PETUNJUK PRAKTIKUM

BIOLOGI MOLEKULER
(FAF 2771)

Koordinator dan Penyunting:

Dr.rer.nat. Adam Hermawan, M.Sc., Apt.

LABORATORIUM BIOLOGI MOLEKULER

DEPARTEMEN KIMIA FARMASI
FAKULTAS FARMASI UGM
2022
 KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmaanirrahiim. Alhamdulillah, dengan rahmat dan petunjuk

Allah SWT, buku Petunjuk Praktikum Biologi Molekuler (FAF 2771) 2020/2021
ini dapat diselesaikan. Buku ini dimaksudkan sebagai panduan pelaksanaan
Praktikum Biologi Molekuler di Fakultas Farmasi UGM yang mengacu pada
kurikulum 2017. Selain itu, buku ini diadaptasi dari edisi 2019.
Didahului oleh Asistensi yang juga mencakup pengenalan alat dan
bahan praktikum, kegiatan praktikum terdiri dari lima acara praktikum, yaitu:
(PI) Pengenalan SitusBioinformatika NCBI, (PII) Isolasi dan Analisis Kuantitatif
DNA, (PIII) PCR untuk Deteksi Polimorfisme, (PIV) Analisis DNA dengan
Elektroforesis Gel Agarosa, (PV) Pengenalan Kultur Sel dan Uji Sitotoksisitas, (PVI)
Bioinformatika untuk Analisis Ekspresi Gen. Mahasiswa akan mendapatkan
pengetahuan keterampilan dan menganalisis data pada PII, PIII, P I I I dan
PV; sedangkan drylab menggunakan database akan dilakukan pada PI dan
PVI. DNA mamalia diisolasi dan dianalisis konsentrasi dan kemurniannya
dengan spektrofotometri UV (PII). Acara berikutnya adalah melakukan PCR
untuk mengamplifikasi DNA hasil isolasi untuk medeteksi polimorfisme
(PIII) yang kemudian hasilnya akan dianalisis dengan elektroforesis gel
agarose (PIV). Selain rangkaian analisis DNA tersebut, praktikum ini akan
memperkenalkan mahasiswa dengan bioinformatika menggunakan situs
NCBI (PI) dan analisis ekspresi gen secara drylab (PVI). Adapun (PV)
merupakan materi baru yang sebelumnya pernah diberikan pada tahun 2018.
Buku petunjuk praktikum ini merupakan materi pendukung Praktikum
yang merupakan suatu paket dengan materi-materi lain yang diunggahtautkan
di platform eLok (elok.ugm.ac.id). Materi-materi tersebut antara lain adalah PPT
slides, video penjelasan, dan video tutorial yang telah dibuat sebelumnya oleh
Departemen Kimia Farmasi UGM (Lab. Biologi Molekuler dan Lab. Kimia Klinik
dan Bioanalisis) melalui dana dari PIKA UGM pada skema HIBAH e-learning
tahun 2017 dan 2018.
Setelah mengikuti praktikum, mahasiswa diharapkan mampu
melakukan kegiatan penelitian di bidang biologi molekuler seperti yang telah
dipraktekkan diantaranya adalah menganalisis DNA secara kuantitatif maupun
kualitatif, melakukan PCR dan mengaplikasikannya untuk deteksi polimorfisme,
menganalisis ekspresi protein tertentu sesuai objek penelitiannya,
menggunakan berbagai situs bioinformatika untuk memudahkan kegiatan
penelitian dan menggali informasi terkait yang menyeluruh.
Terimakasih disampaikan kepada semua pihak yang telah membantu
penyusunan buku ini dan membantu pelaksanaan Praktikum Biologi Molekuler.

Koordinator praktikum dan penyunting,

Dr.rer.nat. Adam Hermawan, M.Sc., Apt.

ii
 DAFTAR ACARA PRAKTIKUM

PI. Pengenalan Situs Bioinformatika NCBI

PII. Isolasi dan Analisis Kuantitatif DNA
PIII. PCR untuk Deteksi Polimorfisme
PIV. Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa
PV. Pengenalan Kultur Sel dan Uji Sitotoksisitas
PVI. Bioinformatika untuk Analisis Ekspresi Gen

DAFTAR DOSEN PENGAMPU PRAKTIKUM

1. Prof. Dr. Edy Meiyanto M.Si., Apt.

2. Dr. Rumiyati, M.Si., Apt.
3. Dr. Djoko Santosa, M.Si.
4. Dr. Puji Astuti, M.Sc., Apt.
5. Dr. Sylvia Utami Tunjung Pratiwi, M.Si.
6. Dr. Riris Istighfari Jenie, M.Si., Apt.
7. Dr. Muthi’ Ikawati, M.Sc., Apt.
8. Dr. rer.nat. Adam Hermawan, M.Sc., Apt. (koordinator)
9. Dr. Purwanto, M.Sc., Apt.
10. Muhammad Novrizal Abdi Sahid, M. Eng., Apt., Ph.D.
11. Puguh Indrasetiawan, M.Sc., Apt., Ph.D.
12. Setyowati Triastuti Utami, M.Sc., Apt., Ph.D.
13. Dr. rer.nat. Siti Nurul Hidayah, M.Sc., Apt.
14. Asefin Nurul Ikhtiarini, M.Pharm.Sci.

iii
 TATA TERTIB LABORATORIUM

1. Mahasiswa datang 15 menit sebelum praktikum dimulai

2. Mahasiswa mempersiapkan diri dengan mempelajari materi praktikum baik dari materi
yang disediakan pada eLOK kelas Biologi Molekuler maupun dari sumber lainnya yang
relevan.
3. Jas laboratorium dan name tag dipakai sebelum memasuki laboratorium
4. Mahasiswa tidak diperkenankan memakai SANDAL dan KAOS OBLONG
5. Mahasiswa terlambat 15 menit tanpa alasan yang jelas tidak diperkenankan mengikuti
praktikum
6. Mahasiswa diwajibkan untuk MENGIKUTI SEMUA MATA PRAKTIKUM
7. Tidak disediakan waktu khusus untuk inhal.
8. Mahasiswa yang berhalangan hadir bisa mengikuti PRAKTIKUM GOLONGAN LAIN
untuk acara yang sama setelah mendapatkan izin dari koordinator praktikum
9. Mahasiswa tidak diperkenankan MAKAN, MINUM, MEROKOK selama praktikum
10. Laporan praktikum dibuat BER-KELOMPOK dan dikumpulkan saat mengikuti
praktikum berikutnya
 PETUNJUK KESELAMATAN

Keamanan adalah faktor yang sangat penting dalam pekerjan

yang berkaitan dengan laboratorium karena beberapa aspek dari
teknik-teknik yang digunakan dapat menimbulkan bahaya. Berikut ini
akan diuraikan beberapa aspek yang relevan.
Bahan Kimia Beracun
Sejumlah bahan kimia yang dipakai pada prosedur kerja
laboratorium merupakan zat beracun dan memerlukan penanganan
yang spesifik.
1. Bahan kimia yang mudah terbakar atau meledak, seperti
fenol, kloroform, dan alkohol harus dijauhkan dari api.
2. Sisa pakainya (limbahnya) dikumpulkan dalam botol yang
berisi air.
3. Sinar UV sangat berbahaya untuk mata dan kulit, sehingga
pada saat berhubungan dengan sinar tersebut perlu
pelindung uv untuk muka, sarung tangan dan jas praktikum.
4. Bahan kimia yang bersifat mutagenik, karsinogenik atau
neurotoksik (misalnya akrilamid), harus dihindari untuk
tidak kontak dengan kulit, sehingga perlu memakai sarung
tangan.
5. Semua alat habis pakai (tabung, tabung mikro Eppendorf, tip),
dikumpulkan pada tempat khusus.

Semua bahan kimia yang sudah dipakai (limbah bahan kimia)

harus dikumpulkan pada wadah khusus, TIDAK BOLEH
dibuang sembarangan.

1 dari 62
 Resiko Penggunaan Alat
Beberapa alat laboratorium dapat membahayakan bila tidak
diperlakukan dengan benar.
Misalnya: power supply untuk alat elektroforesis bertegangan
tinggi, sehingga saat memasukkan dan mengangkat gel dari
tangki elektroforesis harus dipastikan aliran listrik dimatikan
dulu.
Microwave tidak boleh digunakan untuk memanaskan logam, jika
memanaskan botol maka tutupnya harus dilonggarkan.

