Jurnal 1
Jurnal 1
DESTIK WULANDARI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Destik Wulandari
NIM G353120151
RINGKASAN
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
REKAYASA GENETIK Nicotiana tabacum KULTIVAR
SR1 DENGAN GEN Peroksidase (PerL) DARI KEDELAI
KULTIVAR LUMUT
DESTIK WULANDARI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biologi Tumbuhan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Diah Ratnadewi, DEA
Judul Tesis : Rekayasa Genetik Nicotiana tabacum Kultivar SR1 dengan Gen
Peroksidase (PerL) dari Kedelai Kultivar Lumut
Nama : Destik Wulandari
NIM : G353120151
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Diketahui oleh
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2014-oktober 2014
ini ialah rekayasa genetik, dengan judul Rekayasa Genetik Nicotiana tabacum
Kultivar SR1 dengan Gen Peroksidase (PerL) dari Kedelai Kultivar Lumut.
Penelitian ini merupakan bagian dari kegiatan Hibah Penelitian Unggulan
Perguruan tinggi DIKTI 2014 atas nama Dr Ir Utut Widyastuti, MSi dengan judul
Perbaikan Genetik Tumbuhan Kedelai terhadap Cekaman Asam melalui Teknik
DNA Rekombinan Gen Antioksidan GST (Glutathione S-Transferase) dan Per
(Peroksidase), dengan nomor kontrak: 79/IT3.41.2/L1/SPK/2014 tanggal 28 Mei
2014.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Utut Widyastuti dan Bapak
Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA selaku pembimbing, dan Prof Dr Ir Suharsono,
DEA selaku kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB) IPB yang telah mengijinkan penulis melakukan penelitian di PPSHB
IPB. Terimakasih kepada Dr Diah Ratnadewi selaku dosen penguji luar komisi
atas masukkan dan sarannya sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terimakasih
penulis ucapkan pula kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi yang telah
memberikan Beasiswa Unggulan Calon Dosen. Terimakasih kepada Ibu Pepi
Elvavina, Ibu Nia Dahniar dan Bapak Abdul Mulya selaku teknisi yang telah
banyak membantu dalam penelitian ini. Ungkapan terimakasih penulis sampaikan
untuk bapak, ibu, kakak, adik dan keluarga untuk semua doa dan semangat yang
luar biasa dalam menyelesaikan tesis ini. Terimakasih juga penulis sampaikan
kepada sahabat dan keluarga plant genetic and engineering 2012; Baso, Mas
Rudi, Tiwi, Mbak Fajri dan Mbak Eva. Terimakasih kepada keluarga besar
Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherland (BIORIN),
Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tumbuhan (BMST) PPSHB, dan
keluarga besar Biologi Tumbuhan Departemen Biologi IPB 2012. Semoga karya
ilmiah ini bermanfaat.
Destik Wulandari
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 2
TINJAUAN PUSTAKA 2
Peroksidase 2
Transformasi Genetik dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens 3
Transformasi Genetik Nicotiana tabacum 4
METODE 5
Waktu dan Tempat Penelitian 5
Bahan Penelitian 5
Metode 6
HASIL DAN PEMBAHASAN 10
Introduksi cDNA Gen PerL ke dalam Entry Vector pENTRTM/D-TOPO® 10
Pengklonan cDNA gen PerL ke dalam Vektor Ekspresi pGWB502 11
Introduksi plasmid pGWB502-PerL ke dalam Agrobacterium tumefaciens
LBA4404 13
Transformasi Genetik Nicotiana tabacum Kultivar SR1 14
SIMPULAN DAN SARAN 16
Simpulan 16
Saran 16
DAFTAR PUSTAKA 16
DAFTAR GAMBAR
1 Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara PerL (1) dan 3
Per G. max l78163 (2) dari Genebank (Amirullah 2008)
2 Peta plasmid pENTRTM/D-TOPO® dengan daerah overhang GTGG dan gen 7
penyandi ketahanan antibiotik kanamisin
3 Rekombinasi pada sistem gateway cloning antara situs attL1 dan attL2 yang 7
mengapit gen PerL (plasmid pENTR-PerL) dengan situs attR1 dan attR2
yang mengapit daerah ccdB (plasmid pGWB502)
4 Hasil perbanyakan cDNA gen PerL menggunakan PCR dengan primer PerL- 10
pENTR-F dan AtprxCb-R
5 Hasil identifikasi koloni E. coli yang mengandung pENTR-PerL 11
menggunakan PCR dengan primer PerL pENTR-F dan AtprxCb-R
6 Peta konstruksi plasmid rekombinan pGWB502 yang membawa cDNA gen 12
PerL (pGWB502-PerL)
7 Hasil PCR koloni bakteri E.coli DHSα yang telah ditransformasi dengan 12
plasmid pGWB502-PerL
8 Hasil pemotongan plasmid pGWB502-PerL dengan enzim restriksi 12
Xba dan Sac1
9 Identifikasi DNA rekombinan menggunakan PCR koloni dengan primer 13
35SF dan AtprxCb-R
10 Pertumbuhan dan perkembangan N.tabacum kultivar SR1 hasil transforman. 14
11 Hasil amplifikasi DNA genom N. tabacum kultivar SR1 transgenik putatif 15
menggunakan primer spesifik 35SF dan AtprxCb-R.
