KEGIATAN VIII

PEMISAHAN PIGMEN-PIGMEN DAUN DENGAN TEKNIK

KROMATOGRAFI KERTAS

A. TUJUAN
Mahasiswa diharapkan dapat:
1. mengekstraksi pigmen-pigmen yang terdapat dalam daun dengan teknik
kromatografi kertas
2. mengidentifikasi pigmen-pigmen yang terdapat dalam daun hijau.

B. TEORI DASAR
Pemisahan molekul-molekul dari bahan biologis merupakan bagian
penting dalam penelitian biokimia, sering berupa isolasi molekul- molekul dari
suatu campuran komponen dengan sifat yang sangat mirip. Teknik pemisahan
molekul menggunakan perbedaan sifat-sifat fisik dasar dari molekul, misalnya
ukuran, bentuk, massa, muatan, berkaitan dengan: sifat kelarutan dan sifat
absorpsinya. Dasar metode pemisahan – meliputi perbedaan interaksi antara 3
komponen, yaitu 1) zat padat terlarut (molekul yang dipisahkan), 2) pelarut
(fase mobil = fase gerak), dan 3) fase padat (fase statis = fase diam).
Salah satu metode pemisahan molekul-molekul dari bahan biologis adalah
adalah secara kromatografi. Kromatografi berasal dari bahasa Yunani
‘kromatos’ yang berarti warna dan ‘graphos’ yang berarti menulis. Secara
umum kromatografi adalah suatu proses migrasi differensiasi, dimana
komponen-komponen sampel ditahan secara selektif oleh fase diam. Mula-
mula metode ini hanya digunakan untuk memisahkan zat-zat yang mempunyai
warna saja, yaitu pigmen-pigmen tetapi mulai tahun 1930-an kromatografi juga
digunakan untuk memisahkan zat-zat yang tidak berwarna. Metode
kromatografi menggunakan tiga prinsip, yaitu: 1) kelarutan (kecenderungan
suatu molekul untuk larut dalam cairan), 2) absorpsi (kecenderungan suatu
molekul untuk bertaut dengan bahan padat), dan 3) volatilitas (kecenderungan
suatu molekul untuk menguap). Dalam kromatografi, senyawa-senyawa yang

49
akan dipisahkan ditempatkan dalam situasi yang dinamik (gerak) – dialirkan
dalam suatu sistem kromatografi. Perlu dilakukan pemilihan fase gerak dan
fase diam sehingga semua komponen harus dapat gerak dengan kecepatan yang
berbeda-beda. Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa
komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen
yang berbeda gerak pada laju yang berbeda.
Kromatografi kertas merupakan salah satu bagian dari tehnik
pemisahan kromatografi yang paling klasik dan sederhana. Tehnik pemisahan
kromatografi kertas didasarkan pada prinsip adsorpsi fase diam terhadap fase
gerak, dimana yang menjadi fase diamnya adalah kertas Whatman yang khusus
untuk kromatografi yang mengandung serat selulosa, sedangkan yang menjadi
fase geraknya (mobile) adalah eluen yang merupakan pelarut organik. Fase
gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari
campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak
pada laju yang berbeda pula.
Daun yang berwarna hijau sebenarnya mengandung beberapa macam
pigmen, antara lain klorofil a (hijau tua), klorofil b (hijau muda), xantofil
(kuning), dan karoten (jingga). Klorofil   merupakan   pigmen   hijau   
tumbuhan   dan  merupakan pigmen  yang   paling  penting  dalam proses
fotosintesis. Untuk mengetahui bahwa warna hijau dalam daun adalah hasil
campuran beberapa pigmen  maka digunakan metode untuk memisahkan
pigmen-pigmen yang terdapat pada daun. Kelarutan pigmen-pigmen daun
dalam pelarut organik berbeda-beda, sehingga dapat dipisahkan dengan teknik
kromatografi kertas. Adanya perbedaan kelarutan pigmen dalam eluat pada saat
elusi menyebabkan terjadinya pemisahan komponen-komponen pigmen.
Pigmen yang mempunyai kelarutan tertinggi dalam eluat akan mengikuti
pergerakan eluat sepanjang kertas kromatografi sampai jarak yang paling jauh.
Selama pergerakan bersama fase gerak (eluat), solute (pigmen) akan dihambat
atau diadsorpsi oleh fase diam. Besarnya hambatan tersebut dinyatakan dengan
nilai Rf (Retardation factor) dengan rumus:
ds
Rf =
de
Keterangan: - ds= jarak yang ditempuh solut (pigmen)

