Machine Translated by Google

Baru
Riset

3
12Aktivitas pendamping yang diinduksi panas dari
serinÿtreonin protein fosfatase 5 meningkatkan termotoleransi dalam
Arabidopsis thaliana

Jin Ho Park1 *, Sun Yong Lee1 * , Woe Yeon Kim1 *, Young Jun Jung1 , Untuk Byoung Chae1, Hyun Suk Jung2 ,
Chang Ho Kang1 , Mi Rim Shin1 , Sun Young Kim1 , Mukhamad Su'udi3 , Dae Jin Yun1 , Kyun Oh Lee1 ,
Min Gab Kim3 dan Sang Yeol Lee1
1

Institut, 52 Eoeun-dong, Daejeon 305-333, Korea;

Penulis korespondensi: Sang

Yeol Lee Telp: +82 55 772
1351 Email: sylee@gnu.ac.kr

Min Gab Kim

Telp: +82 31 299 1744
Email: mgk1284@korea.kr

Diterima: 16 Februari 2011

Diterima: 17 Maret 2011

Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705

doi: 10.1111/j.1469-8137.2011.03734.x

Kata kunci: Arabidopsis thaliana, foldase

chaperone, holdase chaperone, phosphatase,
thermotolerance.

pengantar

Tumbuhan adalah organisme sessile autotrofik yang

2

Akademi Ilmu Pertanian Nasional, GDR, Suwon 441-856, Korea

Ringkasan
ahli fitologi

Divisi Ilmu Kehidupan Terapan, Universitas Nasional Gyeongsang, Jinju 660-701, Korea; Divisi Riset Mikroskopik Elektron, Ilmu Dasar Korea
3

• Studi ini melaporkan bahwa Arabidopsis thaliana protein serin threonine phospha
tase 5 (AtPP5) memainkan peran penting dalam ketahanan stres panas. Bentuk
berat molekul tinggi (HMW) dari AtPP5 diisolasi dari sel suspensi A. thaliana yang
diberi perlakuan panas. AtPP5 melakukan banyak fungsi, bertindak sebagai protein
fosfatase, pendamping foldase, dan pendamping holdase. Aktivitas enzimatik
protein serbaguna ini terkait erat dengan status oligomernya, mulai dari spesies
protein oligomer rendah hingga kompleks HMW. • Fungsi pendamping fosfatase
dan foldase dari AtPP5 terkait terutama dengan bentuk berat molekul rendah
(LMW), sedangkan bentuk HMW menunjukkan aktivitas pendamping holdase.
Ekspresi berlebih transgenik dari AtPP5 memberikan peningkatan ketahanan kejut
panas terhadap tipe liar A. thaliana dan mutan penyisipan T-DNA rusak dalam
termotoleransi yang didapat. Sebuah rekombinan fosfatase mutan (H290N)
menunjukkan peningkatan aktivitas pendamping holdase nyata. • Selain itu,
peningkatan termotoleransi diamati pada tanaman transgenik yang mengekspresikan
H290N, yang menunjukkan bahwa aktivitas pendamping holdase dari AtPP5
terutama bertanggung jawab untuk termotoleransi yang dimediasi AtPP5. • Secara
kolektif, hasil dari penelitian ini memberikan bukti pertama bahwa AtPP5 melakukan
beberapa aktivitas enzimatik yang dimediasi oleh perubahan konformasi yang
disebabkan oleh stres kejut panas.

asi enzim dapat menyebabkan inaktivasi enzim lengkap.

memanfaatkan sinar matahari sebagai sumber energi. Cahaya
merupakan faktor lingkungan penting yang mempengaruhi
pertumbuhan dan perkembangannya. Karena tanaman bersifat
sesil, mereka sering mengalami tekanan suhu tinggi, yang dapat
menyebabkan kerusakan permanen. Perubahan fluiditas dan
permeabilitas membran yang disebabkan oleh suhu tinggi dapat
berdampak negatif pada proses terkait membran (Sangwan et
al., 2002; Senthil-Kumar et al., 2007; Vigh et al., 2007). Fungsi
enzimatik juga dapat dirusak oleh heat-shock stress. Denaturasi yang komposisi lipid.tinggi
*Para penulis ini berkontribusi sama untuk pekerjaan ini.
Kerusakan membran dan protein menghasilkan generasi spesies
oksigen reaktif (ROS), yang terlibat dalam kematian sel
terprogram (Vacca et al., 2004; Meiri et al., 2010; Snider et al.,
2010). Efek yang dimediasi oleh suhu tinggi ini sangat signifikan
mengingat prediksi masa depan untuk pemanasan global.
Tanaman dipersenjatai dengan mekanisme fisiologis dan
biokimia yang canggih untuk mengatasi stres suhu tinggi.
Mekanisme ini termasuk penghindaran jangka pendek atau
aklimatisasi melalui modifikasi orientasi daun, dan perubahan
diinduksi suhu Juga telah terungkap bahwa metabolit
termoprotektif berkontribusi pada mekanisme aklimatisasi stres
panas (Wahid, 2007; Guy et al., 2008).

692 Phytologist Baru (2011) 191: 692–705 2011 Penulis

www.newphytologist.com Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru
Machine Translated by Google
Baru

3
12 ahli fitologi

Untuk bertahan hidup pada suhu yang berpotensi mematikan, tanaman

telah mengembangkan kedua termotoleransi basal, yang merupakan
kemampuan untuk bertahan hidup pada suhu tinggi, dan memperoleh

yang akan mematikan tanpa adanya aklimatisasi. Produksi heat

shock protein (HSPs) adalah aspek yang paling baik dicirikan dari
thermotolerance didapat (Hsu
dkk., 2010; Kobayashi dkk., 2010; Zhang et al., 2010).
HSP yang sangat terkonservasi telah ditemukan di semua organisme
hidup, dan beberapa di antaranya terkait dengan pendamping seluler
aktivitas, yang bertanggung jawab untuk mencegah denaturasi dan
agregasi protein target yang diinduksi stres panas.
Pendamping molekuler dapat didefinisikan secara luas sebagai protein
yang berinteraksi dengan keadaan non-asli protein lain.
Aktivitas ini penting untuk pelipatan polipeptida berukuran baru,
perakitan struktur multi-subunit,
pemeliharaan protein dalam keadaan tidak terlipat yang cocok untuk
lokasi trans melintasi membran, stabilisasi bentuk tidak aktif dari
protein yang diaktifkan oleh sinyal seluler, dan stabilisasi protein
yang menjadi terbuka selama stres seluler.
Pada tumbuhan, banyak fungsi seluler dikendalikan oleh
fosforilasi dan defosforilasi protein target.
Arabidopsis thaliana protein phosphatase 5 (AtPP5) adalah a
anggota keluarga protein fosfatase serin-treonin-spesifik, yang
didistribusikan secara luas dan sangat
dilestarikan di antara eukariota. Studi lokalisasi subseluler telah
menunjukkan bahwa PP5 hadir di kedua nukleus
dan sitoplasma (Chen et al., 1994; Ollendorff &
Donoghue, 1997; Russell dkk., 1999; Brown dkk., 2000;
Borthwick et al., 2001). Menariknya, PP5 menunjukkan aktivitas
fosfatase yang sangat rendah dibandingkan dengan protein lain
fosfatase, termasuk PP1 dan PP2A. Tidak seperti anggota keluarga
lainnya, AtPP5 berisi N-terminal tiga
domain pengulangan tetratricopeptide (TPR) menyatu ke terminal-C
domain katalitik fosfatase. Penghapusan proteolitik secara in vitro
dari domain TPR menghasilkan peningkatan yang nyata dalam catalytic
aktivitas, yang menunjukkan bahwa wilayah terminal-N melakukan
fungsi auto-inhibitor. Domain TPR terdiri dari
yang mengandung protein memiliki aktivitas pendamping intrinsik
yang memungkinkan mereka untuk secara selektif mengenali dan
mengikat protein non asli. Protein TPR ini termasuk Tom20, p23,
toleransi termo, yang mungkin mencerminkan mekanisme yang lebih umum untuk SGT1, 40-kDa immunophilin cyclosporin A (CsA)-
mempertahankan fluiditas membran dan aktivitas enzim di bawah
kondisi lingkungan yang berbeda. Misalnya, bahkan ketika
tumbuhan yang tumbuh di habitat alami dan mengalami
kisaran suhu normal, mereka dapat terkena major
fluktuasi diurnal dalam suhu dan suhu tinggi
protein pengikat (Cyp40), pengikatan FK506 52-kDa
protein (FKBP52), protein pengikat 51-kDa FK506

2007; Rosser dkk., 2007; Zabka et al., 2008).

Protein yang mengandung domain TPR dengan karakter terbaik
adalah mereka yang terlibat dalam pematangan protein kejutan panas
90 (Hsp90) kompleks, termasuk Hop, p23, SGT1,
Cyp40, FKBP52 dan FKBP51 (Scheufler dkk., 2000;
Taylor dkk., 2001; Sinars dkk., 2003; Wu et al., 2004).
PP5 juga membentuk kompleks dengan Hsp90 dan menunjukkan
sifat yang mirip dengan FKBP52 dan FKBP51 pada mamalia dan
sel tumbuhan (Silverstein et al., 1997; de la Fuente van Bentem
dkk., 2005; Emas et al., 2008). Dengan demikian, mungkin saja
PP5 mungkin berfungsi sebagai pendamping molekuler.
Penelitian 693

(FKBP51), dan ujung karboksil dari protein interacting Hsc70 (CHIP)

(Bose et al., 1996; Freeman et al.,
1996; Pirkl & Buchner, 2001; Yano dkk., 2004; Aviezer Hagai dkk.,

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa AtPP5 adalah multifungsi

protein yang bertindak baik sebagai protein fosfatase dan
pendamping, dengan aktivitas holdase dan foldase. Fungsi-fungsi ini
terkait erat dengan perubahan konformasi yang bergantung pada
sengatan panas. Setelah stres kejut panas, A. thaliana AtPP5
beralih dari struktur berbobot molekul rendah (LMW) ke
bentuk berat molekul tinggi (HMW), di mana
fungsi pendamping holdase meningkat secara signifikan dan
ketahanan kejut panas tercapai.