DAFTAR LAMPIRAN
Latar Belakang
termasuk dalam golongan secretory peroxidase kelas III pada tumbuhan diketahui
mempunyai fungsi spesifik seperti menghilangkan hidrogen peroksida pada
kloroplas dan sitosol, mengoksidasi senyawa toksik, berperan dalam biosintesis
dinding sel, respon pertahanan akibat dari pelukaan, katabolisme indole acetic
acid (IAA) dan biosintesis etilen (Welinder 1992). Pentingnya peranan
peroksidase dalam mekanisme pertahanan tumbuhan terhadap cekaman abiotik
menyebabkan peroksidase menjadi kandidat gen untuk merakit tumbuhan
transgenik yang tahan terhadap cekaman abiotik.
Teknologi rekayasa genetika yang berkembang pesat memberikan harapan
baru untuk memanipulasi tumbuhan sehingga diperoleh tumbuhan unggul yang
tahan terhadap cekaman abiotik. Konstruksi plasmid dan metode transfer yang
tepat merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perakitan tumbuhan
transgenik. Metode transformasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens
sebagai perantara banyak digunakan karena mempunyai pola integrasi yang stabil
di dalam tumbuhan (Zupan dan Zambryski 1995).
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk merakit vektor ekspresi gen PerL
dan melakukan transformasi ke Nicotiana tabacum kultivar SR1 dengan bantuan
bakteri Agrobacterium tumefaciens.
TINJAUAN PUSTAKA
Peroksidase
2012) dan sel (An 1985; Mayo et al. 2006). Selanjutnya eksplan ditumbuhkan
pada media regenerasi secara in vitro untuk menghasilkan tanaman transgenik.
Media regenerasi sering berfungsi juga sebagai media seleksi dengan penambahan
agen seleksi seperti antibiotik. Antibiotik yang digunakan sesuai dengan gen
ketahanan terhadap antibiotik yang terdapat di daerah T-DNA (Waluyo 2013;
Rahmawati 2003). Antibiotik yang digunakan bersifat racun bagi eksplan non
transgenik, sehingga digunakan sebagai agen seleksi pertama kali pada perakitan
tumbuhan transgenik. Tunas yang hidup pada media seleksi merupakan tunas
transgenik putatif. Perolehan tumbuhan transgenik yang mengandung gen penanda
seleksi menjadi faktor penting untuk mendapatkan tumbuhan transgenik yang
mengandung gen sasaran (Miki dan McHugh 2004).
Mantell et al (1985) menyatakan bahwa beberapa eksplan hasil
transformasi genetik dengan gen cp-SMV tumbuh menjadi kalus dan mengalami
organogenesis yang ditandai dengan pertambahan tinggi dan jumlah daun yang
nyata. Eksplan yang dikulturkan mengalami morfogenesis organ adventif secara
tidak langsung, yaitu membentuk kalus dan selanjutnya dengan dirangsang pada
media baru, kalus akan mengalami morfogenesis membentuk tunas dan daun.
Kultur in vitro tembakau transgenik cp-SMV pada medium MS yang ditambah
NAA 0,3 mg/L dan BAP 1 mg/L dapat menghasilkan kalus yang kemudian
bertunas (Agung-Astuti et al. 2004).
METODE
Bahan Penelitian
Metode
Gambar 3 Rekombinasi pada sistem gateway cloning antara situs attL1 dan attL2
yang mengapit gen PerL (plasmid pENTR-PerL) dengan situs attR1
dan attR2 yang mengapit daerah ccdB (plasmid pGWB502)
8
3% sukrosa, 40 mg/L asetosiringone, 0.3% gelrite, 0.5 mg/L IAA dan 0.5mg/L
BA, selama 3 hari dalam ruangan gelap.
