PEMISAHAN ZAT WARNA SECARA KROMATOGRAFI

LAPORAN PRAKTIKUM

disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Fisiologi Tumbuhan

Dosen Pengampu:
Dr. H. Taufik Rahman, M.Pd
Dra. Hj. Sariwulan Diana, M.Si
Dr. Hj. Sri Anggraeni, M.Si
Hj. Tina Safaria, M.Si

oleh:

Kelompok 6
Kelas Pendidikan Biologi B 2013

Siti Amirah Makarim 1304946

Siti Barkatul Laely 1307117
Siti Komariah Agustina 1304395
Suci Novianti 1307223
Tira Tahnia 1306499

DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
BANDUNG
2016
A. JUDUL
Pemisahan Zat Warna Secara Kromatografi
B. WAKTU DAN TEMPAT PELAKSANAAN
Hari : Rabu
Tanggal : 16 November 2016
Tempat pelaksanaan : Laboratorium Fisiologi
Waktu : 09.30 12.00 WIB
C. RUMUSAN MASALAH
Adapun rumusan masalah yang ingin diselesaikan dalam praktikum ini
adalah bagaimana pemisahan zat warna pada klorofil dengan cara
kromatografi?
D. TUJUAN
Tujuan yang diharapkan dalam praktikum ini adalah mengetahui
pemisahan zat warna pada klorofil dengan cara kromatografi.
E. HIPOTESIS
Zat warna pada klorofil dapat terpisah secara baik dengan cara
kromatografi.
F. DASAR TEORI
1. Klorofil
Klorofil adalah pigmen hijau yang ada dalam kloroplastida. Pada
umumnya klorofil terdapat pada kloroplas sel-sel mesofil daun, yaitu
pada sel-sel parenkim palisade dan atau parenkim bunga karang. Dalam
kloroplas, klorofil terdapat pada membran thylakoid grana. Pada
tumbuhan tingkat tinggi terdapat dua jenis klorofil yaitu klorofil-a dan
klorofil-b. Pada keadaan normal, proporsi klorofil-a jauh lebih banyak
daripada klorofil-b. Selain klorofil, pada membran thylakoid juga
terdapat pigmen-pigmen lain, baik yang berupa turunan-turunan klorofil-a
maupun pigmen lainnya. Kumpulan bermacam-macam pigmen
fotosintesis disebut fotosintem, berperan menjerap energi cahaya (foton,
kuantum) pada reaksi terang untuk menghasilkan energi kimia berupa
ATP dan NADPH2. Contoh turunan klorofil-a yang berperan penting
pada fotosintesis adalah feofitin (kloforil-a yang kehilangan inti Mg,
menjadi salah satu komponen fotosintem II), pigmen yang peka
terhadap 680 nm (P680 = sebagai pusat reaksi fotosistem II) , dan
P700 (menjadi pusat reaksi fotosintem I). Pigmen yang lain antara lain
carotenoida dan xantofil (Aloysus, 2008).
Molekul klorofil tersusun atas 4 cincin pirol dengan Mg sebagai
inti. Pada klorofil terdapat rangkaian yang disebut fitil (C20H39O) yang
jika terkena air dengan pengaruh enzim klorofilase akan berubah menjadi
fitol (C20H39OH). Fitol adalah alkohol primer jenuh yang mempunyai
daya afinitas yang kuat terhadap O2 dalam proses reduksi klorofil
(Aloysus, 2008).