Bahan dan metode

Bahan:

Dehidrogenase malat mitokondria jantung babi

Pengulangan 34-asam amino, yang berpartisipasi dalam protein-protein
interaksi. Fungsi elemen ini tidak jelas; mungkin
menyediakan sarana untuk menargetkan PP5 ke daerah tertentu
dalam sel, atau dapat memfasilitasi interaksi dengan substrat.
Protein yang mengandung domain TPR terlibat dalam
(MDH), p-nitrofenilfosfat (pNPP), sitrat sintase
(CS) dan 4,4¢-dianilino-1,1¢-binaphthyl-5,5¢-disulfonic
acid (bis-ANS) dibeli dari Sigma. Molekuler
penanda berat untuk elektroforesis asli dan filtrasi gel,
ovalbumin, dan kolom kromatografi cair kinerja cepat (FPLC)
Superdex 200HR 10 30
diperoleh dari Amersham Biosciences (Uppsala, Swedia).
Berbagai enzim restriksi dibeli dari
Boehringer Mannheim (Mannheim, Jerman).
Isolasi bentuk oligomer tinggi dari stabil panas
protein dari suspensi sel A. thaliana

berbagai proses biologis, seperti regulasi siklus sel,
kontrol transkripsi, transpor protein mitokondria dan peroksisomal,
dan transduksi sinyal (Abe et al., 2000;
Gatto dkk., 2000; Kumar dkk., 2001). Baru-baru ini, telah
telah dilaporkan bahwa PP5 juga responsif terhadap kerusakan DNA
dalam sel HeLa (Ham et al., 2010; Kang et al., 2010). TPR
Arabidopsis thaliana L. Heynh, sel ekotipe Columbia adalah
tumbuh dalam suspensi. Sel dipanaskan pada suhu 50C selama
30 menit, dan kemudian ekstrak sitosol dibuat dengan sentrifugasi
ultra pada 134.600 g selama 15 menit (rotor TLS-55;
Beckman, Brea, California, AS). Supernatan adalah
dikenakan kromatografi eksklusi ukuran (SEC) menggunakan a

2011 Penulis Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705

Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru www.newphytologist.com
Machine Translated by Google
Baru

3
12
694 Penelitian

Superdex 200 HR 10 30 kolom. Kompleks HMW yang dielusi dari

volume kosong SEC dikumpulkan dan diidentifikasi dengan
elektroforesis gel poliakrilamida 2D (PAGE) dan teknik waktu terbang
ionisasi desorpsi laser yang dibantu matriks (MALDI TOF), seperti
yang dijelaskan sebelumnya (Hajheidari et al., 2007).

Kloning AtPP5 dan ekspresi protein rekombinan pada Escherichia

coli

Pengkodean urutan DNA AtPP5 diamplifikasi dengan PCR dari

perpustakaan cDNA A. thaliana. Primer AtPP5 forward (F)
mengandung situs BamHI dan kodon inisiasi.
Primer AtPP5 reverse (R) berisi situs SalI dan kodon stop. Primer
yang digunakan dalam percobaan ini tercantum dalam Tabel Informasi
Pendukung S1. Urutan DNA yang mengkode N- atau C-terminal
mutan AtPP5 yang terpotong diamplifikasi dari pGEX-AtPP5. Mutan
terpotong yang mengkode residu asam amino 1 hingga 114, 1 hingga
150, dan 110 hingga 484 diamplifikasi menggunakan primer berikut:
AtPP5 F dan 114 R; PadaPP5 F dan 150 R; dan AtPP5 110 F dan
AtPP5 R, masing-masing. Primer F mengandung situs BamHI dan
kodon inisiasi, dan primer R mengandung situs SalI dan kodon stop.
Semua produk PCR disubklon ke dalam vektor pGEM-T Easy
(Promega Co., Madison, WI, USA). Sisipan masing-masing dicerna
dengan BamHI dan SalI, dan kemudian diikat ke situs pGEX yang
sesuai untuk ekspresi rekombinan dalam E. coli. Kelebihan mangan
dihilangkan menggunakan kolom desalting PD-10 (GE Healthcare,
Piscataway, NJ, USA) dengan buffer A (50 mM kalium fosfat (pH 8,0)
dan 300 mM NaCl). Semua konstruksi diverifikasi oleh sekuensing
nukleotida.

Penentuan aktivitas fosfatase dan pendamping

Uji aktivitas protein fosfatase dilakukan menggunakan pNPP sebagai

substrat dengan ada dan tidak adanya asam arakidonat, seperti yang
dijelaskan sebelumnya (Ryu et al., 2005).
Konsentrasi akhir substrat dan PP5 masing-masing adalah 100 mM
dan 1 lg. Seperti dijelaskan sebelumnya (Jang et al., 2004), aktivitas
pendamping holdase diukur dengan menggabungkan MDH dengan
berbagai konsentrasi AtPP5 dalam 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
Analisis SEC, PAGE, dan imunoblot

SEC dilakukan pada 25C oleh FPLC menggunakan kolom Superdex

200 HR yang diseimbangkan dengan buffer 50 mM HEPES-KOH (pH
8,0) yang mengandung 100 mM NaCl. SDS-PAGE, PAGE asli dan

Mikroskop elektron dan pemrosesan gambar partikel tunggal

ahli fitologi

imunoblotting dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Moon

et al., 2005). Untuk Gambar 1(b), suspensi sel A. thaliana diperlakukan
pada 25, 45, 50 atau 55C selama 20 menit. Sel dikumpulkan dengan
penyaringan, dibekukan dengan nitrogen cair, dan kemudian digiling
dalam mortar. Sampel disuspensikan kembali dalam buffer ekstraksi
(50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM EDTA dan 1 mM PMSF) dan
disentrifugasi pada 12.000 g selama 20 menit pada suhu 4C.
Glutaraldehida ditambahkan ke fraksi supernatan (konsentrasi akhir
0,05%) dan sampel diinkubasi selama 10 menit pada 30C.

Reaksi ikatan silang dihentikan dengan penambahan buffer sampel.

Sampel diselesaikan menggunakan 13% SDS PAGE dan AtPP5
divisualisasikan dengan imunoblot dengan antibodi anti-AtPP5.

AtPP5 yang dimurnikan diencerkan 10 kali lipat dengan larutan yang

mengandung 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0). Untuk analisis
perubahan struktural yang bergantung pada panas dari AtPP5,
sampel diinkubasi dalam penangas air (55C) selama 30 menit
sebelum persiapan grid. Sampel protein yang diolah (5 ll) segera
diaplikasikan pada kisi berlapis karbon yang telah dikeluarkan dari
cahaya (Harrick Plasma, Ithaca, NY, USA) selama 3 menit di udara,
dan kemudian kisi-kisi diwarnai secara negatif menggunakan 1%
uranil asetat. Kisi-kisi ini diperiksa dalam mikroskop elektron transmisi
Technai G2 Spirit Twin yang dilengkapi dengan anti kontaminan (FEI,
Hillsboro, Oregon, USA) yang dioperasikan pada 120 kV. Gambar
direkam pada 1K · 1K CCD, model kamera multi-pindai 794 (Gatan,
Pleasanton, California, AS) pada perbesaran 45.000 (0,37 nm per
piksel).
Pemrosesan gambar partikel tunggal dilakukan dengan menggunakan
SPIDER, sebuah 'metode bebas referensi' (Frank et al., 1996).

Perubahan struktural AtPP5 setelah kejutan panas in vivo suspensi

sel Arabidopsis thaliana ditanam dalam labu Erlenmeyer yang

buffer. Reaksi kemudian diinkubasi pada 42C selama 15 menit dan
perubahan kekeruhan yang dihasilkan dari agregasi substrat dipantau
menggunakan spektrofotometer DU800 (Beckman, Fullerton, USA)
yang dilengkapi dengan dudukan sel termostatik. Aktivitas pendamping
foldase dianalisis menggunakan 6 M urea-denatured G6PDH sebagai
substrat, seperti yang dijelaskan sebelumnya (Hansen & Gafni, 1993).
Secara singkat, G6PDH yang terdenaturasi (10 lM) diencerkan 100
kali lipat dalam 100 mM buffer natrium fosfat (pH 7,2), dan aktivitas
pelipatan ulang AtPP5 dipantau dengan pengujian aktivitas G6PDH.
mengandung media JPL (Jouanneau dan Pead enoel). Sel dikultur di
bawah cahaya putih terus menerus (40-100 lE s)1 m)2 ) pada 22C
dengan pengocokan konstan (120 rpm). Untuk percobaan kejut
panas, kultur berumur 4 hari dipindahkan ke penangas air 42C
dengan pengadukan lembut dan kemudian sampel yang diberi
perlakuan panas diambil pada interval waktu yang teratur. Sel
dikumpulkan dengan penyaringan, dibekukan dengan nitrogen cair,
dan kemudian digiling dalam mortar. Sampel (0,1 g) disuspensikan
kembali dalam 100 ll buffer ekstraksi (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM
EDTA dan 1 mM PMSF) dan disentrifugasi pada 14.000 g selama 30
menit pada 4C. Fraksi supernatan diekstraksi dalam 100 ll 2·

Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705 2011 Penulis

www.newphytologist.com Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru
Machine Translated by Google
Baru

3
12 ahli fitologi

Gambar. 1 Oligomerisasi heat shock-dependent dari serin protein Arabidopsis thaliana treonin fosfatase 5 (AtPP5) in vivo. (a) Elektroforesis gel poliakrilamida asli

anti-AtPP5. ( B ) Suspensi sel Arabidopsis thaliana dirawat selama 20 menit pada suhu yang ditunjukkan. Glutaraldehida ditambahkan ke fraksi supernatan (konsentrasi
akhir 0,05%) dan sampel diinkubasi selama 10 menit pada 30C. Reaksi ikatan silang dihentikan dengan penambahan buffer sampel. Sampel dipisahkan dengan 13% SDS-
PAGE dan AtPP5 dideteksi dengan analisis imunoblot menggunakan antibodi anti-AtPP5.