2 dari 62
 DAFTAR ACARA PRAKTIKUM
PENGENALAN ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM BIOMOL
A. Tujuan ................................................................................... 5
B. Kegiatan yang Dilakukan ....................................................... 5

PI. PENGENALAN SITUS BIOINFORMATIKA NCBI DAN

PENGGUNAANNYA DALAM MEMAHAMI PROSES
EKSPRESI GEN
(Prof. Dr. Edy Meiyanto, MSi., Apt., Dr. Adam H., MSc., Apt., dan
Dr. Purwanto, M.Sc., Apt.)
A. Tujuan ............................................................................................. 6
B. Pendahuluan ................................................................................... 6
C. Langkah Kerja. ................................................................................ 9
D. Tugas .............................................................................................. 16

PII. A. ISOLASI DNA MAMALIA

(Prof. Dr. Sismindari, SU, Apt. dan Dr. Muthi’ Ikawati., M.Sc., Apt.)
A. Tujuan .................................................................................... 17
B. Pendahuluan .......................................................................... 17
C. Bahan .................................................................................... 18
D. Langkah kerja ........................................................................ 19
PII. B. ANALISIS DNA HASIL ISOLASI DENGAN
SPEKTROFOTOMETRI
(Prof. Dr. Sudjadi, MS., Apt.)
A. Tujuan ................................................................................... 22
B. Pendahuluan ........................................................................ 22
C. Bahan ………........................................................................ 23
D. Langkah Kerja ....................................................................... 23

PIII. AANALISIS SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM

(SNP) DENGAN POLYMERASE CHAIN REACTION –
RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM
(PCR-RFLP)
(Prof. Dr. Sudjadi, MS., Apt. dan Dr. Riris Istighfari Jenie, M.Si, Apt,)
A. Tujuan ................................................................................... 24
B. Pendahuluan ........................................................................ 24
C. Bahan Amplifikasi ................................................................. 30
3 dari 62
D. Langkah Kerja ....................................................................... 31
E. Pertanyaan ........................................................................... 35

PIV. ANALISIS DNA DENGAN ELEKTROFORESIS GEL

AGAROSE (Prof. Dr. Sismindari, SU, Apt.)
A. Tujuan ................................................................................... 36
B. Pendahuluan ........................................................................ 36
C. Bahan Amplifikasi ................................................................. 38
D. Langkah Kerja ....................................................................... 39
E. Analisis Hasil ........................................................................ 41
F. Pertanyaan ........................................................................... 42

PV. PENGENALAN KULTUR SEL MAMALIA DAN

PENGGUNAANNYA UNTUK UJI SITOTOKSISITAS
(Dr. Puji Astuti, M.Sc., Apt., Dr. Riris Istighafri Jenie, M.Si., Apt dan Dr. Muthi
Ikawati, M.Sc., Apt.)
A. Tujuan ............................................................................................ 43
B. Pendahuluan.................................................................................. 43
C. Bahan ............................................................................................. 44
D. Langkah Kerja ............................................................................... 44

PVI. ANALISIS EKSPRESI GEN DENGAN GEO DAN DAVID

(Prof. Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt. dan Dr. Adam Hermawan,
M.Sc., Apt.,)
A. Tujuan.............................................................................................. 49
B. Pendahuluan ................................................................................... 49
C. Langkah Kerja................................................................................. 51
D. Tugas............................................................................................... 61

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................

62

4 dari 62
 PENGENALAN ALAT DAN BAHAN
PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

A. Tujuan
- Mahasiswa memahami alat dan bahan yang digunakan dalam
Praktikum Biologi Molekuler.
- Mahasiswa memahami dan menerapkan biosafety.

B. Kegiatan yang Dilakukan

1. Mahasiswa mengamati alat-alat yang digunakan dalam
praktikum, termasuk cara pengoperasian.
2. Mahasiswa mengamati bahan-bahan yang digunakan dalam
praktikum, termasuk memperhatikan unit konsentrasi bahan,
komposisi buffer, cara penyiapan bahan, cara penyimpanan
bahan.
3. Mahasiswa mempelajari petunjuk keaman (biosafety) selama
praktikum.
4. Mahasiswa mengakses dan memahami video tutorial yang telah
dibuat oleh lab.

5 dari 62
 PERCOBAAN
I. PENGENALAN SITUS BIOINFORMATIKA NCBI DAN
PENGGUNAANNYA DALAM MEMAHAMI PROSES EKSPRESI
GEN
(Prof. Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt., Dr. Adam Hermawan, M.Sc., Apt., dan
Dr. Purwanto, M.Sc., Apt.)

A. Tujuan
1. Menelusuri identitas suatu gen berdasarkan sekuen nukleotida
menggunakan gene bank database.
2. Mahasiswa memahami prinsip ekspresi gen yang meliputi
transkripsi dan translasi serta regulasinya.
3. Mahasiswa dapat mengidentifikasi bagian gen yang berperan
sebagai promoter, coding sequence (CDS), intron dan ekson,
start dan stop kodon, serta regulating element.
4. Mahasiswa dapat memahami bagaimana satu gen yang sama
dapat menghasilkan protein yang berbeda.

B. Pendahuluan
NCBI (National Centre for Biotechnology Information)
merupakan suatu institusi yang konsen sebagai sumber informasi
perkembangan biologi molekuler. NCBI membuat database yang
dapat diakses oleh publik, merangsang riset biologi terkomputasi,
mengembangkan software penganalisis data genome, dan
menyebarkan informasi biomedical - yang kesemuanya diharapkan
mengarah pada pemahaman yang lebih baik tentang proses-proses
molekuler yang mempengaruhi manusia dan kesehatannya.

Situs akses NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov.

Salah satu tools yang tersedia dalam situs NCBI ini adalah
BLAST. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan
suatu alat pencari yang dapat menyesuaikan dan mencari sekuen
yang mirip dengan sekuen meragukan yang kita miliki melalui
perbandingan sekuen melalui GenBank DNA database dalam waktu
singkat.
6 dari 62
Ada 5 program utama dalam BLAST, yaitu:
1. nucleotide blast (blastn): membandingkan suatu sekuen
nukleotida yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida.
Blastn dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu sekuen
nukleotida meragukan (query sequence) yang kita miliki dengan
database nukleotida, sehingga output yang didapat berupa
identitas nukleotida tersebut, antara lain nama gen dan spesies
penghasil dari sekuen lengkapnya.
2. protein blast (blastp): membandingkan suatu sekuen asam amino
yang kita miliki dengan database sekuen protein.
3. blastx: membandingkan produk translasi konsep 6-frame sebuah
sekuen nukleotida (translated nucleotide) yang kita miliki dengan
database sekuen protein
4. tblastn: membandingkan suatu sekuen protein yang kita miliki
dengan database sekuen nukleotida yang secara dinamis
ditranslasi pada semua pembacaan 6 frame.
5. tblastx: membandingkan suatu translasi 6 frame dari nukleotida.

Sel-sel penyusun tubuh organisme tidak semuanya sama,

melainkan memiliki variasi yang tinggi sesuai dengan fungsi yang
diperankannya meskipun kandungan genomiknya sama. Adanya
variasi tersebut disebabkan karena adanya perbedaan pola
ketersediaan protein pada masing-masing sel, atau dengan kata lain
disebabkan karena perbedaan pola ekspresi gen. Pada dasarnya gen
akan diekspresikan menjadi RNA dan kemudian menjadi protein. Gen
pada human berbeda dengan bakteri karena mengandung intron yang
harus dihilangkan saat proses ekspresi berlangsung yang disebut
sebagai proses splising (Gambar IV-1). Ekspresi suatu gen terjadi
hanya saat dibutuhkan oleh sel. Jika sel tersebut tidak membutuhkan
protein maka gen tersebut tidak diekspresikan.

7 dari 62
 Gambar IV-1. Proses ekspresi gen yang meliputi transkripsi,
splicing dan translasi.

Ekspresi gen dimulai dari terekspresinya gen tersebut menjadi

mRNA yang disebut sebagai “transkripsi”. Dalam proses transkripsi
tersebut dibutuhkan enzim polimerase DNA yang menempel pada
daerah “promoter” Setelah proses transkripsi selesai maka mRNA
akan diterjemahkan menjadi protein sehingga proses ini disebut
sebagai “translasi”. Reaksi dasar dari sintesis protein adalah
pembentukan ikatan polipeptida antara gugus karboksil dari asam
amino yang akan tumbuh dengan gugus amina dari asam amino
bebas, berdasarkan sekuen mRNA cetakannya. Sintesis protein
diawali dari proses inisiasi, yaitu berikatannya dua sub unit ribosom
dengan mRNA pada daerah spesifik yang disebut sebagai “Ribosome
Binding Site”, yaitu 10-30 nukleotida pada daerah upstream dari start
kodon. Proses inisiasi memerlukan suatu kodon spesifik yaitu AUG
(menyandi asam amino metionin).
Setelah proses inisiasi selesai maka dilanjutkan dengan proses
perpanjangan (elongasi), yaitu tRNA mentransfer suatu asam amino
yang bersesuaian dengan kodon berikutnya untuk membentuk
rangkaian polipeptida dengan asam amino sebelumnya. Proses
elongasi ini melewati siklus yang terdiri dari 3 tahap. Pertama, molekul
amino asil tRNA akan terikat pada A-site yang kosong dengan jalan
8 dari 62
berikatan dengan kodon dari mRNA yang terdapat pada A-site.
Kedua, terbentuk ikatan polipeptida antara gugus karboksil pada
asam amino ujung C dari rantai polipeptida yang telah terbentuk (di P-
site) dengan gugus amino pada asam amino baru yang dibawa oleh
t-RNA tersebut (di A-site). Reaksi ini dikatalisis oleh suatu enzim
peptidil transferase. Ketiga, sesaat setelah proses ke-2, terjadi
pergeseran ribosom ke depan sepanjang tiga nukleotida (1 kodon)
dari mRNA sehingga peptidil transferase yang baru terbentuk (di A-
site) akan bergeser menjadi posisi P-site. Pada saat proses
translokasi tersebut, tRNA bebas akan terlepas dari ribosom dan
masuk sitoplasma. Setelah proses ketiga selesai, A-site akan kosong
dan siap menerima molekul tRNA yang baru dan mulailah siklus
seperti tadi lagi. Proses perpanjangan ini akan terus berlangsung
sampai akhirnya ribosom mengenali salah satu dari tiga stop kodon
yakni UAA, UAG, dan UGA sehingga sintesis protein akan mengalami
terminasi dan rantai polipeptida yang sudah terbentuk tadi akan lepas
dari ribosom.
Pada percobaan kali ini mahasiswa akan mempelajari dogma
utama dalam biologi molekuler, yaitu transkripsi DNA menjadi mRNA
dan translasi mRNA menjadi protein yang dengan istilah ekspresi gen.
Mahasiswa akan mendapatkan sekuen nukleotida query, kemudian
menganalisis bagian-bagian pada sekuens tersebut yang berperan
dalam proses transkripsi menggunakan database NCBI. Selanjutnya,
pemahaman proses transkripsi dan translasi akan dilakukan tahap
demi tahap dengan menggunakan Open Reading Frame finder
(ORF finder).