Eksplan hasil ko-kultivasi dicuci dengan air steril sebanyak 3 kali dan
dilanjutkan dengan air steril yang ditambah dengan 200 mg/L cefotaxime,
dikeringkan dengan tissue steril dan kemudian ditanam pada media pengkalusan
(garam MS, vitamin MS, 3% sukrosa, 0.5 mg/L IAA, 0.5 mg/L BA, 200 mg/L
cefotaxime, dan 0.3% gelrite) (lampiran 2) selama 7-10 hari. Setelah itu, eksplan
dipindahkan ke media seleksi (lampiran 2) yang mengandung garam MS, vitamin
MS, 3% sukrosa, 0.5 mg/L BA, 0.5 mg/L IAA, 100 mg/L cefotaxime, 30 mg/L
higromisin dan 0.3% gelrite hingga muncul tunas. Tunas yang panjangnya
mencapai 3-4 cm dipindahkan ke media MS0 hingga terbentuk akar. Tunas yang
sudah menghasilkan akar dipindahkan ke media arang sekam dan dipelihara di
ruang kultur selama satu minggu. Tumbuhan yang mempunyai pertumbuhan baik
dipindahkan ke media tanah dan diletakkan di luar ruangan, kemudian dipelihara
hingga dewasa untuk menghasilkan biji T0.
1000bp
1000bp 1100bp
Gambar 4 Hasil perbanyakan cDNA gen PerL menggunakan PCR dengan primer
PerL-pENTR-F dan AtprxCb-R. M= marka 1kb, 1= gen PerL.
yang mempunyai situs attP1 dan attP2 sebagai tempat rekombinasi gen PerL.
Adanya situs rekombinasi ini menyebabkan tidak terjadinya kesalahan orientasi
keberadaan cDNA gen PerL pada plasmid pENTRTM/D-TOPO®.
M 1 2
1000bp 1100bp
1 2 3 4 M
1500bp 1500bp
Gambar 7 Hasil PCR koloni bakteri E.coli DHSα yang telah ditransformasi
dengan plasmid pGWB502-PerL. 1-4= koloni E.coli transforman,
M=Marka 1kb.
M 1 2
vektor
1100bp
1000bp
1500bp 1500bp
1cm 1cm
d e
M 1 2 3 4 5 6 NT
1500bp
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
pGEM-PerL
PCR
Konstruksi
vektor
Elusi ekspresi
Introduksi ke pENTRTM/D-TOPO®
pENTR-PerL
pGWB502-PerL
A.tumefaciens
LBA4404
Perakitan
tumbuhan
Teknik ko-kultivasi transgenik
Nicotiana tabacum
transgenik
Analisis
Uji integrasi gen tumbuhan
PerL transgenik
20
a. Media infeksi
Garam MS 4.33 g
Vitamin MS 1000x 1 ml
Sukrosa 3%
BA 0.5 mg/L
IAA 0.5 mg/L
Asetosiringon 40 mg/L
ddH2O hingga 1 liter
pH 5.8
b. Media kokultivasi
Garam MS 4.33 g
Vitamin MS 1000x 1 ml
Sukrosa 3%
Gelrite 0.3%
BA 0.5 mg/L
IAA 0.5 mg/L
Asetosiringon 40 mg/L
ddH2O hingga 1 liter
pH 5.8
c. Media induksi tunas
Garam MS 4.33 g
Vitamin MS 1000x 1 ml
Sukrosa 3%
Gelrite 0.3%
BA 0.5 mg/L
IAA 0.5 mg/L
Cefotaxim 200 mg/L
ddH2O hingga 1 liter
pH 5.8
d. Media seleksi
Garam MS 4.33 g
Vitamin MS 1000x 1 ml
Sukrosa 3%
Gelrite 0.3%
BA 0.5 mg/L
IAA 0.5 mg/L
Higromisin 30 mg/L
ddH2O hingga 1 liter
pH 5.8
e. Media induksi akar
Garam MS 4.33 g
Vitamin MS 1000x 1 ml
Sukrosa 3%
Gelrite 0.3%
ddH2O hingga 1 liter
pH 5.8
21
f. Komposisi garam MS
Garam Makro
KNO3 1900 mg/L
NH4NO 1650 mg/L
CaCl2 332.2 mg/L
MgSO4 180.7 mg/L
KH2PO4 170 mg/L
Garam Mikro
Na2EDTA.2H2O 37.26 mg/L
FeSO4.7H2O 27.8 mg/L
MnSO4.7H2O 16.9 mg/L
ZnSO4.7H2O 8.6 mg/L
H3BO3 6.2 mg/L
KI 0.83 mg/L
Na2MoO4 0.25 mg/L
CuSO4.5H2O 0.025 mg/L
CoCl2. 6H2O 0.025 mg/L
g. Komposisi Vitamin MS
Myo-Inositol 100mg/L
Glisin 2 mg/L
Nicotinic acid 0.5 mg/L
Pyridoxine-HCL 0.5 mg/L
Thiamine-HCL 0.1 mg/L
22