Buffer sampel SDS dilengkapi dengan 4% CHAPS. Fraksi

supernatan yang dihasilkan diperiksa dengan analisis immuno blot
menggunakan antibodi anti-AtPP5.

Tes termotoleransi

Untuk uji termotoleransi yang diperoleh, bibit A. thaliana ditanam

dalam cawan petri (90 · 3 · 15 mm) pada 25 ml media nutrisi padat
(Larkindale et al., 2005) yang mengandung 2% (wÿ v) sukrosa.
Kondisi pertumbuhan sama seperti yang dijelaskan pada bagian
sebelumnya. Piring berisi bibit berumur 3 hari ditutup dengan selotip
plastik dan direndam dalam penangas air. Suhu inkubasi yang
berbeda ditunjukkan pada gambar. Selama pemulihan dari
perlakuan kejut panas, pelat dikeluarkan dari penangas air dan
dipertahankan di bawah kondisi pertumbuhan sebelumnya
menggunakan siklus terang : gelap yang sama.

Untuk uji termotoleransi basal, bibit ditanam dan diperlakukan

dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan dalam paragraf
sebelumnya, kecuali untuk kondisi perlakuan stres panas.
Pelat dipanaskan dalam penangas air pada suhu 55C selama 20 menit dan kemudian

didinginkan dengan cepat dengan kipas angin. Termotoleransi basal ditentukan

dengan menggunakan tingkat kelangsungan hidup.

Hasil
perubahan konformasi yang diinduksi panas (Gbr. 1). Sel tumbuhan
menjadi sasaran kejutan panas pada 42C untuk berbagai jangka
waktu dan status oligomer AtPP5 diselidiki dengan imunoblotting
dengan antibodi anti-AtPP5 yang bereaksi secara spesifik dengan
AtPP5 dari gel asli dan SDS-PAGE (Gbr. S1b). Pada gel PAGE
asli, sebagian besar AtPP5 yang tidak diobati diamati sebagai
monomer; namun, setelah 10 menit perlakuan panas, berat molekul
AtPP5 yang diamati berhubungan dengan bentuk trimeriknya (Gbr.
1a, panel atas).
Seiring waktu, AtPP5 terus membentuk kompleks HMW dan,
setelah 1 jam perlakuan panas, sebagian besar protein hadir dalam
kompleks > 150 kDa. Pada gel SDS-PAGE, AtPP5 bermigrasi pada
massa molekul yang diharapkan; yaitu, monomer AtPP5 (54 kDa)
(Gbr. 1a, panel bawah). Pergeseran struktural yang diinduksi panas
di AtPP5 dikonfirmasi lebih lanjut menggunakan ikatan silang
glutaraldehida, diikuti oleh SDS-PAGE dan imunoblotting dengan
antibodi anti-AtPP5 (Gbr. 1b).
Dalam kondisi normal (25C), AtPP5 ditemukan secara dominan
dalam bentuk monomer dan trimerik. Tidak ada perbedaan
signifikan dalam profil konfigurasi protein ini yang diamati antara
ekstrak sel yang ditumbuhkan dalam kondisi normal dan yang
diberi perlakuan panas hingga 40C (data tidak ditampilkan).
Namun, bentuk HMW dari AtPP5 terdeteksi dalam ekstrak protein
dari sel yang terpapar kondisi kejutan panas (yaitu 45, 50 atau 55C
selama 20 menit). Hal ini konsisten dengan fakta bahwa aktivitas
Penelitian 695

(PAGE) (panel atas) dan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) (panel bawah) digunakan untuk menyelesaikan suspensi sel A. thaliana sebelum
atau setelah kejutan panas pada 42C. Kejutan panas dilakukan untuk periode waktu yang ditunjukkan. AtPP5 dideteksi dengan analisis imunoblot menggunakan antibodi

pendamping holdase umumnya diukur pada 42C. Ada penurunan

bersamaan di AtPP5 monomer yang sebanding dengan peningkatan
Isolasi AtPP5 dan pengaruh perlakuan kejut panas pada status
bentuk HMW yang diamati pada suhu tinggi.
oligomernya

Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk mengisolasi dan

mengkarakterisasi protein yang memberikan thermotolerance pada
AtPP5 rekombinan menghasilkan bentuk oligomerisasi yang
tanaman melalui perubahan konformasi berikut stres heat-shock. berbeda
Suspensi kultur sel A. thaliana yang diberi perlakuan panas
diperiksa menggunakan analisis SEC dan MALDI-TOF. AtPP5 Dalam suspensi kultur sel A. thaliana yang diberi perlakuan panas,
adalah salah satu protein yang diidentifikasi dan dipilih untuk studi kemungkinan bentuk HMW dari AtPP5 diproduksi melalui perubahan
konformasi
lebih lanjut. Status oligomerisasi AtPP5 diperiksa untuk memastikan bahwa ketika bentuk homo-polimer
ia mengalami

2011 Penulis Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705

Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru www.newphytologist.com
Machine Translated by Google
Baru

3
12
696 Penelitian

terkena sengatan panas. Namun, kejutan panas dapat

menginduksi pembentukan kompleks protein besar yang
mengandung protein seluler tambahan, termasuk protein
terdenaturasi. Untuk menentukan apakah AtPP5 membentuk
homo-polimer atau tidak, AtPP5 rekombinan diekspresikan
dalam bakteri dan kemudian dimurnikan hingga mendekati
homogenitas (Gbr. S2). SEC digunakan untuk memisahkan
AtPP5 menjadi fraksi yang mengandung monomer, dimer,
oligomer dan kompleks HMW (Gbr. 2a). Status oligomerisasi
diperiksa menggunakan PAGE asli diikuti dengan pewarnaan
perak (Gbr. 2b, panel atas). Pada PAGE asli, AtPP5
rekombinan diamati pada antara 100 dan 700 kDa, sedangkan
pada SDS-PAGE, fraksi bergerak sebagai pita protein tunggal
dengan berat molekul 54 kDa (Gbr. 2b, panel bawah).
Mikroskop elektron transmisi digunakan untuk menganalisis
struktur oligomer pada fraksi puncak yang dipisahkan oleh
SEC (Gbr. 2c,d). Pewarnaan negatif diikuti oleh partikel tunggal
pemrosesan gambar menunjukkan adanya bentuk oligomerisasi
AtPP5 yang berbeda (Gbr. 2c). Penjajaran rotasi dan translasi
menunjukkan bahwa kompleks HMW berbentuk globular
(panah putih pada Gambar. 2c) yang diamati di FI dapat
diklasifikasikan menjadi enam kelompok berdasarkan data
nilai eigen vektor eigen (Gbr. 2c, panel bawah). Gambar yang
diproses untuk oligomer ini menunjukkan diameter rata-rata
mulai dari 36 hingga 75 nm (Gbr. 2c, panel atas). Panah hitam
pada Gambar. 2 (c) menunjukkan AtPP5 oligomer.
Dua struktur protein, bentuk linier dan cincin (panah putih
dan hitam, masing-masing), diperoleh dalam fraksi F-II.
Pemrosesan gambar partikel tunggal menentukan karakteristik
struktural molekul berbentuk cincin (Gbr. 2d, panel bawah).
Berbagai oligomer hadir dalam keadaan dimer hingga
heptamerik dan ukuran struktur keseluruhan dan rongga pusat
meningkat karena lebih banyak molekul bergabung dengan
kumpulan. Dalam keadaan heptamer, secara keseluruhan
ahli fitologi

Gambar 2 Analisis struktur oligomer protein serin Arabidopsis thaliana treonin fosfatase 5 (AtPP5) menggunakan teknik kromatografi, elektroforesis dan mikroskopis. (a)
Kromatografi eksklusi ukuran (SEC) dilakukan dengan menggunakan kolom Superdex 200 HR.
Fraksi volume kritis dibagi menjadi dua kelompok (FI dan F-II). (b) Setiap fraksi SEC dalam (a) dipisahkan dengan 10% elektroforesis gel poliakrilamida asli (PAGE) (gambar
atas) atau elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) (gambar bawah), diikuti dengan pewarnaan perak. Sampel dari beberapa percobaan terpisah
untuk fraksi 24 dikumpulkan untuk mendapatkan jumlah yang cukup. (c, d) Analisis mikroskopis elektron AtPP5. Fraksi FI dan F-II pada (a) dianalisis dengan pewarnaan
negatif dengan uranil asetat 1%. Panah hitam dan panah putih di (c) masing-masing menunjukkan oligomer kecil dan oligomer berbentuk bola. Panah putih dan hitam di (d)
menunjukkan oligomer linier dan berbentuk cincin di fraksi II, masing-masing. Jumlah partikel yang membentuk setiap kelas ditunjukkan di bagian bawah setiap panel.

Bilah skala 200 nm berlaku untuk bidang dan bilah skala 100 nm dan 20 nm berlaku untuk gambar rata-rata (gambar lebih rendah dari setiap bidang).

Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705 2011 Penulis

www.newphytologist.com Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru
Machine Translated by Google
Baru

3
12 ahli fitologi

struktur dan rongga sentral c. 16 dan 6 nm dalam diameter meter,

masing-masing. Diameter oligomer heptamer tampaknya mirip
dengan lebar oligomer linier (Gbr. 2d, kepala panah putih). Temuan
ini menunjukkan bahwa oligomer telinga lin memanjang dari oligomer
berbentuk cincin. Secara bersama-sama, hasil SEC (Gbr. 2a) dan
native-PAGE (Gbr. 2b) menunjukkan bahwa AtPP5 membentuk
oligomer dengan berbagai ukuran molekul, dan temuan ini
dikonfirmasi oleh analisis struktural, yang menunjukkan adanya
berbagai bentuk oligomer.