C. Langkah Kerja
Contoh soal
Sekuens nukleotida
CTGGAGCCCC TGAACCGTCC GCAGCTCAAG ATCCCCCTGG
AGCGGCCCCT GGGCGAGGTG
TACCTGGACA GCAGCAAGCC CGCCGTGTAC AACTACCCCG
AGGGCGCCGC CTACGAGTTC
AACGCCGCGG CCGCCGCCAA CGCGCAGGTC TACGGTCAGA
CCGGCCTCCC CTACGGCCCC
9 dari 62
GGGTCTGAGG CTGCGGCGTT CGGCTCCAAC GGCCTGGGGG
GTTTCCCCCC ACTCAACAGC
GTGTCTCCGA GCCCGCTGAT GCTACTGCAC CCGCCGCCGC
AGCTGTCGCC TTTCCTGCAG

Setelah muncul tampilan BLASTn, pilih NM_000125.3

Langkah kerja analisis nukleotida query menggunakan tool
BLASTn
1. Buka situs www.ncbi.nlm.nih.gov
2. Pilih tool ”BLAST” (klik satu kali), akan muncul tampilan pilihan
program BLAST. Untuk mencari gen suatu sekuen nukleotida dari
database nukleotida pilih ”nucleotide blast” (blastn).
3. Setelah tampilan muncul, masukkan sekuen nukleotida (query)
yang akan dicari (masukkan sekuens nukleotida yang tercantum
pada soal); pilih seting pencarian dari database ”others” (jika belum
diketahui spesiesnya); pilih program ”megablast”; klik ”BLAST”
untuk memulai proses searching.
4. Hasil blast umumnya akan menghasilkan lebih dari satu sekuen
yang bersesuaian. Beberapa parameter untuk memilih hasil antara
lain skor paling tinggi, query coverage, serta kelengkapan
informasi genetik yang dikandungnya.
Untuk praktikum, pilih hasil sesuai dengan yang telah ditentukan
dalam soal (lihat kode accessionnya).
5. Klik “Accession” gen terpilih (hasil blastn) untuk keterangan lebih
lanjut, mempelajari tampilan sequence viewer NCBI, nucleotide
origin dan CDS-nya. Jika ingin keterangan mengenai protein hasil
translasi dari CDS tsb, klik “/protein_id=”, dan untuk melihat lokasi
gen tersebut pada kromosom, klik “map viewer”.
6. Simpan data Sequence viewer-nya untuk laporan praktikum, lihat
dan pelajari keterangan-keterangan yang tercantum pada tampilan
tersebut termasuk: locus, definition, summary, features, CDS,
mRNA, exon, nukleotide origin (content).

10 dari 62
1. Tampilan awal homepage NCBI

2. Kolom BLAST

11 dari 62
3. Klik blatsn, masukkan sekuens nukleotida query (sesuai
soal)

4. Hasil BLASTn akan muncul, sbb (pada menu “descriptions”):

12 dari 62
Untuk melihat hasil kesamaan (identity) antara query yang kita
masukkan dengan database, klik menu “allignments”. Hasilnya akan
terlihat sbb :

5. Untuk melihat properties dari gen yang dicari tadi (query), klik
menu “sequence ID” (lihat kode accessionnya). Tanda panah
menunjukkan bagian yang berisi informasi penti

13 dari 62
14 dari 62
Langkah kerja untuk identifikasi proses terjadinya ekspresi gen
dengan menggunakan Open Reading Frame finder (ORF finder)
1. Buka halaman awal pada
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/
2. Masukkan bagian gen yang merupakan CDS (dari praktikum
sblmnya) ke dalam kolom ORF finder.
3. CDS diperoleh dari sequence viewer pada langkah kerja
sebelumnya (BLASTn).
4. Tampilan ORF akan muncul dengan menunjukkan 6 cara
pembacaan CDS (six frames). Temukan cara pembacaan (frame)
mana yang sesuai untuk menghasilkan protein yang diinginkan
(yang sesuai target).
5. Untuk itu, klik frame-nya untuk melihat urutan asam amino yang
dihasilkan, kemudian lihat cara pembacaan CDS (pada kotak
sebelah kanan). Frame yang tepat dapat juga diketahui dengan
mencocokkan arah pembacaan dan urutan asam amino yang
muncul pada tampilan sequence viewer.

Tampilan halaman ORF Finder

15 dari 62
 Hasilnya akan muncul tampilan sebagai berikut:
Selanjutnya Klik pada pita dengan cokelat yang paling panjang dan
posisi paling atas, maka akan tampak rincian pembacaan frame
tersebut.

Dicocokkan dengan asam amino yang tertera pada sequence viewer CDS


D. Tugas
1. Mahasiswa akan diberi suatu sekuens nukleotida tertentu (query)
atau accession number.
2. Lakukan analisis mengenai identitas gen tersebut antara lain
meliputi nama gen, organisme penghasilnya, origin sekuen, CDS,
posisinya pada kromosom, protein yang diperoleh dari hasil
translasi gen tersebut.
3. Cari penyakit-penyakit yang terkait dengan gen (kelainan genetik)
atau protein target. Berikan penjelasan bagaimana kaitan antara
gen/ protein dengan penyakit yang disebutkan dan terapi yang
sering digunakan.

Catatan: Sekuens query akan diberikan pada waktu praktikum.

16 dari 62
 PERCOBAAN
II. A. ISOLASI DNA
(Prof. Dr. Sismindari, SU, Apt. dan Dr. Muthi’ Ikawati, M.Sc., Apt.)

A. Tujuan
Mahasiswa dapat mengisolasi DNA mamalia.

B. Pendahuluan
Isolasi DNA merupakan langkah awal dari berbagai
percobaan Biologi Molekuler. Prosedur isolasi pada dasarnya
disesuaikan dengan organisme karena struktur dan komposisi
organisme sangat berbeda-beda. Pada prinsipnya metoda isolasi
tersebut adalah dengan memecahkan sel yang kemudian dilanjutkan
dengan memisahkan DNA dari komponen-komponen lain seperti,
protein, RNA, dan mengendapkan DNA. Pemecahan sel dapat
dilakukan dengan metode fisik atau kimiawi. Pada metode fisik, sel
dipecah dengan kekuatan mekanik, sedangkan pada metode kimiawi,
sel diperlakukan dengan pemaparan senyawa kimia yang
mempengaruhi dinding sel. Metoda kimiawi lebih banyak digunakan
dalam preparasi DNA.
Isolasi DNA mamalia diawali dengan menyiapkan sampel
yang dapat berupa darah maupun organ dari mamalia. Dalam
praktikum ini sampel yang digunakan adalah sampel darah yang
mempunyai komposisi utama darah adalah protein haemoglobin.
Pada tahap awal, dilakukan lisis sel darah merah dengan
menambahkan buffer lisis (red blood cell lysis buffer=RBCLB). Tahap
selanjutnya adalah penambahan guanidin isothiosianat yang mampu
melisis sel darah putih sekaligus denaturasi protein. Untuk
memisahkan protein dari DNA cukup dilakukan penambahan
kloroform. Pelarut organik ini bersama guanidin isothiosianat mampu
mengendapkan protein yang nantinya akan menggumpal pada batas
antara fase air (lapisan atas) dan fase organik (lapisan bawah). DNA
dan RNA. Akan terdapat di dalam fase air yang merupakan lapisan
bagian atas. Molekul RNA dapat dihilangkan dengan penambahan
RNase.

17 dari 62
 Selanjutnya dilakukan pengendapan DNA menggunakan
isopropanol/etanol absolut, dikeringkan hingga diperoleh pellet DNA
dan ditambahkan buffer TE 1x, untuk kemudian disimpan dalam frezer
(-20oC) dengan penambahan buffer TE. Jika proses presipitasi
dilakukan secara hati-hati maka akan diperoleh benang DNA (Gambar
I-1).

Endapan
DNA

sebelum sesudah
Ditambah Ethanol

Gambar I-1. DNA berbentuk benang setelah diendapkan

dengan etanol.