50
 - de= jarak yang ditempuh eluat (pelarut organik)

Rf merupakan ukuran adsorpsibilitas suatu solut, nilainya selalu < 1. Nilai Rf

merupakan karakteristik suatu zat atau senyawa. Zat tersebut dapat
diidentifikasi berdasarkan harga Rfnya – dibandingkan dengan harga Rf
standar dari literatur.

C. Alat dan Bahan

1. mortar dan pistil 10. pipet tetes
2. corong pemisah 11. pipa kapiler
3. beaker glass 250 ml 12. penggaris
4. pisau 13. daun berwarna hijau
5. gelas ukur 10 ml, 100 ml 14. aseton
6. gelas arloji 15. petroleum eter
7. tabung reaksi bertutup 16. kertas saring
8. rak tabung reaksi 17. kertas kromatografi
9. corong kaca 18.akuades

D. CARA KERJA
1. Timbanglah 5 gram daun yang berwarna hijau, iris-irislah kemudian
geruslah dengan mortar dan pistil sampai halus.
2. Tambahkan 30 ml aseton pada daun tersebut sambil terus digerus.
3. Saringlah suspensi daun ke dalam corong pisah, tambahkan 10 ml petroleum
eter dan kocoklah.
4. Tambahkan 10 ml akuades ke dalam corong pisah, kocok lalu diamkan
beberapa saat sampai memisah, keluarkan akuades dengan memutar kran
corong pemisah. Ulangi proses pencucian ini 3-4 kali sampai tidak berbau
aseton.
5. Keluarkan larutan pigmen daun dari corong pisah, tampunglah dalam gelas
arloji dan biarkan menguap.
6. Siapkan campuran eluat (1 ml aseton dan 9 ml petroleum eter) ke dalam
tabung reaksi, kocok sampai homogen. Ambil 1 ml eluat, masukkan dalam

51
 tabung reaksi yang digunakan sebagai ruang elusi. Tutuplah tabung supaya
jenuh dengan uap eluat.
7. Siapkan kertas kromatografi (17x1,2 cm), lancipkan bagian ujung
bawahnya. Buatlah garis dengan pensil, garis pertama pada jarak 1 cm dari
ujung bawah kertas, garis kedua pada jarak 12 cm dari garis pertama.
8. Ambillah pigmen yang telah agak mengering dengan pipa kapiler, kemudian
buatlah spot pigmen pada bagian tengah garis pertama di kertas
kromatografi.
9. Masukkan kertas kromatografi ke dalam tabung reaksi yang telah jenuh
dengan uap eluat, hati-hati jangan sampai spot pigmen tersentuh eluat,
kemudian tutuplah tabung reaksi.
10. Letakkan tabung reaksi pada rak tabung. Biarkan eluat gerak pada kertas
kromatografi. Jika eluat telah mencapai garis kedua, hentikan elusi dan
keluarkan kerta dari tabung.
11. Amati warna-warna pigmen yang tampak pada kertas, ukurlah ds masing-
masing pigmen dan hitunglah Rf masing-masing.
12. Bandingkan harga Rf yang diperoleh dengan literatur.
13. Tentukan macam pigmen yang ditemukan pada daun berdasarkan harga
Rfnya.

E. DISKUSI
1. a. Jelaskan peran masing-masing komponen dalam kromatografi kertas yang
Saudara lakukan!
b. Jelaskan interaksi antar komponen dalam kromatografi kertas!
2. Jelaskan mengapa ruang tabung elusi harus dijenuhkan dulu dengan uap
eluat!
3. Mengapa eluat tidak boleh menyentuh spot pada saat awal elusi? Jelaskan!
4. Masalah-masalah apa yang saudara jumpai dalam melakukan praktikum
kromatografi kertas? Jelaskan bagaimana solusi terhadap masalah tersebut!

52
53