AtPP5 memiliki banyak fungsi, bertindak sebagai protein fosfatase

dan pendamping molekul

Kemampuan AtPP5 untuk berfungsi sebagai protein fosfatase

diperiksa menggunakan pNPP sebagai substrat. Seperti yang
diharapkan, aktivitas fosfatase AtPP5 secara signifikan lebih tinggi
daripada protein kontrol, glutathione S-transferase (GST)
(Gbr. S3a). Karakteristik enzimatik yang menarik dari homolog PP5
adalah bahwa protein ini diaktifkan oleh asam lemak rantai panjang
tak jenuh ganda atau asam arakidonat (Chen & Cohen, 1997;
Sinclair et al., 1999; Chinkers, 2001). Seperti yang diharapkan,
aktivitas AtPP5 dirangsang 2,5 hingga 3 kali lipat dengan
penambahan 100 lM asam arakidonat. Telah dilaporkan bahwa
pengikatan asam arakidonat ke domain TPR menyebabkan
perubahan konformasi pada protein PP5 dan mengaktifkan aktivitas
fosfatase secara in vitro. Namun, asam arachi donat mungkin bukan
merupakan aktivator fisiologis karena konsentrasinya yang rendah
secara in vivo (Ramsey & Chinkers, 2002).
Sebelumnya, kami melaporkan bahwa oligomerisasi protein cPrxI
menghasilkan peningkatan aktivitas pendamping holdase (Jang et
al., 2004), dan pembentukan kompleks HMW yang stabil terhadap
panas adalah fitur yang dilestarikan dengan baik dari pendamping
et al., 1996), pendamping molekuler yang diketahui mengikat
protein yang mengandung TPR seperti FKBP52, FKBP52 dan Cyp40
(Pratt & Toft, 1997). Protein yang mengandung TPR terkait Hsp
termasuk FKBP52, p23 (Bose et al., 1996), Cyp40 (Mok et al., 2006)
dan CHIP (Rosser et al., 2007), yang semuanya memiliki aktivitas
pendamping intrinsik yang memungkinkan pengenalan selektif dan
pengikatan protein non-asli.
Selain itu, PP5 menunjukkan sifat yang mirip dengan FKBP52 dan
FKBP51 pada mamalia (Yang et al., 2005; Golden et al., 2008), ragi
dan sel tumbuhan (de la Fuente van Bentem et al., 2005; Wandinger
et al., 2006 ). Untuk menentukan apakah AtPP5 memiliki aktivitas
pendamping atau tidak, kami memeriksa kemampuannya untuk
menghambat agregasi termal substrat, MDH (Gbr. 3a).
Reaksi dipantau dengan mengukur hamburan cahaya selama
agregasi substrat. MDH diinkubasi pada 42C dengan adanya
konsentrasi AtPP5 yang berbeda.
Agregasi termal substrat menurun dengan meningkatnya konsentrasi
AtPP5, dan agregasi dicegah sepenuhnya pada rasio molar 1: 3
MDH terhadap AtPP5. Aktivitas pendamping Holdase tidak terdeteksi
ketika GST bukannya AtPP5 ditambahkan dalam campuran reaksi
sebagai kontrol negatif.

Sebuah uji refolding dilakukan menggunakan dehidrogenase

glukosa-6-fosfat urea-denaturasi (G6PDH) untuk menentukan
apakah AtPP5 juga dapat bertindak sebagai pendamping foldase (Gbr. 3b).
Di bawah kondisi kontrol yang tidak diobati, refolding spontan terjadi
di c. 8% dari G6PDH, sedangkan efisiensi pelipatan meningkat
secara dramatis dengan adanya peningkatan konsentrasi AtPP5.
Refolding signifikan diamati dengan adanya bakteri pendamping
GroEL, yang digunakan sebagai kontrol positif (Tilly et al., 1981;
Hansen & Gafni, 1993; Li & Churchich, 1997; Kern et al., 2003).

Aktivitas pendamping foldase tidak terdeteksi ketika ovalbu min

holdase (Haslbeck et al., 1999) . PP5 berinteraksi dengan Hsp90 (Chen sebagai pengganti AtPP5 ditambahkan ke campuran reaksi sebagai a
Penelitian 697

Gbr. 3 Rekombinan Arabidopsis thaliana protein serin treonin fosfatase 5 (AtPP5) bertindak sebagai pendamping holdase dan pendamping foldase in vitro. (a)
Aktivitas pendamping Holdase dari AtPP5. Sampel yang mengandung 1,8 lM malate dehydrogenase (MDH) diinkubasi pada 42C selama 15 menit. Agregasi termal MDH
dengan adanya konsentrasi AtPP5 yang berbeda dipantau dengan mengukur kekeruhan pada 340 nm. Rasio molar AtPP5 terhadap MDH adalah 1 : 0,5, 1 : 1, 1 : 2 dan 1 :
3. Sebagai kontrol negatif, ditambahkan glutathione S-transferase (GST) sebagai pengganti AtPP5. Rasio molar GST terhadap MDH adalah 1 : 5. (b) Aktivitas pendamping
foldase dari AtPP5. Pelipatan ulang dimulai dengan mengencerkan G6PDH terdenaturasi (10 lM) dalam buffer renaturasi yang mengandung berbagai konsentrasi AtPP5: 1
lM, 3 lM, 5 lM atau tanpa AtPP5 (pelipatan spontan; kotak tertutup). Sebagai kontrol negatif dan positif, 30 lM ovalbumin dan 1 lM GroEL, masing-masing, ditambahkan
sebagai pengganti AtPP5.
Aktivitas G6PDH asli ditetapkan pada 100%.

2011 Penulis Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705

Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru www.newphytologist.com
Machine Translated by Google
Baru

3
12
698 Penelitian

kontrol negatif. Temuan ini menunjukkan bahwa AtPP5 per

membentuk beberapa fungsi enzimatik. Kemungkinan AtPP5
melindungi berbagai protein, karena hasil serupa juga diamati
ketika CS dan MDH digunakan masing-masing sebagai substrat
untuk aktivitas pendamping holdase dan foldase (Gbr. S3b, c).
Jadi, selain bertindak sebagai protein fosfatase, AtPP5 dapat
berfungsi sebagai pendamping holdase untuk mencegah
agregasi termal protein substrat, dan sebagai pendamping
lipatase untuk meningkatkan pelipatan protein setelah denaturasi
kimia.

Aktivitas enzimatik AtPP5 dikaitkan dengan keadaan

oligomer spesifik AtPP5 rekombinan dimurnikan hingga

mendekati homogenitas untuk mengeksplorasi hubungan antara

struktur dan fungsi oligomer dalam protein serbaguna ini. Mirip
dengan sHSP dan cPrxI, struktur protein yang dibentuk oleh
AtPP5 rekombinan berubah secara dramatis sebagai respons
terhadap kejutan panas. Dalam fraksi dinilai SEC-sepa,
kelimpahan AtPP5 hadir dalam kompleks protein HMW meningkat
dengan meningkatnya suhu inkubasi, dan penurunan bersamaan
dalam kompleks protein LMW diamati (Gbr. 4a). Pewarnaan
perak dari pemisahan PAGE asli menegaskan bahwa kejutan
panas memicu pergeseran konformasi ke kompleks HMW (Gbr.
4b). Sebagai
diharapkan, SDS-PAGE mengungkapkan pita protein tunggal
dengan berat molekul (MW) 54 kDa di semua fraksi (Gbr. 4b,
panel bawah). Hasil ini menunjukkan bahwa perlakuan kejut
panas menginduksi perakitan protein LMW AtPP5 menjadi
kompleks HMW. Perubahan konformasi ini diperiksa
menggunakan afinitas pengikatan antara bis-ANS dan AtPP5
(Gbr. 4c). Intensitas fluoresensi bis-ANS meningkat pada suhu
tinggi, yang menunjukkan bahwa suhu ini menyebabkan
peningkatan paparan patch hidrofobik di AtPP5.

Selain perubahan struktural, kejutan panas secara dramatis

meningkatkan aktivitas pendamping holdase AtPP5 (Gbr. 4d).
Pergeseran suhu inkubasi dari 25 ke 55C menyebabkan
peningkatan 3 kali lipat aktivitas pendamping holdase AtPP5.
Sebaliknya, aktivitas fosfatase dan foldase dari AtPP5 menurun
dengan cepat dengan meningkatnya suhu. Dibandingkan dengan
fraksi yang diberi perlakuan pada suhu 25C, fraksi yang diberi
perlakuan pada suhu 45 dan 55C menunjukkan aktivitas
fosfatase c. masing-masing 50 dan 30%. Aktivitas pendamping
foldase yang dapat diabaikan terdeteksi dalam fraksi yang
dirawat pada 55C. Mengingat bahwa LMW AtPP5 adalah bentuk
dominan yang diamati dengan perlakuan 25C dan bahwa
kompleks protein HMW paling melimpah pada perlakuan 45 dan
55C, ada kemungkinan bahwa fungsi AtPP5 yang berbeda
ahli fitologi

terkait erat dengan perubahan struktural yang diinduksi panas secara in vitro.

Gambar. 4 Fungsi yang berbeda dari serin protein Arabidopsis thaliana treonin fosfatase 5 (AtPP5) dikaitkan dengan status oligomernya. ( a ) AtPP5 yang
diekspresikan secara bakteri diinkubasi selama 20 menit pada suhu yang ditunjukkan. Protein diperlakukan dipisahkan dengan kromatografi eksklusi ukuran (SEC).
(b) Fraksi protein dari (a) dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida asli (PAGE) (gambar atas) atau elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida
(SDS-PAGE) (gambar bawah), diikuti dengan pewarnaan perak. (c) Perubahan yang bergantung pada kejutan panas dalam hidrofobisitas AtPP5 ditentukan menggunakan
pengikatan 4,4¢-dianilino-1,1¢-binaphthyl-5,5¢-disulfonic acid (bis-ANS). Sampel protein dipanaskan dengan 10 lM bis-ANS pada 25, 45 dan 55C. Intensitas fluoresensi bis-
ANS diukur. (d)
Aktivitas fosfatase (kotak putih), holdase chaperone (kotak abu-abu) dan foldase chaperone (kotak hitam) dari AtPP5 yang diberi perlakuan panas dibandingkan dengan
aktivitas AtPP5 yang diinkubasi pada 25C.

Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705 2011 Penulis

www.newphytologist.com Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru
Machine Translated by Google
Baru

3
12 ahli fitologi

AtPP5 memainkan peran penting dalam termotoleransi yang

didapat di A. thaliana

Untuk menyelidiki peran biologis yang dimainkan AtPP5 selama

stres kejut panas, kami mengisolasi dan mengkarakterisasi garis
mutan homozigot A. thaliana (SALK-021153) yang menggunakan
penyisipan T-DNA di wilayah yang tidak diterjemahkan (UTR) dari
AtPP5 (At2g42810). Mutan nol Atpp5 ini tidak mensintesis protein
AtPP5 (Gbr. S1). Uji termotoleransi dilakukan untuk menentukan
apakah AtPP5 diperlukan untuk kelangsungan hidup bibit di bawah
kondisi kejutan panas. Sebagai kontrol positif, kami menggunakan
mutan knock-out T-DNA dari A. thaliana HSP101, hot1, yang
diperlukan untuk termotoleransi basal dan didapat. Kurangnya
ekspresi HSP101 menyebabkan kerusakan akibat sengatan panas
yang signifikan, yang dapat diamati selama periode pemulihan
pendek dan panjang (Hong & Vierling, 2000, 2001; Queitsch et al.,
2000).
Bibit A. thaliana berumur tiga hari yang ditanam pada media agar
padat diinkubasi pada suhu 37C selama 60 menit, diperoleh
kembali selama 120 menit pada suhu 22C, dan kemudian
mengalami kejutan panas yang parah pada suhu 45C selama 160
menit (Gbr. 5b). Galur atpp5 dan hot1 lebih rentan terhadap
cekaman panas dibandingkan tanaman tipe liar (WT), meskipun
perlakuan aklimatisasi menyebabkan peningkatan toleransi. Garis
mutan Atpp5 dan hot1 benar-benar kehilangan termotoleransi yang
diperoleh di bawah kondisi eksperimental ini. Sebagian besar bibit
mutan menjadi memutih dan kemudian mati dalam waktu 5 hari.
Sebaliknya, sebagian besar tanaman WT dan mutan yang
periode percobaan. Secara bersama-sama, pengamatan ini
menunjukkan bahwa AtPP5 memainkan peran penting dalam
termotoleransi yang didapat.

Fungsi pendamping AtPP5 meningkatkan suhu

toleransi dalam A. thaliana

Berbagai konstruksi digunakan untuk memeriksa domain fungsional

yang bertanggung jawab atas aktivitas enzimatik AtPP5 (Gbr. 6a).
Mengikuti ekspresi protein rekombinan ini dalam E. coli (Gbr. 6b),
aktivitas enzimatik dari setiap mutan ditentukan (Gbr. 6c). Protein
mutan yang terdiri dari asam amino 1-114 dan 1-150 tidak memiliki
domain fosfatase fosfat dan menunjukkan c. 30% pengurangan
aktivitas pendamping holdase dibandingkan dengan protein WT.
Selain itu, aktivitas pendamping fosfatase dan foldase benar-benar
hilang. Temuan ini menunjukkan bahwa domain fosfatase
bertanggung jawab atas aktivitas pendamping fosfatase dan
foldase dari AtPP5. Ini juga menyiratkan bahwa keberadaan
domain ini diperlukan agar fungsi pendamping holdase dari AtPP5
menjadi aktif sepenuhnya. Penghapusan domain TPR (110–484)
meningkatkan aktivitas pendamping fosfatase dan holdase oleh c.
50% dan c. 20%, masing-masing, dibandingkan dengan protein
WT. Dengan demikian, domain fosfatase memainkan peran penting
dalam fungsi pendamping holdase AtPP5, dan domain TPR
melakukan peran penghambatan otomatis sehubungan dengan
aktivitas fosfatasenya. Temuan ini sesuai dengan fakta bahwa
domain fosfatase menunjukkan hidrofobisitas yang lebih tinggi
daripada domain TPR (data
dilengkapi dengan gen AtPP5 (data tidak ditampilkan) tetap hijau dan terus tumbuh sepanjang
Penelitian 699

Gbr. 5 Pengaruh mutasi Arabidopsis thaliana protein serin treonin fosfatase 5 (AtPP5) pada termotoleransi yang didapat. Tanaman Arabidopsis thaliana difoto 5 hari
setelah perlakuan kejut panas. Panel di bawah setiap bagian dari gambar menunjukkan kondisi eksperimental untuk setiap uji termotoleransi. Tanda panah menunjukkan
akhir dari imbibisi benih. (a) Kondisi pertumbuhan normal. (b) Kelangsungan hidup bibit Columbia (Col-0), Atpp5 dan hot1 berumur 3 hari, dirawat selama 160 menit dengan
kejutan panas pada suhu 45C, setelah periode aklimatisasi 37C selama 60 menit. Tanaman difoto 5 hari setelah perlakuan kejut panas.

2011 Penulis Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705

Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru www.newphytologist.com
Machine Translated by Google
Baru

3
12
700 Penelitian

(sebuah)

(b)

fosfatase yang sangat berkurang (Swingle et al., 2004; Hinds &

Sanchez, 2008). Mutan H290N dipamerkan c. 3 kali lipat aktivitas
pendamping holdase lebih tinggi dari WT, yang menunjukkan
bahwa aktivitas pendamping holdase meningkat dengan
penghapusan aktivitas fosfatase di AtPP5. Seperti yang diharapkan,
H290N tidak menunjukkan aktivitas fosfatase yang terdeteksi.

Untuk menyelidiki peran fisiologis yang dimainkan AtPP5 dalam

ketahanan terhadap sengatan panas, kami menghasilkan tanaman
Atpp5 transgenik yang mengekspresikan WT (Atpp5OEPP5) secara
(c)

Gambar 6 Analisis fungsional berbagai bentuk serin protein Arabidopsis thaliana treonin fosfatase 5 (AtPP5). (a) Representasi skematis yang menunjukkan versi
terpotong dari AtPP5 rekombinan. Nama mutan ditunjukkan di sebelah kiri. (b) Konstruksi yang digambarkan dalam (a) diekspresikan dalam Escherichia coli dan

dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida 13% (SDS PAGE) dan kemudian diwarnai dengan biru cemerlang Coomassie. M menunjukkan penanda

Atpp5OEH290N melalui garis ekspresi bertahan dari tekanan panas

yang mematikan. Meskipun galur-galur ini menunjukkan beberapa
keterlambatan pertumbuhan setelah kejutan panas, sebagian besar
bibit kembali ke hijau dan melanjutkan pertumbuhan setelah periode
pemulihan. Termotoleransi basal yang ditingkatkan juga diamati
pada galur A. thaliana transgenik lain yang diuji pada ekspresi
Atpp5OEPP5 atau Atpp5OEH290N. Lebih lanjut, jalur
Atpp5OEH290N membutuhkan waktu pemulihan yang sedikit
berkurang setelah tegangan kejut panas dibandingkan dengan jalur
Atpp5OEPP5 (data tidak ditampilkan), mungkin karena Atpp5 yang
rusak fosfatase lebih cocok untuk beralih dari LMW ke bentuk
ahli fitologi

dimurnikan dengan kromatografi afinitas. H290N merupakan mutan substitusi titik di mana residu-Nya digantikan oleh Asn. Protein AtPP5 yang dimurnikan dipisahkan

molekuler (jalur pertama). (c) Aktivitas fosfatase (kotak putih), holdase chaperone (kotak abu-abu) dan foldase chaperone (kotak hitam) dari berbagai konstruksi protein
dibandingkan dengan AtPP5 tipe liar, yang ditetapkan pada aktivitas 100%.

tidak ditampilkan). H290N mutan fosfatase disiapkan untuk

menyelidiki efek aktivitas fosfatase pada fungsi pendamping AtPP5.
H290N adalah mutan titik di mana 290-nya telah digantikan oleh
Asn, dan mutasi di wilayah katalitik AtPP5 ini menghasilkan aktivitas
Dalam uji termotoleransi basal, bibit berumur 7 hari diekspos
pada suhu 55C selama 20 menit dan kemudian dipulihkan pada
suhu 22C. Seperti terlihat pada Gambar. 7(a), Atpp5OEPP5 dan

berlebihan atau mutan H290N dari AtPP5 (Atpp5OEH290N).
Analisis imunoblot digunakan untuk memeriksa tingkat ekspresi
stres kejut panas (Gbr. 7b). Setelah cekaman panas pada 37C
AtPP5 di WT, Atpp5, dan dua garis ekspresi berlebih transgenik (Gbr. S1b).
Ketika tumbuh di bawah kondisi normal, tidak ada perbedaan
fenotipik yang jelas dapat dideteksi antara WT, Atpp5, Atpp5OEPP5,
Atpp5OEH290N, dan hot1 dalam hal waktu perkecambahan dan
laju pertumbuhan (Gbr. 7a dan data tidak ditampilkan).
Temuan ini menunjukkan bahwa AtPP5 mungkin tidak terlibat
dalam pertumbuhan dan perkembangan normal. Atpp5 memang
menampilkan fenotipe berbunga awal dalam kondisi hari panjang;
Namun, fenotipe ini akan dijelaskan dalam makalah lain.
HMW. Untuk mengkonfirmasi fungsi AtPP5 dalam motolerance,
tanaman ditanam di tanah selama 24 hari dan kemudian mengalami
selama 5 hari, tanaman dikembalikan ke kondisi pertumbuhan
optimal (22C) selama 5 hari. Seperti yang diharapkan, kerusakan
parah diamati pada tanaman WT dan Atpp5, dan sebagian besar
bibit mati setelah perlakuan panas. Sebaliknya, garis Atpp5OEPP5
dan Atpp5OEH290N menunjukkan motorlerance yang lebih tinggi
daripada WT, dengan sebagian besar bibit bertahan, terlepas dari
ada atau tidak adanya aktivitas fosfatase (Gbr. 7b). Tidak ada
perbedaan fisiologis jelas lainnya yang diamati di antara tanaman yang diuji. Hasil ini

Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705 2011 Penulis

www.newphytologist.com Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru
Machine Translated by Google
Baru

3
12 ahli fitologi

Gbr. 7 Respon stres panas Arabidopsis thaliana wild type (WT), Atpp5, hot1, AtPP5OEPP5 dan AtPP5OEH290N (AtPP5, Arabidopsis thaliana protein serine threonine
Penelitian 701

phosphatase 5). Panel bawah di setiap bagian gambar menunjukkan kondisi eksperimental yang digunakan untuk setiap uji termotoleransi. Panah menunjukkan akhir dari
imbibisi benih. (a) Perbandingan thermotolerance basal di WT dan tanaman transgenik. Kiri: kondisi pertumbuhan normal. Kanan: kelangsungan hidup bibit berumur 7 hari
yang diberi perlakuan kejut panas selama 20 menit pada suhu 55C. Tanaman difoto 9 hari setelah perlakuan kejut panas. (b) Tanaman yang tumbuh di tanah mengalami
kejutan panas. Kiri: kondisi pertumbuhan normal. Kanan: kelangsungan hidup tanaman berumur 2 minggu yang diberi perlakuan kejut panas selama 5 hari pada suhu 37C.
Tanaman difoto 5 hari setelah perlakuan kejut panas. hot1, mutan penyisipan T-DNA dari AtHSP101.

sementara domain fosfatase aktif tidak diperlukan untuk

thermotolerance, fungsi pendamping holdase AtPP5 sangat penting
untuk ketahanan stres panas di A. thaliana.
protein yang membentuk kompleks HMW sebagai respons terhadap kejutan panas
perlakuan.