C. Bahan
1. Darah mamalia
Darah harus dikumpulkan dalam tabung vacutainer yang
mengandung EDTA. Sampel darah dapat disimpan pada suhu

18 dari 62
 kamar untuk ekstraksi DNA pada hari yang sama atau disimpan di
freezer untuk penggunaan di kemudian hari
2. TE buffer
Tris-HCl 10 mM pH 8,0
EDTA 1 mM
3. 10 x SE buffer pH 8,0
750 mM NaCl 4,38 g
250 mM EDTA 9,30 g
Aquadest ad 100 mL
4. 10 x Red blod cell lysis buffer (RBCLB) pH 7,4
1550 mM NH4Cl 8,2 g
100 mM KCO3 1,0 g
10 mM EDTA 0,37 g
Aquadest ad 100 mL
5. NaCl 6M
6. Kloroform
7. Etanol 96 % dan 70 %
8. Guanidin isothiosianat 4 M

D. Langkah kerja
1. Ambil 2-3 mL darah, masukkan dalam Falcon tube.
2. Tambahkan 8-12 mL RBCLB lalu homogenkan, kemudian
letakkan pada es selama 20 menit.
3. Lakukan sentrifugasi campuran tersebut dengan kecepatan 5.000
rpm selama 10 menit.
4. Apabila pellet masih berwarna merah, ulangi langkah dari no 2
dan diinkubasikan lagi pada suhu 4 °C selama 30 menit.
5. Lakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 750 g (5.000
rpm) selama 10 menit.
6. Buang supernatan, bersihkan dinding tube dengan cara membalik
tube ke tissue.
7. Tambahkan 100 µL SE buffer ke dalam pellet, kocok hingga larut.
8. Pindahkan larutan ke dalam tabung ependorf 1,5 mL.
9. Tambahkan 100 µL guanidin isothiosianat 4 M, campur
menggunakan pipet.
10. Tambahkan 700 µL kloroform.
19 dari 62
11. Tambahkan 400 µL NaCl.
12. Homogenkan campuran tersebut secara hati-hati.
13. Lakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 10 menit.
14. Setelah sentrifugasi, akan tampak 3 lapisan pada larutan yaitu:
Lapisan atas, transparan, mengandung DNA;
Lapisan tengah yang berwarna seperti susu, mengandung
protein;
Lapisan bawah, transparan.
15. Pindahkan lapisan atas ke dalam tabung ependorf 1,5 mL
menggunakan pipet, catat volume supernatannya.
16. Tambahkan etanol absolut sebanyak 2x volume supernatan yang
diperoleh (contoh: 1 mL etanol absolut jika diperoleh 500 µL
supernatan), campurkan perlahan dengan cara membolak
balikkan tabung. DNA akan tampak dalam larutan sebagai
benang-benang atau endapan berkabut (tahap ini disebut sebagai
presipitasi etanol).
17. Benang DNA yang muncuk diambil dengan menggunakan
mikropippet 1mL, dan dipindahkan ke tabung Eppendorf steril dan
bersih.
Catatan: Jika DNA diambil dengan cara seperti ini akan diperoleh
DNA yang cukup murni, oleh karena endapan RNA tidak ikut
terambil.
18. Apabila benang DNA tidak muncul, lakukan sentrifugasi
campuran dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit. DNA
akan terbentuk sebagai pellet setelah sentrifugasi.
19. Jika dilakukan tahap no 17, benang DNA dicuci dengan etanol
70%, 500 µL.
Jika dilakukan tahap no 18, buang supernatan, tambahkan ke
dalam pellet 500 µL etanol 70%, gojog perlahan.
20. Lakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 5 menit.
21. Buang supernatan, bersihkan cairan pada dinding tabung dengan
kertas tissue, jangan menyentuh pellet DNA dan gunakan sarung
tangan.

20 dari 62
22. Keringkan pellet DNA pada suhu kamar selama 15 menit (atau
dalam oven pada suhu 55 °C selama 4-5 menit).
23. Tambahkan buffer TE sebanyak 50-200 µL (tergantung dari
banyaknya pellet yang dihasilkan).
24. Simpan larutan sampel pada suhu -20 °C.

Catatan:
1. Perlu diperhatikan fungsi masing-masing pelarut
yang digunakan dalam isolasi DNA
a. RBCLB
b. Fenol
c. Kloroform
d. Isoamilalkohol
e. Guanidine isothiosianat
2. Penambahan NaCl sangat penting dalam
pengendapan DNA dengan etanol absolut. Volume
etanol yang ditambahkan perlu diperhatikan (2x
volume).

21 dari 62
 PERCOBAAN
II. B. ANALISIS DNA HASIL ISOLASI DENGAN
SPEKTROFOTOMETRI
(Prof. Dr. Sudjadi, MS., Apt.)

A. Tujuan
Mahasiswa dapat melakukan analisis kuantitatif dan kualitatif
terhadap sampel DNA menggunakan spektrofotometri.

B. Pendahuluan
Setelah dilakukan isolasi DNA maka perlu dilakukan analisis
untuk menentukan kuantitas dan kualitas DNA tersebut. Metode yang
umum digunakan dalam hal ini adalah menggunakan spektrofotometri
UV dan elektroforesis dengan gel agarosa. DNA bisa dilihat pada
spektrofotometer UV karena mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi.
Purin dan pirimidin menunjukkan absorbsi maksimal pada panjang
gelombang sekitar 260 nm (dATP: 259 nm; dCTP: 272 nm; dTTP: 247
nm)
Konsentrasi DNA dapat diukur dengan spektrofotometri UV
pada panjang gelombang maksimum 260 (l260.). Untuk A260nm = 1
setara dengan 50 µg/mL DNA untai ganda. Kemurnian larutan DNA
dapat dilihat bahwa larutan DNA murni mempunyai rasio A260/A280
adalah 1,8. Jika rasio lebih dari 1,8 menunjukkan adanya RNA, oleh
karena RNA juga diserap pada panjang gelombang yang sama.
Sedangkan jika rasio kurang dari 1,8 menunjukkan adanya pengotor
protein atau fenol, untuk itu jika diperlukan, dapat di murnikan kembali
dengan melakukan ekstraksi chloroform-isoamilalkohol (24 :1) dan
dilanjutkan dengan presipitasi menggunakan Na asetat 3M pH 4,8 (0,1
kali volume) dan etanol absolut (2 kali volume).

Konsentrasi DNA (µg/mL) = 50 µg/mL x OD260 x faktor pengenceran

22 dari 62
Konversi spektrofotometri dari asam nukleat:
1 A 260 DNA untai ganda = 50 µg/mL
1 A 260 DNA untai tunggal = 33 µg/mL
1 A 260 RNA = 40 µg/mL

C. Bahan
DNA hasil isolasi

D. Langkah kerja
1. Pipet 5 µL sampel DNA hasil isolasi tambahkan aquadest
secukupnya sehingga volume akhir 1 mL. Campur kemudian
pindahkan ke dalam kuvet spektrofotometer.
2. Blangko spektrofotometer dengan kuvet berisi 1 mL aquadest.
3. Baca absorbansi sampel dengan spektrofotometer pada l260
nm.
4. Lakukan pembacaan absorbansi yang ke-2 pada l280 nm.
5. Tentukan rasio absorbansi pada l260 nm dan l280 nm.
6. Hitung konsentrasi DNA sampel, dan tentukan konsentrasi
DNA yang diperoleh.

Catatan:
Konsentrasi DNA untai ganda pada l260 nm dengan
absorbansi 1 » 50 µg/mL.
DNA dinyatakan murni jika A l260/A l280 = 1,8.
Dalam menghitung jumlah DNA yang diperoleh perlu
diperhitungkan pula faktor pengenceran.

23 dari 62
 PERCOBAAN
III. Analisis Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Dengan
Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length
Polymorphism (PCR-RFLP)
(Prof. Dr. Sudjadi, MS., Apt. dan Dr. Riris Istighfari Jenie, MSi., Apt.)

A. Tujuan
1. Mahasiswa dapat melakukan amplifikasi fragmen DNA manusia
dengan teknik PCR dan memotong produk PCR dengan enzim
restriksi tertentu untuk melihat polimorfisme.
2. Mahasiswa dapat menganalisis single nucleotide polymorphism
(SNP) pada gen tertentu DNA tertentu (dry lab).
3. Mahasiswa dapat menggunakan software untuk mendesain
primer.

B. Pendahuluan
Polymerase chain reaction (PCR) merupakan suatu teknik
analisis dalam bidang biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen
DNA tertentu. Dasar dari metode PCR adalah proses replikasi DNA di
dalam sel, yang memerlukan cetakan DNA, primer, nukleotida dan
enzim polimerase DNA. PCR mampu mengamplifikasi daerah spesifik
DNA menggunakan sistem siklus temperatur dan enzim polimerase
yang termostabil serta primer DNA yang spesifik. Panjang DNA target
yang diamplifikasi berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida
yang posisinya diapit oleh sepasang primer. Primer yang berada
sebelum daerah target disebut primer forward dan yang berada
setelah daerah target disebut primer reverse (Gambar II-1).
Dengan teknik ini, kita dapat menghasilkan DNA dalam
jumlah besar dalam waktu singkat. Metode PCR tersebut sangat
sensitif dan dapat dilakukan pada sampel DNA yang sangat sedikit
yaitu 5 ng DNA serta dilakukan pada volume reaksi yang sangat kecil
yaitu 20-100 µL.

24 dari 62
 Gambar II-1. Target DNA yang diamplifikasi.

Untuk melakukan PCR ada beberapa komponen utama yang

diperlukan yaitu :
1. DNA cetakan (template DNA), yang merupakan target DNA
yang akan diamplifikasi.
2. Primer (15-25 basa), yang digunakan untuk mengawali
sintesis DNA.
3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), meliputi dATP, dCTP,
dTTP, dGTP, yang merupakan bahan penyusun amplifikasi
DNA.
4. Taq polymerase, yaitu enzim DNA Polimerase I yang berasal
dari bakteri Thermus aquaticus, yang bersifat termostabil
sehingga sesuai untuk digunakan sebagai katalisator sintesis
DNA pada PCR.

