yang lebih polar daripada klorofil, akan keluar dari kolom lebih lambat
dibandingkan klorofil karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat dari pada
klorofil. Untuk itulah digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar dibandingkan
petroleum benzen yaitu kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom dengan
lebih cepat namun dengan catatan klorofil sudah keluar seluruhnya. Begitu pula
seterusnya digunakan pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen
yang lebih polar seperti xantofil.
Berdasarkan percobaan, dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat
fraksi. Pada tabung dengan pelarut petroleum benzen didapatkan larutan bening.
Pada tabung dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan bening. Tabung
dengan pelarut etanol menghasilkan larutan bening dan pada tabung dengan
pelarut metanol menghasilkan larutan yang berwarna bias hijau kekuningan.
Warna bias hijau kekuningan yang dihasilkan pada pelarut metanol menunjukkan
bahwa sampel daun sirih merah mengandung xantofil karena xantofil merupakan
senyawa yang berwarna kuning.
Pada pelarut petroleum benzen dan kloroform tidak menimbulkan larutan
hijau. Hal ini mungkin disebabkan oleh kesalahan penggunaan pelarut yang mana
pelarut yang seharusnya adalah pelarut petroleum eter sedangkan yang digunakan
pada percobaan adalah petroleum benzen. Sedangkan untuk pelarut kloroform
dikarenakan pigmen klorofil yang telah bercampur pada fraksi metanol. Xantofil
dapat larut ke dalam pelarut metanol dikarenakan xantofil bersifat polar sehingga
larut dalam pelarut polar.
Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam sampel
daun sirih merah untuk fraksi metanol adalah xantofil sedangkan fraksi yang
lainnya tidak mengandung pigmen.
Berdasarkan percobaan untuk uji KLT, nilai Rf untuk fraksi (metanol) yang
mengandung xantofil adalah 0,55. Adapun menurut literatur harga Rf standar
untuk fraksi (metanol) yang mengandung xantofil adalah 0,767.
Dalam hal ini berdasarkan uji KLT terdapat perbedaan harga Rf standar dan
hasil percobaan. Hal ini mungkin disebabkan pergantian tabung reaksi untuk
penampungan tidak dilakukan berdasarkan waktu tertentu atau sampai pelarut
tidak menetes lagi, melainkan berdasarkan warna. Fraksi pigmen yang dihasilkan
kurang spesifik karena mata memiliki keterbatasan dalam menentukan warna jadi
kemungkinan ada fraksi yang tercampur.

VI. KESIMPULAN
1. Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman
dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk
melarutkan pigmen sampel daun.
2. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa alumina
dan fase gerak yaitu petroleum benzen, kloroform, metanol dan etanol.
3. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun
masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan
adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam.
4. Berdasarkan percobaan, daun sirih merah mengandung xantofil (berdasarkan
uji KLT) dengan nilai Rf nya 0,55.













DAFTAR PUSTAKA

Anwar, Chairil, dkk. 1996. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Yogyakarta :
Depdikbud.
Gritter, J., dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung : ITB.
Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan
Elektroforesis Modern. Bandung : Remaja Rosdakarya.
Rilia Iriani dan Syahmani. 2012. Petunjuk Praktikum Kimia Organik. Banjarmasin :
FKIP UNLAM.
Robinson, Trevon. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung : ITB.
Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II. Malang : JICA.
Underwood, A.L., dkk. 2002. Analitik Kimia Kuantitatif. Edisi Keenam. Jakarta :
Erlangga.














LAMPIRAN

Perhitungan
Rumus harga Rf



a. Etanol
Rf

Jadi, harga Rf untuk pelarut etanol adalah sebesar 0,525
b. Metanol
Rf

Jadi, harga Rf untuk pelarut metanol adalah sebesar 0,55

Pertanyaan
1. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam
kolom ?
2. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan
jelaskan mengapa terjadi demikian ?
3. Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang
diinginkan ?

J awaban
1. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom
karena dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan
penyerap), sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna).
Akibatnya terjadi penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di
KLT.
2. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil. Hal ini
dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga petroleum
benzen dapat melarutkan pigmen klorofil. Kemudian disusul dengan fraksi
kloroform dengan pigmen karoten, dimana karoten dan kloroform sama-sama
nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan klorofil dan petroleum benzen.
Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya adalah fraksi etanol dan disusul fraksi
metanol yang membawa pigmen xantofil, fraksi ini muncul terakhir karena
pigmen ini lebih larut dalam alkohol.
3. Teknik yang telah dilakukan berhasil tetapi hanya 1 pigmen saja yang keluar
yakni pada pelarut etanol dan metanol, seharusnya melalui fraksi-fraksi tersebut
dimungkinkan ada 3 pigmen yang muncul yaitu karoten, xantofil dan klorofil.
Namun proses pemisahannya kurang sempurna, hal ini mungkin dikarenakan:
a. Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam.
b. Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu
tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis.
c. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan
waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi, melainkan berdasarkan
warna. Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena mata memiliki
keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan ada fraksi yang
tercampur.