Identifikasi AtPP5 sebagai protein tahan panas yang membentuk

kompleks HMW dikonfirmasi oleh berbagai analisis biokimia
(Gambar 1, 2, 4). Pembentukan kompleks HMW AtPP5 diverifikasi
Diskusi
dengan analisis imunoblot menggunakan antibodi spesifik AtPP5
Karena tumbuhan adalah organisme sessile, toleransi panas dan (Gambar 1, 2, 4). Analisis SEC dan EM dari protein AtPP5
adaptasi yang cepat terhadap fluktuasi suhu harian cenderung rekombinan yang sangat murni juga menunjukkan pembentukan
menjadi sangat penting untuk kelangsungan hidup mereka kompleks HMW secara in vitro (Gbr. 2). Selain itu, aktivitas
(Queitsch et al., 2000). Semua organisme hidup menggunakan pendamping holdase dari AtPP5 terbukti memainkan peran penting
pendamping molekuler dan mereka memainkan peran penting dalam respon ketahanan kejut panas dari A. thaliana (Gambar 5, 7).
dalam respon kejutan panas; namun, mekanisme bagaimana
pendamping memberikan ketahanan panas pada tumbuhan tingkat Fungsi yang berbeda dari AtPP5 terkait dengan status homo-
tinggi masih kurang dipahami (Katiyar-Agarwal et al., 2003). Jadi, oligomer berukuran diskrit yang terjadi selama sakelar yang
tujuan pertama dari penelitian ini adalah untuk menyaring suspensi sel A.diinduksi
thalianakejutan panas dari kompleks LMW ke HMW
untuk pro

2011 Penulis Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705

Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru www.newphytologist.com
Machine Translated by Google
Baru

3
12
702 Penelitian

(Gbr. 4). Hasil penelitian ini dapat diringkas dalam model yang
komprehensif (Gbr. 8) yang menunjukkan bagaimana AtPP5
dapat berfungsi sebagai fosfatase dan pendamping molekul
selama kondisi stres panas. Dalam kondisi normal, AtPP5 dapat
mengatur keadaan fosforilasi substrat tertentu. Namun, dalam
menanggapi stres panas, AtPP5 berfungsi sebagai pendamping
holdase dengan membentuk kompleks HMW.
Fungsi pendamping foldase dari AtPP5 kemudian memfasilitasi
regenerasi molekul aktif secara fungsional selama periode stres
pasca-panas.
Di masa lalu, AtPP5 belum dipelajari secara ekstensif karena
menunjukkan aktivitas fosfatase yang rendah dibandingkan
dengan protein fosfatase lainnya. Meskipun penghapusan
domain TPR meningkatkan aktivitas fosfatase AtPP5 (Gbr. 6c),
tingkat aktivitas yang rendah ini membuat sulit untuk memperjelas
peran fisiologis yang dimainkan oleh AtPP5 pada tumbuhan
tingkat tinggi. AtPP5 (juga disebut PAPP5) telah terbukti
mendefosforilasi Pfr-fitokrom A (PhyA) yang aktif secara biologis
dan meningkatkan respons foto yang dimediasi fitokrom (Ryu et
al., 2005). Molekul fitokrom merasakan informasi cahaya dalam
warna merah dan merah jauh. Defosforilasi PhyA yang dimediasi
AtPP5 meningkatkan stabilitas PhyA dan afinitasnya untuk
transduser sinyal hilir NDPK2.
Hasil ini menunjukkan bahwa AtPP5 berfungsi sebagai regulator
biokimia untuk mengendalikan stabilitas fitokrom. Namun, ketika
temuan di atas dipertimbangkan dalam konteks penelitian ini,
adalah mungkin untuk berhipotesis bahwa fungsi utama AtPP5
berperan dalam stabilitas PhyA, yang menghasilkan peningkatan
afinitas untuk transduser hilir. Pada akhirnya, penelitian ini
menunjukkan bahwa AtPP5 dapat melakukan fungsi spesifik
yang tidak diamati di banyak anggota lain

Protein
Protein

Protein
Sinyal
Tidak ada kegiatan

Lipat

Protein
keluarga protein fosfatase ini; yaitu, dapat menstabilkan
komponen host yang secara fungsional penting.
AtPP5 menunjukkan sifat struktural yang mirip dengan sHSP,
2-Cys peroxiredoxins (Prxs) dan AtTDX, yang mengubah
konformasinya dari kompleks LMW menjadi HMW sebagai
respons terhadap kejutan panas (MacRae, 2000; Jang et al.,
2004; Lee et al., 2009). Beberapa protein yang mengandung
domain TPR, seperti FKBP52, FKBP51, p23, SGT1 dan CHIP,
telah terbukti memiliki aktivitas pendamping intrinsik yang
memungkinkan pengikatan selektif ke protein non-asli (Bose et

kemungkinan bahwa mangan dapat menghambat perlindungan

substrat yang dimediasi AtPP5 dan bahwa masalah sebelumnya
yang mengidentifikasi aktivitas pendamping AtPP5 mungkin
telah terjadi sebagai konsekuensi dari konsentrasi residu
mangan yang tinggi setelah sintesis protein rekombinan.
Selama fase pemulihan, toleransi yang lebih besar terhadap
kejutan panas diamati pada tanaman A. thaliana transgenik
yang mengekspresikan AtPP5 daripada di WT atau Atpp5 (Gbr.
ahli fitologi

al., 1996; Freeman et al., 1996; Pirkl & Buchner, 2001; Aviezer
Hagai dkk., 2007; Rosser dkk., 2007; Zabka dkk., 2008).
Mengingat kesamaan yang jelas antara protein ini dan PP5,
banyak peneliti berhipotesis bahwa PP5 mungkin berfungsi
sebagai pendamping. Namun, aktivitas ini tidak ditemukan
dalam sistem uji in vitro standar (Wandinger et al., 2006). Ada

7). Peningkatan resistensi kejutan panas ini mungkin disebabkan

oleh pembentukan kompleks protein stabil yang diinduksi stres
panas antara AtPP5 dan protein seluler yang terdenaturasi
sebagian, dan pelipatan kembali komponen-komponen ini
selama periode pemulihan. Situasi serupa telah diamati dengan
ragi HSP104, yang meningkatkan kelangsungan hidup sel pada
suhu tinggi dengan memediasi resolubilisasi dari inaktivasi panas, tidak larut.

Bulan

Gbr. 8 Model komprehensif untuk perpindahan

ATP & struktural dan fungsional yang diinduksi panas dalam
kinase serin protein Arabidopsis thaliana treonin fosfatase 5
ADP &
kinase (AtPP5).
Protein
Dalam kondisi normal, AtPP5 ada terutama
Protein sebagai spesies protein dengan berat molekul
asli
rendah (LMW) dan berfungsi sebagai pendamping
fosfatase dan foldase.
Kejutan panas
Namun, ketika tanaman terkena stres panas, AtPP5
Protein
terdenaturasi berubah menjadi kompleks dengan berat molekul
tinggi (HMW) dan mengubah fungsinya dari
pendamping fosfatase dan foldase menjadi
pendamping holdase.

Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705 2011 Penulis

www.newphytologist.com Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru
Machine Translated by Google
Baru

3
12 ahli fitologi

agregat protein (Parsell et al., 1994). Untuk menentukan apakah

aktivitas pendamping umum untuk protein PP5 dari organisme
lain, kami memeriksa ScPPT1, log homo ragi dari AtPP5.
Namun, ScPPT1 tidak menghambat agregasi termal dari model
substrat protein MDH (data tidak ditampilkan) dan, dengan
demikian, mungkin tidak terlibat dalam fungsi pendamping dalam
ragi. Dari perspektif evolusi, temuan ini jelas menunjukkan
perbedaan kualitatif antara respon cekaman panas pada
tanaman dan organisme lain (Waters, 2003).

Sebagai kesimpulan, penelitian ini mengungkapkan fungsi

baru untuk protein A. thaliana serineÿthreonine phosphatase
AtPP5 dan menegaskan bahwa ia melakukan banyak peran
fisiologis yang berbeda. Karena fungsi pendamping AtPP5
ditingkatkan oleh kejutan panas, kemungkinan protein ini
memainkan peran tambahan selama masa stres seluler. Dapat
diusulkan bahwa fungsi pendamping AtPP5 digunakan untuk
melindungi makromolekul seluler penting dari denaturasi selama
kejutan panas dan bahwa aktivitas ini memfasilitasi respons
tanaman terhadap kondisi stres. Selain meningkatkan
pemahaman kita tentang peran yang dimainkan oleh protein
multifungsi ini, penyelidikan lebih lanjut dari AtPP5 pada akhirnya

Ucapan Terima Kasih

Karya ini didukung oleh RDA untuk Next-Generation BioGreen

Program (SSAC, No. 2011) dan Program Penelitian Kerjasama
untuk Pengembangan Sains & Teknologi Pertanian (Project No.
PJ007850), dan oleh MOEST untuk program WCU (R32-10148 ).
Beasiswa yang diterima oleh dua penulis pertama didukung oleh
Program BK21, Korea. MGK didukung oleh Akademi Nasional
Ilmu Pertanian dan RDA (hibah No. PJ006654).