Selama proses PCR (Gambar II-2), campuran komponen 1-4

(reaction mixture) di atas ditransfer ke tiga macam temperatur, yaitu:
1. Denaturasi DNA cetakan pada suhu tinggi, umumnya 94°C
atau 95°C, sehingga DNA akan mengalami perubahan
konformasi dari untai ganda (double stranded, ds) menjadi
untai tunggal (single stranded, ss) karena rusaknya ikatan
hidrogen antar dua untai polinukleutida. ssDNA akan
berfungsi sebagai cetakan untuk sintesis DNA pada tahap
berikutnya.
2. Hibridisasi atau annealing (penempelan primer), dimana
pada proses ini terjadi penempelan primer pada cetakan
DNA. Proses annealing terjadi pada suhu tertentu yang
tergantung pada panjang primer yakni 5°C di bawah Tm
(melting temperature) dari primer, yang pada umumnya 55°C,
25 dari 62
 dan akan terjadi ikatan hidrogen antara primer dengan
cetakan DNA.
3. Sintesis DNA yang dikatalisis oleh polimerase DNA. Sintesis
DNA terjadi pada suhu yang lebih tinggi dibandingkan
tahapan sebelumnya yaitu 72°C.

Reaksi-reaksi tersebut diulang sampai 20-30 siklus sehingga pada

akhir reaksi akan diperoleh fragmen DNA dengan jumlah yang berlipat
ganda.

Gambar II-2. Gambaran proses dalam PCR. Dalam setiap siklus PCR
dilakukan 3 tahap: tahap ke-1 denaturasi pada 95°C, tahap ke-2 annealing
primer pada 55°C, dan tahap ke-3 sintesis DNA pada 72°C. Proses tersebut
diulang sampai 30 siklus.

26 dari 62
Tm dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
Tm = 2 (jumlah A + jumlah T) + 4 (jumlah C + jumlah G)

Tahap yang penting pada metode PCR ini adalah desain

primer dan penentuan temperatur annealing. Primer yang
digunakan harus komplemen secara spesifik pada DNA target, jika
tidak spesifik maka akan diperoleh hasil amplifikasi yang tidak spesifik
(lebih dari satu produk). Untuk temperatur annealing, jika terlalu tinggi,
primer (yang komplemen tersebut) tidak bisa menempel pada target
(tetap ter-disosiasi), maka sintesis tidak akan terjadi. Sebaliknya, jika
terlalu rendah, maka primer akan menempel di beberapa tempat
secara tidak spesifik (Gambar II-3).

Gambar II-3. Pentingnya temperatur annealing sebagai penentu

hibridisasi primer pada cetakan DNA.

27 dari 62
 Salah satu aplikasi PCR adalah untuk melihat polimorfisme
DNA. Polimorfisme merupakan fenomena terjadinya rangkaian DNA
yang berbeda antar satu individu dengan individu lain, baik urutan
basa DNA maupun panjang DNA (variasi DNA). Hal ini bisa terjadi
karena adanya mutasi (perubahan basa dari DNA). Mutasi pada gen
yang bertanggung jawab melakukan metabolisme xenobiotik akan
berpangaruh terhadap aktivitas suatu obat. Teknik deteksi
polimorfisme menggunakan metode PCR-restriction fragment length
polymorphism (RFLP), dimana sampel DNA yang telah diamplifikasi
menggunakan PCR dipotong menjadi beberapa fragmen
menggunakan enzim restriksi. Fragmen DNA hasil pemotongan
kemudian dipisahkan berdasarkan ukurannya menggunakan
elektroforesis gel agarosa.
Pada praktikum ini akan dipelajari polimorfisme gen penyandi
N-asetiltransferase2 (NAT2) pada manusia. NAT2 adalah enzim
pemetabolisme fase II yang berperan penting dalam detoksifikasi
berbagai xenobiotik termasuk obat dan karsinogen, arilamin, hidrazin
dan isoniazid. Enzim ini mengkatalisis konjugasi gugus asetil pada
substrat xenobiotik tersebut sehingga menghasilkan senyawa yang
lebih larut dalam air. Gen penyandi NAT2 dikenal polimorfik.
Perbedaan kapasitas metabolik enzim NAT2 pada setiap individu
disebabkan oleh variasi urutan basa dari alelik gen NAT2 (terletak
pada kromosom 8p22). Variasi dari gen tersebut merupakan variasi
“satu nukelotida” atau dikenal dengan single nucleotide polymorphism
(SNPs). Variasi tersebut menyebabkan fenotip asetilator NAT2 yang
berbeda dan terbagi menjadi asetilator lambat, sedang atau cepat.
Alel NAT2*4 (wild type) menyandi fenotip asetilator cepat, sedangkan
alel lain (NAT2*5-7) menyandi fenotip asetilator lambat atau sedang.
Apabila zat xenobiotik tidak cukup terasetilasi, maka zat tersebut akan
terakumulasi dan diubah menjadi metabolit yang reaktif oleh enzim-
enzim oksidatif. NAT2 dilaporkan mampu mengurangi kemungkinan
terbentuknya metabolit reaktif tersebut. Polimorfisme pada NAT2
berhubungan dengan tingginya insidensi kanker dan toksisitas obat.
Seperti yang telah disebutkan di atas, substitusi missense pada alel-
alel NAT2 yaitu G191A (NAT2*14A), T341C (NAT2*5A), G590A
(NAT2*6A), dan /atau G857A (NAT2*7A) berasosiasi dengan fenotip
28 dari 62
asetilator lambat. NAT2*5A dan NAT2*6A menyebabkan turunnya
ekspresi protein NAT2, sedangkan NAT2*14A dan NAT2*7A
menyebabkan turunnya stabilitas protein.
Polimorfisme gen NAT2 dapat diidentifikasi dengan PCR
menggunakan primer yang sesuai untuk mendeteksi missense
substitusi tertentu yang telah dikenal sangat polimorfik, sehingga
apabila terjadi polimorfisme, maka tidak akan dapat diamplifikasi
dengan PCR. Gen kontrol positif seperti GAPDH dan ß-actin juga
harus diamplifikasikan pada saat bersamaan untuk mengontrol bahwa
metode PCR berjalan dengan baik dalam mengamplifikasi sekuens
DNA target.

Manfaat polimorfisme :
§ Farmakogenetik, yang mempelajari pengaruh variasi genetik oleh
adanya perbedaan “satu nukleotida” pada gen-gen yang
bertanggung jawab terhadap respon obat. (misalnya efek dan
toksisitas).
§ Forensik/sidik jari DNA
Mencocokan sampel dari tersangka dengan sampel yang
ditemukan di tempat kejadian (sampel darah, liur, air mani),
mengidentifikasi mayat, analisis kekerabatan.
§ Mempelajari populasi dan migrasi antar populasi hewan.
§ Mengetahui komposisi makanan.
§ Mempelajari pola evolusi manusia hewan maupun tanaman.
§ Standardisasi tanaman obat.

Desain primer
Desain primer yang baik akan menentukan keberhasilan PCR. Oleh
sebab itu ketika mendesain primer perlu mempertimbangkan
beberapa hal, diantaranya sebagai berikut:
1. Panjang primer: secara umum primer yang baik memiliki panjang
18-30 nukleotida.
Primer melting temperature (Tm): merupakan temperature dimana
setengah dari dupleks DNA akan berdisosiasi menjadi untai
tunggal, sehingga Tm menggambarkan stabilitas dupleks DNA.
Primer dengan Tm 52-58 °C biasanya menghasilkan produk paling
29 dari 62
 baik. Banyaknya G dan C dalam sekuens primer akan memberikan
gambaran Tm-nya.
2. Primer annealing temperature.
3. GC content: banyaknya basa G dan C berupa persentase terhadap
total basa di dalam sekuens primer tersebut, sebaiknya adalah
sebanyak 40-60%.
4. Hindari primer secondary structures (GC rich atau AT rich), karena
akan mempengaruhi annealing antara template dan primer
sehingga mempengaruhi amplifikasi dan pada akhirnya akan
menghasilkan produk PCR yang sedikit atau bahkan tidak ada.
5. Hindari cross homology: untuk menjamin bahwa primer tidak akan
mengamplifikasi gen lain yang mungkin terdapat di dalam
campuran template DNA, maka hindari daerah homologi ketika
mendesain primer.
Ada beberapa software yang dapat diakses secara gratis untuk
membantu kita mendesain primer, diantaranya adalah:
-Primer3
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
-Primer-BLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Pada acara praktikum kali ini, selain melakukan PCR

terhadap gen NAT2 juga akan dilakukan analisis SNP pada gen NAT2
dan mencoba mengoperasikan program desain primer pada database
NCBI.

C. Bahan
1. DNA manusia hasil isolasi (prosedur isolasi sesuai dengan
praktikum I)
2. Primer oligonukleotid: forward (F) dan reverse (R) untuk NAT2
manusia (NG_012246.1) dan GAPDH, dengan urutan sekuens
sebagai berikut :

30 dari 62
 NAT2 (primer Forward) 5'- TCAGCCTCAGGTGCCTTGCA-3'
NAT2 (primer Reverse) 5'- AGCATGAATCACTCTGCTTC-3'
GAPDH (primer 5’- TCCACTGGCGTCTTCACC -3’
Forward)
GAPDH (primer 5’- GGCAGAGATGATGACCCTTTT -
Reverse) 3’

Primer dilarutkan dalam aquades steril sehingga diperoleh

konsentrasi 100 µM. Selanjutnya larutan dapat disimpan pada suhu -
20oC selama 1-2 tahun.
1. dNTP 25 mM (termasuk dalam PCR kit)
2. aquabidest steril
3. Taq DNA polymerase (termasuk dalam PCR kit)
4. Tabung polipropilen steril mikrosentrifuge 1,5 dan 0,2 mL
5. Thermal cycler
6. enzim restriksi BamHI sebesar 5 unit
7. 10x Buffer M

D. Langkah Kerja
[A] PCR
1. Buatlah campuran reaksi sesuai dengan komposisi berikut
(bergantung kit reagent yang digunakan) untuk praktikum kali ini
digunakan PCR kit dari Promega, yaitu Go Taq Green Master Mix
(no. katalog M7122).
Reaksi dilakukan dalam tabung Eppendorf 0,5 ml yang telah
diseterilkan dengan komposisi seperti terlihat pada tabel 1. Volume
akhir dalam reaksi tersebut dibuat 25 µL, sehingga perlu
diperhitungkan jumlah aquabidestilata yang diperlukan. Perlu
diperhatikan bahwa penambahan template DNA dilakukan paling
akhir.

31 dari 62
 Tabel Reaksi PCR
Reagen Volume reagen Konsentrasi
akhir
2x PCR Master Mix 12,5 µL 1x PCR buffer
(mengandung Taq DNA
polymerase; 4 mM MgCl2 dan
400 µM tiap dNTP)
(2 mM MgCl2 dan
200 µM tiap
dNTP)
0,5 µM primer NAT2 5 0,125 µL 0,0025 µM
0,5 µM primer NAT2 4 0,125 µL 0,0025 µM
0,5 µM primer GAPDH -F 0,125 µL 0,0025 µM
0,5 µM primer GAPDH-R 0,125 µL 0,0025 µM
Template DNA Tergantung 100 ng
konsentrasi
DNA
Aqua bidestilata Menyesuaikan
TOTAL volume 25 µL

2. Lakukan setting alat PCR dengan parameter sebagai berikut:

Cycle Temp (oC) Durasi (min) Step
1 95 5 Denaturation
35 95 0,5 (30 s) Denaturation
35 50 40 s Annealing
35 72 40 s Extension
1 72 7 Final
extension
- 4 ~ Cooling

3. Masukkan campuran reaksi ke cycler thermal dan mulai

running PCR.

32 dari 62
 4. Selanjutnya dilakukan digesting (pemotongan) terhadap DNA
hasil PCR yang berukuran 710 bp menggunakan
endonuclease restriction enzyme, BamHI, pada suhu 37°C
selama semalam. Tahap ini dimaksudkan untuk
mendeteksi adanya substitusi missense pada posisi 857 atau
G857A (NAT2*7), fenotip asetilator lambat.
Komposisi untuk digesting (total volume 20 µL), disiapkan
dalam 0,6 mL atau 1,5 mL eppendorf tube:
DNA sampel (~0,3 µg) µL
10X Buffer BamHI 2 µL
BamHI (10 U/µL) 1 µL
dH2O (menyesuaikan) µL
Total 20 µL
Di akhir digesting, tambahkan ke dalam tube, buffer sampel
(lihat Percobaan III) sebanyak 2 µL, homogenkan dengan
jalan mengetuk tube pelan-pelan.
5. Optimasi kondisi PCR perlu dilakukan sebelum analisis
sampel.
6. Hasil PCR disimpan pada -20°C (selama menunggu
dilakukan analisis).
7. Lakukan analisis hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa
2% (b/v) dan kemudian divisualisasi dengan pengecatan
menggunakan GelRed™ (Percobaan III).

[B] Analisis SNP pada NAT2

1. Buka Short Genetic Variation pada database NCBI melalui
link berikut:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=10
490924
2. Identifikasi hal berikut:
a. Tipe variasi genetik
b. Kedudukan SNP terhadap mRNA
c. Posisi SNP masing-masing pada sekuens gen, pada
sekuens mRNA, dan pada sekuens protein
d. Perubahan alel pada SNP tersebut
e. Perubahan residu asam amino akibat SNP tersebut
33 dari 62
[C] Mencoba desain primer dengan software pada NCBI
1. Buka sequens nukleotida NG_012246.1

2. Klik link Pick Primer (di sisi kanan tampilan)

3. Klik Get Primers (di sisi paling bawah tampilan

34 dari 62
E. Pertanyaan
1. Hitung Tm masing-masing primer!
2. Sekuens apakah yang dikenali (recognition/restriction site) oleh
enzim BamHI?
3. Satuan enzim restriksi adalah unit/µL, jelaskan arti satuan
tersebut terkait dengan aktivitas enzim restriksi!

35 dari 62
 PERCOBAAN
IV ANALISIS DNA DENGAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
(Prof. Dr. Sismindari, SU., Apt.)

A. Tujuan
a. Mahasiswa dapat melakukan analisis kualitatif dengan
elektroforesis gel agarosa.
b. Mahasiswa dapat melihat polimorfisme gen NAT2 pada manusia
melalui pengamatan elektroforesis gel agarosa dari DNA hasil
amplifikasi dengan PCR.

B. Pendahuluan
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul
dalam suatu campuran dibawah pengaruh medan listrik. Molekul
terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan
yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh, jika
dua molekul mempunyai masa dan bentuk yang sama, molekul
dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode.
Elektroforesis gel agarosa adalah metode untuk memisahkan dan
memvisualisasikan fragmen DNA, termasuk yang dihasilkan dari
digesti DNA. Fragmen DNA dipisahkan, berdasarkan ukurannya,
dengan melewatkan DNA melalui matriks pori-pori gel agarosa yang
diletakkan pada medan listrik. Elektroforesis DNA melalui gel agarosa
merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi dan
pemurnian fragmen DNA.
Agarosa, yang disari dari ganggang laut, merupakan polimer
dengan dasar struktur D-galaktosa dan 3,6-anhidro L-galaktosa.
Ketika dipanaskan dalam bufer, agarosa akan melarut, kemudian
ketika didinginkan akan membentuk padatan berupa gel berpori-pori,
sehingga dimungkinkan untuk mencetak dan membentuk lubang
sumuran pada gel. Gel agarosa mempunyai daya pemisahan lebih
rendah jika dibandingkan dengan gel poliakrilamid, tetapi mempunyai
rentang pemisahan lebih besar. DNA dengan ukuran 200 basa
sampai 50 kilobasa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan
berbagai konsentrasi agarosa. Elektroforesis menggunaan gel
36 dari 62
agarosa (Gambar III-1) biasanya dilakukan dalam konfigurasi
horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap.

Gambar III-1. Gambaran cara kerja elektroforesis DNA menggunakan

gel agarosa. A. Pembuatan gel agarosa, pemasukan sampel pada sumuran
dan elektroforesis. B. Pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukuran.

Gel agarosa dibuat dengan melarutkan agarosa dalam buffer,

kemudian dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai mengeras.
Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan kerapatan
yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan listrik diberikan
antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral,
37 dari 62
bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan oleh ukuran
(panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran
tegangan yang digunakan. Molekul DNA untai ganda linier, yang
diletakkan pada salah satu ujung gel, bergerak melalui matriks gel
pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log jumlah pasang
basa. Molekul yang lebih besar bergerak lebih lambat karena terjadi
gesekan lebih besar saat mereka harus melewati pori-pori gel,
sehingga lajunya terhambat daripada molekul yang lebih kecil
(Gambar III-1).
DNA tidak berwarna maka untuk visualisasi atau mendeteksi
adanya DNA yang paling mudah adalah dengan menggunakan
etidium bromid, suatu senyawa berfluoresensi oleh adanya sinar UV.
Etidium bromid mampu berikatan dengan DNA, termasuk yang
terdapat pada gel agarosa atau poliakrilamid. Senyawa ini bersifat
karsinogenik sehingga harus diperlakukan dengan sangat hati-hati.
Hal ini disebabkan karena etidium bromid berinterkalasi diantara untai
sepanjang molekul DNA. Radiasi ultraviolet pada 254 nm diabsorbsi
oleh DNA dan ditransmisikan pada etidium bromid; radiasi pada 302
nm 366 nm diserap oleh etidium bromid. Pada kedua keadaan ini
energinya dipancarkan pada 590 nm pada daerah jingga-merah.
Etidium bromid dapat digunakan untuk deteksi baik asam nukleat
untai tunggal maupun untai ganda (RNA dan DNA), akan tetapi
afinitas etidium bromid pada asam nukleat untai tunggal relatif rendah
dan hasil fluoresensinya kurang jika dibandingkan dengan untai
ganda. GelRed™ merupakan generasi baru dari pewarna DNA
fluoresens sebagai pengganti etidium bromid yang toksik. Selain itu
GelRed™ memiliki sensitivitas dan stabilitas yang lebih baik daripada
etidium bromid.