Referensi
mutan negatif dominan. Jurnal Kimia Biologi 271:
32315–32320.
Chen MX, Cohen PT. 1997. Aktivasi protein fosfatase 5 oleh

tpr. FEBS Surat 400: 136-140.

Chen MX, McPartlin AE, Brown L, Chen YH, Barker HM, Cohen PT.

Endokrinologi dan Metabolisme 12: 28-32.

Frank J, Radermacher M, Penczek P, Zhu J, Li Y, Ladjadj M, Leith A.
1996. Laba-laba dan web: pemrosesan dan visualisasi gambar dalam
mikroskop elektron 3d dan bidang terkait. Jurnal Biologi Struktural 116: 190–199.

Freeman BC, Toft DO, Morimoto RI. 1996. Mesin pendamping molekuler:
aktivitas pendamping cyclophilin Cyp-40 dan protein p23 terkait
aporeceptor steroid. Sains 274: 1718– 1720.

de la Fuente van Bentem S, Vossen JH, de Vries KJ, van Wees S,

Tameling WI, Dekker HL, de Koster CG, Haring MA, Takken FL, Cornelissen
BJ. 2005. Heat shock protein 90 dan co-chaperone protein phosphatase 5
berinteraksi dengan daerah berbeda dari protein ketahanan penyakit tomat
I-2. Jurnal Tanaman 43: 284–298.
Gatto GJ Jr, Geisbrecht BV, Gould SJ, Berg JM. 2000. Pengenalan sinyal-1
penargetan peroksisomal oleh domain TPR dari PEX5 manusia.
Biologi Struktur Alam 7: 1091–1095.
mungkin menunjukkan bahwa ia melakukan lebih banyak fungsi biologis yang belum ditemukan.

Abe Y, Shodai T, Muto T, Mihara K, Torii H, Nishikawa S, Endo T, Kohda D.

2000. Dasar struktural pengenalan urutan oleh reseptor impor protein
mitokondria tom20. Sel 100: 551–560.
Aviezer-Hagai K, Skovorodnikova J, Galigniana M, Farchi-Pisanty O, Maayan
E, Bocovza S, Efrat Y, von Koskull-Doring P, Ohad N, Breiman A. 2007.
Arabidopsis immunophilins ROF1 (AtFKBP62) dan ROF2 (AtfFKBP65)
menunjukkan spesifisitas jaringan, diinduksi stres panas, dan mengikat HSP90.
Penelitian 703

proteolisis terbatas atau pengikatan asam lemak tak jenuh ganda ke domain

1994. Sebuah protein manusia baru serinÿ treonin fosfatase, yang memiliki
empat motif berulang tetratrikopeptida dan terlokalisasi pada nukleus.
Jurnal EMBO 13: 4278–4290.
Chinkers M. 2001. Protein fosfatase 5 dalam transduksi sinyal. Tren dalam

Emas T, Ayunan M, Honkanen RE. 2008. Peran serinÿ treonin protein fosfatase
tipe 5 (PP5) dalam regulasi jaringan pensinyalan yang diinduksi stres dan kanker.
Ulasan Kanker dan Metastasis 27: 169–178.

Guy C, Kaplan F, Kopka J, Selbig J, Hincha DK. 2008. Metabolomik tegangan

suhu. Physiologia Plantarum 132: 220–235.
Hajheidari M, Eivazi A, Buchanan BB, Wong JH, Majidi I, Salekdeh
GH. 2007. Proteomik mengungkap peran redoks dalam toleransi kekeringan
pada gandum. Jurnal Penelitian Proteome 6: 1451–1460.
Ham BM, Jayachandran H, Yang F, Jaitly N, Polpitiya AD, Monroe ME, Wang L,
Zhao R, Purvine SO, Livesay EA et al. 2010. Novel ser thr protein phosphatase
5 (pp5) mengatur target selama kerusakan DNA yang diidentifikasi dengan
analisis proteomik. Jurnal Penelitian Proteome 9: 945–953.

Hansen JE, Gafni A. 1993. Perpindahan termal antara reaktivasi yang

ditingkatkan dan dihentikan dari dehidrogenase glukosa-6-fosfat bakteri
dibantu oleh GroEL tanpa adanya ATP. Jurnal Kimia Biologi 268: 21632–21636.

Haslbeck M, Walke S, Stromer T, Ehrnsperger M, White HE, Chen S, Saibil HR,

Biologi Molekuler Tumbuhan 63: 237–255.
Borthwick EB, Zeke T, Prescott AR, Cohen PT. 2001. Nuklir
lokalisasi protein fosfatase 5 tergantung pada daerah terminal karboksi.
Surat FEBS 491: 279–284.
Bose S, Weikl T, Bugl H, Buchner J. 1996. Fungsi pendamping protein
terkait Hsp90. Sains 274: 1715–1717.
Brown L, Borthwick EB, Cohen PT. 2000. Protein Drosophila
fosfatase 5 dikodekan oleh gen tunggal yang paling banyak diekspresikan
selama perkembangan embrionik. Biochimica et Biophysica Acta 1492: 470–
476.
Buchner J. 1999. Hsp26: pendamping yang diatur suhu. Jurnal EMBO 18:
6744–6751.
Hinds TD Jr, Sanchez ER. 2008. Protein fosfatase 5. Jurnal Internasional
Biokimia dan Biologi Sel 40: 2358–2362.
Hong SW, Vierling E. 2000. Mutan Arabidopsis thaliana cacat dalam akuisisi
toleransi terhadap stres suhu tinggi. Prosiding National Academy of Sciences,
AS 97: 4392–4397.
Hong SW, Vierling E. 2001. Hsp101 diperlukan untuk toleransi panas tetapi
dapat dibuang untuk pengembangan dan perkecambahan tanpa adanya stres.
Jurnal Tanaman 27: 25–35.
Hsu SF, Lai HC, Jin TL. 2010. Faktor kejutan panas terlokalisasi di sitosol
protein pengikat, athsbp, berfungsi sebagai pengatur negatif respon kejutan
panas dengan translokasi ke nukleus dan diperlukan untuk pengembangan
benih di arabidopsis. Fisiologi Tumbuhan 153: 773–784.
Jang HH, Lee KO, Chi YH, Jung BG, Park SK, Park JH, Lee JR, Lee SS, Moon JC,

Chen MS, Silverstein AM, Pratt WB, Chinkers M. 1996. The
domain berulang tetratricopeptide protein fosfatase 5 memediasi
pengikatan heterokompleks reseptor glukokortikoid dan bertindak sebagai
Yun JW dkk. 2004. Dua enzim dalam satu; dua ragi peroksiredoksin menunjukkan
peralihan yang bergantung pada stres oksidatif dari peroksidase ke fungsi
pendamping molekuler. Sel 117: 625–635.

2011 Penulis Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705

Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru www.newphytologist.com
Machine Translated by Google
Baru

3
12
704 Penelitian

Kang Y, Cheong HM, Lee JH, Song PI, Lee KH, Kim SY, Jun JY, You HJ.
2011. Protein fosfatase 5 diperlukan untuk perbaikan DNA yang dimediasi atr.
Komunikasi Riset Biokimia dan Biofisika 404: 476–481.
Katiyar-Agarwal S, Agarwal M, Grover A. 2003. Beras basmati tahan panas
yang direkayasa dengan ekspresi berlebihan hsp101. Biologi Molekuler
Tumbuhan 51: 677–686.
Kern R, Malki A, Holmgren A, Richarme G. 2003. Sifat pendamping Echerichia coli
thioredoxin dan thioredoxin reduktase. Jurnal Biokimia 371: 965–972.

Kobayashi M, Katoh H, Takayanagi T, Suzuki S. 2010. Karakterisasi gen terkait

thermotolerance di selentingan (Vitis vinifera). Jurnal Fisiologi Tumbuhan 167:
812–819.
Kumar A, Roach C, Hirsh IS, Turley S, deWalque S, Michels PA, Hol WG. 2001.
Konformasi diperpanjang tak terduga untuk motif TPR ketiga dari PEX5
peroksin dari Trypanosoma brucei. Jurnal Biologi Molekuler 307: 271–282.

Larkindale J, Hall JD, Knight MR, Vierling E. 2005. Fenotipe stres panas
mutan arabidopsis melibatkan beberapa jalur pensinyalan dalam
perolehan thermotolerance. Fisiologi Tumbuhan 138: 882–897.

Lee JR, Lee SS, Jang HH, Lee YM, Park JH, Park SC, Moon JC, Park SK, Kim
SY, Lee SY dkk. 2009. Status oligomer yang bergantung pada kejutan panas
mengubah fungsi protein seperti thioredoxin spesifik tanaman, AtTDX.
Prosiding National Academy of Sciences, AS 106: 5978–5983.

Li W, Churchich JE. 1997. Aktivasi sebagian terlipat malat dehidrogenase

mitokondria oleh thioredoxin. Jurnal Biokimia Eropa 246: 127-132.

MacRae TH. 2000. Struktur dan fungsi kejutan panas kecil alpha
protein crystallin: konsep mapan dan ide-ide yang muncul. Ilmu Kehidupan
Seluler dan Molekuler 57: 899–913.
Meiri D, Tazat K, Cohen-Peer R, Farchi-Pisanty O, Aviezer-Haggai K,
Avni A, Breiman A. 2010. Keterlibatan arabidopsis ROF2 (FKBP65) dalam
termotoleransi. Biologi Molekuler Tumbuhan 72: 191–203.
Mok D, Allan RK, Carrello A, Wangoo K, Walkinshaw MD, Ratajczak T. 2006.
Fungsi pendamping cyclophilin 40 memetakan ke celah antara prolyl isomerase
dan domain berulang tetratricopeptide.
Surat FEBS 580: 2761-2768.
Moon JC, Hah YS, Kim WY, Jung BG, Jang HH, Lee JR, Kim SY, Lee YM, Jeon
MG, Kim CW dkk. 2005. Peralihan struktural dan fungsional yang bergantung
pada stres oksidatif dari isotipe II peroksiredoksin 2-Cys manusia yang
meningkatkan ketahanan sel HeLa terhadap kematian sel yang diinduksi
H2O2. Jurnal Kimia Biologi 280: 28775-28784.
Ollendorff V, Donoghue DJ. 1997. Serinÿ treonin fosfatase PP5 berinteraksi
dengan CDC6 dan CDC27, dua pengulangan tetratrikopeptida yang
mengandung subunit kompleks pemicu anafase. Jurnal Kimia Biologi 272:
32011–32018.
Parsell DA, Kowal AS, Penyanyi MA, Lindquist S. 1994. Protein
disagregasi yang dimediasi oleh protein kejutan panas hsp104. Alam 372:
475–478.
Pirkl F, Buchner J. 2001. Analisis fungsional dari Hsp90 terkait manusia
peptidil prolyl cis trans isomerase FKBP51, FKBP52 dan Cyp40. Jurnal
Russell LC, Whitt SR, Chen MS, Chinkers M. 1999. Identifikasi

Ryu JS, Kim JI, Kunkel T, Kim BC, Cho DS, Hong SH, Kim SH,
ahli fitologi

residu yang dilestarikan yang diperlukan untuk pengikatan domain pengulangan

tetratrikopeptida ke protein kejut panas 90. Jurnal Kimia Biologi 274: 200660–
20063.

Fernandez AP, Kim Y, Alonso JM dkk. 2005. Phytochrome-specific type 5

phosphatase mengontrol fluks sinyal cahaya dengan meningkatkan stabilitas
dan afinitas fitokrom untuk transduser sinyal. Sel 120: 395–406.
Sangwan V, Orvar BL, Beyerly J, Hirt H, Dhindsa RS. 2002. Perubahan yang
berlawanan dalam fluiditas membran meniru aktivasi stres dingin dan panas
dari jalur MAP kinase tanaman yang berbeda. Jurnal Tanaman 31: 629–638.
Scheufler C, Brinker A, Bourenkov G, Pegoraro S, Moroder L, Bartunik H, Hartl
FU, Moarefi I. 2000. Struktur kompleks domain-peptida TPR: elemen penting
dalam perakitan mesin multichaperone Hsp70-Hsp90. Sel 101: 199–210.

Senthil-Kumar M, Kumar G, Srikanthbabu V, Udayakumar M. 2007.

Penilaian variabilitas dalam thermotolerance diperoleh: pilihan potensial untuk
mempelajari respon genotipik dan relevansi gen stres. Jurnal Fisiologi Tumbuhan
164: 111–125.
Silverstein AM, Galigniana MD, Chen MS, Owens-Grillo JK, Chinkers M, Pratt
WB. 1997. Protein fosfatase 5 adalah komponen utama kompleks reseptor
glukokortikoid.hsp90 dengan sifat imunofilin pengikat FK506. Jurnal Kimia
Biologi 272: 16224-16230.

Sinars CR, Cheung-Flynn J, Rimerman RA, Scammell JG, Smith DF,

Clardy J. 2003. Struktur protein pengikat FK506 besar FKBP51, protein pengikat
hsp90 dan komponen kompleks reseptor steroid. Prosiding National Academy
of Sciences, AS 100: 868–873.

Sinclair C, Borchers C, Parker C, Tomer K, Charbonneau H, Rossie S.

1999. Domain berulang tetratricopeptida dan daerah terminal-c mengontrol
aktivitas protein fosfatase ser 5. Jurnal Kimia Biologi 274: 23666-23672.

Snider JL, Oosterhuis DM, Kawakami EM. 2010. Perbedaan genotip dalam
termotoleransi bergantung pada kapasitas prategang untuk perlindungan
antioksidan dari aparatus fotosintesis di Gossypium hirsutum. Physiologia
Plantarum 138: 268–277.
Swingle MR, Honkanen RE, Ciszak EM. 2004. Dasar struktural untuk aktivitas
katalitik serinÿ treonin protein fosfatase-5 manusia.
Jurnal Kimia Biologi 279: 33992-33999.
Taylor P, Dornan J, Carrello A, Minchin RF, Ratajczak T, Walkinshaw MD. 2001.
Dua struktur cyclophilin 40: folding dan fidelity dalam domain TPR. Struktur 9:
431–438.
Tilly K, Murialdo H, Georgopoulos C. 1981. Identifikasi gen groE Escherichia coli
kedua yang produknya diperlukan untuk morfogenesis bakteriofag. Prosiding
National Academy of Sciences, AS 78: 1629–1633.

Vacca RA, de Pinto MC, Valenti D, Passarella S, Marra E, De Gara L.

Biologi Molekuler 308: 795–806.
Pratt WB, Toft DO. 1997. Interaksi reseptor steroid dengan protein heat shock
dan pendamping imunophilin. Ulasan Endokrin 18: 306–360.
Queitsch C, Hong SW, Vierling E, Lindquist S. 2000. Heat shock protein 101
memainkan peran penting dalam thermotolerance di arabidopsis. Sel Tumbuhan
12: 479–492.
Ramsey AJ, Chinkers M. 2002. Identifikasi aktivator fisiologis potensial protein
fosfatase 5. Biokimia 41: 5625-5632.
Rosser MF, Washburn E, Muchowski PJ, Patterson C, Cyr DM. 2007.
Fungsi pendamping dari chip ligase ubiquitin e3. Jurnal Kimia Biologi 282: 22267–
22277.
2004. Produksi spesies oksigen reaktif, perubahan sitosolik askorbat
peroksidase, dan gangguan metabolisme mitokondria adalah peristiwa awal
dalam kematian sel terprogram yang diinduksi oleh sengatan panas dalam sel
2 kuning cerah tembakau. Fisiologi Tumbuhan 134: 1100-1112.
Vigh L, Horvath I, Maresca B, Harwood JL. 2007. Dapatkah respons protein stres
dikendalikan dengan 'terapi membran-lipid'? Tren Ilmu Biokimia 32: 357–363.
Wahid A. 2007. Implikasi fisiologis biosintesis metabolit untuk asimilasi bersih dan
toleransi cekaman panas kecambah tebu (Saccharum officinarum). Jurnal
Penelitian Tanaman 120: 219-228.
Pengembara SK, Suhre MH, Wegele H, Buchner J. 2006. The
phosphatase Ppt1 adalah regulator khusus pendamping molekul Hsp90.
Jurnal EMBO 25: 367–376.
Perairan ER. 2003. Adaptasi molekuler dan asal usul tumbuhan darat.
Filogenetik dan Evolusi Molekuler 29: 456–463.

Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705 2011 Penulis

www.newphytologist.com Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru
Machine Translated by Google
Baru

3
12 ahli fitologi

Wu B, Li P, Liu Y, Lou Z, Ding Y, Shu C, Ye S, Bartlam M, Shen B, Rao Z. 2004.

Struktur 3d protein pengikat FK506 manusia 52: implikasi untuk perakitan
reseptor glukokortikoid hsp90 heterokompleks imunofilin. Prosiding National
Academy of Sciences, AS 101: 8348–8353.

Yang J, Roe SM, Cliff MJ, Williams MA, Ladbury JE, Cohen PT,
Barford D. 2005. Dasar molekuler untuk regulasi protein fosfatase yang dimediasi
domain TPR 5. Jurnal EMBO 24: 1–10.
Yano M, Terada K, Mori M. 2004. Reseptor impor mitokondria
Tom20 dan Tom22 memiliki aktivitas seperti pendamping. Jurnal Kimia Biologi
279: 10808–10813.
Zabka M, Lesniak W, Prus W, Kuznicki J, Filipek A. 2008. Sgt1 memiliki rekan
sifat pendamping dan up-diatur oleh kejutan panas. Komunikasi Riset Biokimia
dan Biofisika 370: 179-183.
Zhang JX, Wang C, Yang CY, Wang JY, Chen L, Bao XM, Zhao YX, Zhang H,
Liu J. 2010. Peran arabidopsis AtFes1A dalam stabilitas sitosolik Hsp70
dan toleransi stres abiotik. Jurnal Tanaman 62: 539–548.

Informasi Pendukung

Informasi pendukung tambahan dapat ditemukan dalam versi

online artikel ini.

Gambar S1 (a) Peta fisik yang menunjukkan penyisipan T-

DNA ke dalam pengkodean wilayah genomik Arabidopsis thaliana
protein serinÿtreonin fosfatase 5 (PP5); (b) analisis immu
noblot menunjukkan kelimpahan AtPP5 dalam ekstrak protein
dari jenis liar (WT), Atpp5, Atpp5OEPP5 dan Atpp5OEH290N
(kiri).

Gbr. S2 Homogenitas protein rekombinan Arabidopsis thaliana

serineÿthreonine phosphatase 5 (AtPP5) yang dimurnikan
dikonfirmasi oleh elektroforesis dan spektrometri massa
desorpsi laser desorpsi matriks dibantu waktu penerbangan
(MALDI TOF).

Gbr. S3 Beberapa fungsi protein serin-treonin fosfatase 5

Arabidopsis thaliana (AtPP5).

Tabel S1 Oligonukleotida primer yang digunakan dalam penelitian ini

Harap diperhatikan: Wiley-Blackwell tidak bertanggung jawab

atas konten atau fungsi dari informasi pendukung yang
diberikan oleh penulis. Setiap pertanyaan (selain materi yang
hilang) harus diarahkan ke Kantor Pusat Phytologist Baru.
Penelitian 705

2011 Penulis Ahli Fitologi Baru (2011) 191: 692–705

Phytologist Baru 2011 Kepercayaan Phytologist Baru www.newphytologist.com