C. Bahan Amplifikasi
c. DNA mamalia hasil isolasi (percobaan 1) dan DNA hasil PCR
(percobaan 2)
d. TBE 5x (per liter)
Tris basa 0, 45 M 54 g
Asam borat 0,45 M 27,5 g
EDTA 0,5M (pH 8,0) 20 mL
38 dari 62
 Aqua bidestilata ad 1 L
e. Agarosa 0,8% dan 2% b/v dalam TBE1x

Tabel Rentang Pemisahan Berdasarkan Konsentrasi Agarosa

Jumlah agarosa Rentang pemisahan
dalam gel % (b/v) DNA linier (kb)
0,3 5 – 60
0,6 1 – 20
0,7 0,8 – 10
0,9 0,5 – 7
1,2 0,4 – 6
1,5 0,2 – 3
2,0 0,1 – 2

f. Buffer elektroforesis
Encerkan TBE stok dengan air sehingga kekuatannya 1x

g. Buffer Sampel atau loading buffer

Bromfenol biru 0,25%
Ksilen sianol 0,025%
Gliserol 30% dalam air

h. PAGE GelRedTM 10,000X

Larutan harus disimpan dalam tabung yang terlindung dari
cahaya matahari (berwarna gelap atau dibungkus kertas
aluminium). PAGE GelRedTM 10,000X ditambahkan ke gel
agarosa dengan pengenceran 10.000. Misalnya, tambahkan
5 uL larutan stok 10,000X PAGE GelRedTM ke dalam 50 mL
larutan. Gunakan sarung tangan jika bekerja dengan larutan
ini.

39 dari 62
D. Langkah Kerja
Gunakan selalu sarung tangan selama mengerjakan acara
praktikum ini!

i. Buat larutan TBE dalam aquadest dengan konsentrasi 1x

sebanyak 50 mL, masukkan kedalam labu erlenmeyer 200 ml,
tambahkan 0,4 g agarosa (konsentrasi 0,8%) atau 1 g
(konsentrasi 2%). Larutkan agarosa dengan pemanasan
microwave sehingga semua agarosa larut, mendidih. Dinginkan
sesaat.
j. Tambahkan 2.5 µL larutan GelRed™ ke dalam larutan agarosa,
aduk perlahan.
k. Tuang larutan agarosa ke dalam cetakan hingga memenuhi
cetakan. Tekan pelan-pelan cetakan berisi larutan agarosa panas
tersebut dengan pangkal tip 1 mL untuk membuang gelembung
udara yang terperangkap di bawah cetakan.
l. Gelembung udara yg terjebak di bawah cetakan perlu dihilangkan
untuk menghindari kebocoran gel. Setelah itu, masukkan
garu/sisir ke dalam larutan agarosa panas, kemudian diamkan
sampai agarosa mengeras membentuk gel.
m. Masukkan gel ke dalam chamber elektroforesis yang telah berisi
TBE 1x. Volume TBE harus penuh, menutupi gel agarosa.
n. Penyiapan sampel DNA (untuk DNA hasil isolasi) dengan volume
akhir 10 µL : Masukkan 3-5 µL DNA hasil isolasi dalam eppendorf
tambahkan 2 µL bufer sampel dan tambahkan akuades steril
sampai volume 10 µL.
Penambahan buffer sampel jumlahnya disesuaikan dengan
volume akhir larutan yang akan dielektroforesis, yaitu 2 µL untuk
10 µL larutan atau 4 µL untuk 20 µL larutan.
Untuk DNA hasil PCR telah disiapkan pada Percobaan II, dari
total vol 20 µL dimasukkan 10 µL ke dalam gel.
Masukkan marker DNA 100 bp sebanyak 5 µL di sumuran
pertama.
o. Masukkan larutan tersebut tepat pada sumuran gel hasil cetakan
garu/sisir.

40 dari 62
 p. Nyalakan power supply pada 70 V (max 100 V), tunggu kurang
lebih selama 45 menit (sampai terjadi pemisahan yang
diinginkan).
q. Matikan elektroforesis dan amati gel agarosa di bawah lampu UV.

Catatan: Adanya pengotor RNA akan terlihat di bawah karena

ukurannya kecil. Jika digunakan beda potensial tinggi maka
resolusi menjadi lebih rendah.

E. Analisis Hasil
r. Analisis DNA mamalia hasil isolasi
Lakukan analisis apakah DNA hasil isolasi sudah murni atau
masih banyak pengotor yang ditunjukkan oleh banyaknya
fragmen-fragment kecil.
3. Analisis polimorfisme dari hasil PCR untuk mendeteksi
substitusi missense G857A pada gen NAT2 (NAT2*7A):
- Preparasi sampel serta PCR berjalan baik jika pita gen kontrol
(GAPDH) muncul pada hasil elektroforesis.
- Setelah direstriksi dengan enzim BamHI, alel A (missense)
akan tetap utuh menghasilkan fragmen 710 bp, sedangkan
alel G (wild type) (missense) akan terpotong oleh enzim
BamHI, meghasilkan dua fragmen 431 bp dan 279 bp.

41 dari 62
 Gambar III-2. Hasil elektroforesis restriksi produk PCR-RFLP NAT2. L1
= marker DNA 25 kbp; L2 = Tag1; L3 = Kpn1 A; L4 = Dde1; L5 = BamHI; L6
= marker DNA 50-bp; L7 = marker DNA 100-bp.

F. Pertanyaan
s. Bagaimana interaksi DNA dengan etidium bromida dan
GelRed™?
t. Pada elektroforesis hasil PCR-RFLP, mengapa digunakan gel
agarosa 2%? Bagaimana jika digunakan gel agarosa 0,8%

42 dari 62
 PERCOBAAN V
PENGENALAN KULTUR SEL MAMALIA DAN PENGGUNAANNYA
UNTUK UJI SITOTOKSISITAS
(Dr. Puji Astuti, M.Sc., Apt., Dr. Riris Istighafri Jenie, M.Si., Apt dan Dr.
Muthi Ikawati, M.Sc., Apt.)

A. TUJUAN
1. Mahasiswa mengenal jenis-jenis kultur sel-sel mamalia.
2. Mahasiswa mampu memanfaatkan dan menggunakan sel
mamalia untuk pengujian sitotoksisitas suatu senyawa.

B. PENDAHULUAN
Kultur sel mamalia adalah kultur sel yang sebelumnya tumbuh
dalam tubuh manusia atau hewan yang mengalami modifikasi untuk
ditumbuhkan dalam wadah plastik atau gelas. Sel tersebut disimpan
dalam inkubator menyesuaikan dengan temperatur tubuh dan
ditumbuhkan dalam media khusus dengan nutrien. Sel dapat
dipisahkan langsung dari jaringan dan didisintegrasi dengan reaksi
enzimatis atau mekanik sebelum dikulturkan, atau dapat diturunkan
dari suatu cell line atau strain sel yang sudah ada.
Dalam kultur sel mamalia, dikenal kultur yang disebut Kultur
Primer, yaitu kultur sel yang diperoleh dari hasil isolasi jaringan dan
berproliferasi dalam kondisi yang sesuai sampai mereka menempati
seluruh tempat tumbuh (mencapai confluence). Pada tahap ini, sel
harus disubkultur dengan cara memindahkannya ke dalam tempat
tumbuh yang baru berisi media baru untuk melanjutkan pertumbuhan.
Setelah subkultur pertama, sel kultur primer disebut suatu cell line
atau subclone. Cell line yang diturunkan dari kultur primer mempunyai
waktu hidup terbatas, dan seiring proses subkultur, sel dengan
kapasitas pertumbuhan tertinggi akan mendominasi, menghasilkan
suatu tingkat keseragaman genotip dan fenotip dalam populasi. Jika
suatu subpopulasi suatu cell line diseleksi dari kultur dengan cloning
atau dengan metode lain, cell line ini menjadi suatu cloned cell strain.
Suatu strain sel kadang mengalami penambahan perubahan genetik
setelah pembuatan parent line.
Sel normal umumnya membelah dengan jumlah terbatas sampai
43 dari 62
 kemudian hilang kemampuan berproliferasi, suatu kejadian genetik
yang disebut senescence; cell line ini disebut finite. Namun, beberapa
cell line menjadi immortal melalui proses yang disebut transformasi,
dapat terjadi secara spontan atau dapat diinduksi secara kimia atau
diperantarai virus. Ketika suatu finite cell line mengalami transformasi
dan memiliki kemampuan membelah tidak terbatas, maka sel tersebut
menjadi suatu continuous cell line.
Penggunaan sel mamalia dalam dunia kesehatan dan farmasi
sangatlah luas, diantaranya adalah untuk uji sitotoksisitas. Uji
sitotoksisitas digunakan secara luas dalam industry farmasi untuk
skrining sitotoksisitas “compound libraries”. Peneliti dapat
mengunakan senyawa sitotoksik dalam dua hal yaitu pengembangan
obat-obatan yang mentarget “rapidly dividing cancer cells”, atau
skrining "hits" dari “high-throughput drug screens”, uji awal untuk
mencari efek sitotoksik yang tidak diinginkan sebelum dikembangkan
sebagai obat.

C. ALAT DAN BAHAN

1. Alat
Mikroskop, pipet mikro, alat gelas, petri dish, hemocytometer, plate
reader, cell counter, plate 96 sumuran, eppendorf tubes, falcon
tubes
2. Bahan
Cell line mamalia, RPMI media, trypan blue, PBS, Trypsin EDTA,
MTT, 10% SDS

D. LANGKAH KERJA
1. Pengamatan jenis-jenis sel mamalia;
- Gambarlah dalam laporan sementara yang disediakan
morfologi jenis- jenis sel mamalia dalam kultur.
2. Memanen dan Menghitung sel langsung (direct counting)
dengan hemocytometer
a.) Kultur sel mamalia dalam 6 well plate dicuci dengan PBS
hangat.
44 dari 62
 b.) Tambahkan trysin-EDTA 1 mL dalam tiap well, inkubasi 1 –
2 menit.
c.) Panen sel dengan cara di ‘tapping’, tambahkan 1 mL PBS
hangat dan dimasukkan dalam tabung 10 mL, sentrifugasi
dengan kecepatan 2000 rpm selama 2 menit.
d.) Buang supernatan, resuspen sel dengan 500 µL PBS.
e.) Ambil 50 µL suspense sel, masukkan dalam tabung
eppendorf, tambahkan PBS 100 µL (atau menyesuaikan
kerapatan sel) dan 50 µL trypan blue. Homogenkan.
f.) Masukkan 12 µL ke dalam alat hemocytometer hati-hati.
g.) Hitung jumlah sel yang mati dan sel yang hidup dengan
inverted microscope perbesaran 10 X

Jumlah sel/mL = Rata-rata jumlah sel per kotak X factor pengenceran X 104

45 dari 62
 Gambar V-1. Cara menghitung sel

Gambar V-2. Sel yang di cat Trypan blue

46 dari 62
3. Menghitung sel secara tidak langsung (indirect counting)
dengan MTT assay untuk pengujian sitotoksitas suatu
senyawa
Hari I (inokulasi sel) – dilakukan teknisi
a.) Sel pada fase log (70-80% confluence) dipisahkan dari dasar
flask dengan trypsinisasi.
b.) Cek viabilitas dengan haemocytometer. Lakukan penyesuaian
kerapatan sel pada plate 96 sumuran.
c.) Inkubasi pada 37°C 5% CO2/ 95% kelembaban udara selama
24–48 jam sampai diperoleh kerapatan sel 70–80% confluence
dan sel tampak tumbuh berkoloni.
d.) Pembuatan larutan stok sampel uji : Sampel ditimbang
sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan dalam DMSO steril
100μL, sehingga diperoleh konsentrasi 100 μg/μL. Dari larutan
induk tersebut dilakukan pengenceran dalam media hingga
didapatkan seri konsentrasi.
Hari II (Perlakuan pada sel) – dilakukan teknisi
a.) Ambil media pada plate 96 sumuran dan ganti dengan media
yang mengandung senyawa yang kita uji (lakukan pada pagi
hari). Berikan control negatif dan blanko.
b.) Inkubasi pada 37°C; 5% CO2 /95% kelembaban udara selama
24 jam.
Hari III (Pemeriksaan Tingkat Kematian dengan MTT assay) –
lakukan pertama kali pada hari praktikum
a.) Status/tingkat kematian sel setelah pemberian senyawa
dilakukan dengan MTT assay. Pada akhir perlakuan yang
dilakukan dalam plate 96 sumuran, ke dalam masing-masing
sumuran ditambahkan 100 μL MTT dalam media RPMI
(konsentrasi akhir 0,5 mg/mL). Sebelumnya, cuci media terlebih
dahulu dengan PBS apabila senyawa uji menimbulkan warna.
Kemudian plate diinkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37°C
hingga terbentuk formazan. Sel yang hidup akan bereaksi
dengan MTT membentuk kompleks berwarna ungu. Setelah 3.5
jam reaksi MTT dihentikan dengan menambahkan 100 μL
reagen stopper SDS 10% pada masing-masing sumuran,

47 dari 62
 homogenkan lalu serapan dibaca dengan ELISA reader pada
panjang gelombang 570 nm.

b.) Analisis

(Absorbansi sel perlakuan − blanko)

% Viabilitas sel (% reduksi MTT) = × 100%
(Absorbansi sel tanpa perlakuan − blanko)

48 dari 62
 PERCOBAAN
VI BIOINFORMATIKA UNTUK ANALISIS EKSPRESI GEN
DENGAN GEO DAN DAVID
(Prof. Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt. dan Dr. Adam Hermawan, M.Sc., Apt.)

A. Tujuan
1. Mahasiswa menganalisis Differential Expressed Genes (DEGs)
akibat perlakuan senyawa atau kondisi patologis menggunakan
database.
2. Mahasiswa menganalisis fungsi DEGs pada proses biologis
seluler, komponen seluler, dan pathway molekuler.

B. Pendahuluan
Gen adalah segmen DNA yang berisi semua informasi yang
diperlukan untuk membuat kode untuk suatu fungsi. Gen juga
merupakan unit informasi yang ditransfer melalui transkripsi dan
translasi. Analisis ekspresi gen dilakukan untuk:
1. Menentukan gen mana yang diinduksi / ditekan sebagai respons
terhadap fase perkembangan, perubahan lingkungan, atau
pengobatan obat.
2. Kumpulan gen yang ekspresinya naik dan turun dalam kondisi
yang sama kemungkinan besar memiliki fungsi terkait.
3. Pola ekspresi gen dapat digunakan sebagai indikator regulasi
seluler yang abnormal.

Regulasi ekspresi gen dilakukan untuk mengontrol dengan

benar jumlah produk fungsional (protein) aktif yang ada dalam sel
atau organisme. Semua sel memiliki kumpulan gen yang sama.
Jenis sel yang berbeda mengekspresikan subset yang berbeda dari
gen mereka (Gambar V-1). Gen konstitutif diekspresikan di
sebagian besar tipe sel. Gen spesifik tipe sel diekspresikan hanya
dalam beberapa tipe sel. Perubahan lingkungan internal atau
eksternal sel dapat menyebabkan perubahan ekspresi gen.
Sebagian besar penyakit manusia bermanifestasi melalui salah
regulasi ekspresi gen.

49 dari 62
 (A) (B)

Gambar V-1. Skema ekspresi gen pada (A) dua jenis sel yang berbeda
dan (B) akibat perlakuan senyawa.

Beberapa teknik yang digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen

adalah:
• Northern Blots
• qRT-PCR
• Microarray (single or dual channel)
• SAGE
• EST/cDNA library
• Subtractive hybridisation
• Differential hybridisation
• Representational difference analysis (RDA)
• DNA/RNA Fingerprinting (RAP-PCR)
• Differential Display (DD-PCR)
• aCGH: array CGH (DNA level)

Pada era revolusi industri 4.0 ini, kita bisa memperoleh

informasi ekspresi gen dari berbagai macam database. Pada
praktikum kali ini mahasiswa akan menganalisis ekspresi gen yang
datanya disimpan pada database publik Gene Expression Omnibus
(GEO), menggunakan software berbasis R bernama GEO2R.
Selanjutnya mahasiswa akan menganalisis fungsi dan pathway dari
50 dari 62
gen-gen yang diregulasi akibat perlakuan senyawa, menggunakan
database DAVID.

C. Langkah kerja
1. Buka halaman Gene Expression Omnibus (GEO)
(http://ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Masukkan kode GSE yang telah
diberikan sesuai kelompok masing-masing.

Hasil pencariannya akan muncul tampilan sebagai berikut:

51 dari 62
2. Klik tombol Analyze with GEO2R

52 dari 62
3. Hasilnya akan muncul tampilan sebagai berikut. Kemudian pilih
kode sampel (GSM) sesuai dengan kode sampel setiap
kelompok.

4. Periksa value distribution setiap kode sampel

53 dari 62
5. Klik tombol GEO2R, lalu klik top250

Hasilnya akan muncul tampilan sebagai berikut:

54 dari 62
6. Ubah setting untuk menampilkan gene name and gene symbol,
dengan cara klik tombol Select columns sesuai tampilan berikut
ini:

Hasilnya akan muncul tampilan sebagai berikut:

55 dari 62
7. Kemudian klik tombol save all results untuk menampilkan semua
data ekspresi gen. Hasilnya akan muncul tampilan sebagai berikut
ini:

8. Copy data ke file Ms Excel

56 dari 62
9. Lakukan sortasi data dengan p value < 0.05, dan llog FCI>1

upregulated -> ekpresinya meningkat; downregulated -> ekspresinya menurun

10. Tentukan differential expressed genes (DEGs) yang meliputi
upregulated genes (gen-gen dengan log FC>1 ) serta
downregulated genes (gen-gen dengan log FC<-1)

57 dari 62
11. Lakukan analisis functional annotation terhadap semua DEGs
menggunakan database DAVID
(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Pilih START analysis, klik
lalu upload dan Copykan semua DEGs ke kolom enter ID. Pilih
OFFICIAL GENE SYMBOL, organisme homo sapiens dan gene
list lalu klik submit.

Hasil analisis akan muncul tampilan sebagaiberikut:

58 dari 62
Pilih spesies yang diinginkan dalam hal ini Homo sapiens, list, lalu
klik use dan functional Annotation sehingga akan muncul tampilan
sebagai berikut:

Pilih KEGG pathway, klik, dan akan muncul tampilan sebagai berikut:

59 dari 62
Untuk mendownload, klik download file, lalu akan muncul tampilan
sebagai berikut, dan ekspor hasil ke Ms Excel

Hasil analisis gene ontology akan muncul tampilan sebagaiberikut.

Pilih BP direct, CC direct atau MF direct yang berwarna merah.
Untuk megekspor, lakukan cara yang sama dengan tahapan pada
KEGG pathway di atas

60 dari 62
D. Tugas
1. Mahasiswa akan diberi suatu kode GSE dan sampel yang harus
dianalisis.
2. Tentukan Differential Expressed Genes (DEGs)!
3. Lakukan analisis functional annotation terhadap DEGs!
4. Kerjakan lembar kerja secara berkelompok.

61 dari 62
 DAFTAR PUSTAKA

Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory

Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York.

Davis, L.G., Kuehl, W. M., and Battey, J. F., 1994, Basic Methods in
Molecular Biology 2nd Edition, Appleton and Lange, Norwalk,
Connecticut.

Jurnal internasional ter-update

62 dari 62