Gambar 1 Struktur Klorofil

(Al, 2008)
Sifat fisik klorofil adalah menerima dan atau memantulkannya
dalam gelombang yang berlainan (berpendar = berfluorescens). Klorofil
banyak menyerap sinar dengan panjang gelombang antara 400-700 nm,
terutama sinar merah dan biru. Sifat kimia klorofil menurut antara lain
(1) tidak larut dalam air, melainkan larut dalam pelarut organik yang lebih
polar, seperti etanol dan kloroform, (2) inti Mg akan tergeser oleh 2 atom
H bila dalam suasana asam, sehingga membentuk suatu persenyawaan
yang disebut feofitin yang berwarna coklat (Aloysus, 2008).
Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna
 (pigmen) antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil
(kuning). Meskipun klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi
secara keseluruhan strukturnya adalah non polar, seperti hidrokarbon,
sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut non polar seperti eter atau
petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang
membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid pada
struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih
polar dibandingkan klorofil a (UNLAM, 2011).
Karoten C40H56 adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari
sistem ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90%
betakaroten dan 10 % alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan
molekul karoten adalah non polar, akan tetapi mempunyai sifat dapat
mengubah bidang polarisasi. Karoten juga ada dua jenis yaitu a-karoten
dan -karoten, yang membedakan kedua struktur ini adalah posisi ikatan
rangkap pada cincin ujung. Selain itu, di dalam daun juga mengandung
antosianin yang berwarna merah, biru atau ungu tergantung derajat
keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari daun, terlebih dahulu
dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering sampai halus.
Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan urutan
kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol (UNLAM,
2011).
2. Determinasi Pigmen
Pigmen daun dapat dideterminasi secara kualitatif dan kuantitatif.
Secara kualitatif, macam pigmen daun dapat dideteksi dengan metode
kromatografi. Ada beberapa macam teknik kromatografi, dari teknik yang
sederhana sampai teknik modern. Teknik sederhana dapat dilakukan
dengan Kromatografi Kertas (KKt) dengan menggunakan kertas Watmann
3. Kromatografi yang lebih maju dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT),
yaitu dengan silika gel pada pelat alumenium/ plastik. Untuk zat yang
mudah menguap dilakaukan dengan teknik Kromatografi Gas. Teknik lain
adalah dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Aloysus, 2008).
 Deteksi cara sederhana terhadap macam pigmen daun dengan
teknik kromatografi kertas pada dasarnya melakukan pemisahan zat
dengan menggunakan larutan pengembang (eluen) yaitu campuran
pelarut organik dengan perbandingan tertentu yang sesuai sessuai sifat zat
dalam ekstrak pigmen daun yang hendak dipisahkan. Setelah ekstrak
pigmen daun yang ditotolkan pada kertas Watmann 3 dicelupkan dalam
larutan pengembang dalam bejana tertutup yang jenuh uap larutan
pegembang, zat yang paling larut akan merambat dengan lebih cepat pada
kertas Watmann, begitu pula sebaliknya. Karena itu akan diperoleh jarak
rambat golongan zat yang satu dengan golongan zat lain yang berbeda
tingkat kelarutannya dalam larutan pengembang. Sebagian jenis pigmen
tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Karena itu kadang
membutuhkan alat bantu berupa penyemprot bercak supaya memberikan
reaksi warna tertentu, dan kadang hanya akan terlihat di bawah sinar UV
(Aloysus, 2008).
3. Kromatografi Kertas
Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan
atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau
gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-
komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang
berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula. Kita akan melihat
alasannya pada halaman selanjutnya. Dalam kromatografi kertas, fase
diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah pelarut
atau campuran pelarut yang sesuai (Kristianingrum, tanpa tahun).
Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak
yang ditempuh pelarut; beberapa lainnya tetap lebih dekat pada garis
dasar. Jarak tempuh relatif pada pelarut adalah konstan untuk senyawa
tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap sama, misalnya
jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat. Jarak relatif pada pelarut
disebut sebagai nilai R f (Kristianingrum, tanpa tahun). Metoda
identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari
 noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Harga Rf
merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Harga ini
merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada
kromatogram dan pada kondisi yang konstan merupakan besaran yang
karakteristik dan reprodusibel. Untuk setiap senyawa berlaku rumus
sebagai berikut:
Rf = jarak yang ditempuh oleh senyawa per jarak yang ditempuh
oleh pelarut

G. METODE KERJA
1. Alat dan Bahan
a. Alat
Tabel 1. Alat Praktikum
No. Nama Alat Jumlah
1. Tabung reaksi 1 buah
2. Timbangan digital 1 buah
3. Tabung kultur bserta penutupnya 1 buah
4. Pipet mikro 4 buah
5. Gelas ukur 1 buah
6. Kawat penggantung kertas kromatografi 1 buah
7. Kertas kromatografi 1 buah
8. Mistar 1 buah
9. Mortir 1 buah
10. Sendok tanduk 1 buah
11. Aluminunium foil Secukupnya
12. Gunting 1 buah
13. Centrifuge 1 buah
14. Pensil 1 buah

b. Bahan
Tabel 2. Bahan Praktikum

No. Nama Bahan Jumlah

1. Pelarut Aseton 95% Secukupnya
2. Petroleum ether Secukupnya
3. Daun Agathis alba 5 gram
2. Cara Kerja
Bagan 1. Cara Kerja Memisahkan Zat-zat Warna yang Terdapat Pada
Daun (Aghatis alba)
H. HASIL PENGAMATAN
Tabel 1. Hasil Pengamatan Pemisahan Zat Warna Daun Agathis alba
Secara Kromatografi Kelompok 6-B

No Klorofil Rf Gambar
1 a Rf= jarak pigmen = 2 =0,14
Jarak pelarut 14
2 b Rf= jarak pigmen = 3 =0,21
Jarak pelarut 14
3 Karoten Rf= jarak pigmen = 12,5 =0,89
Jarak pelarut 14
4 Xantofil Rf= jarak pigmen = 10 =0,71
Jarak pelarut 14

Tabel 1. Hasil Pengamatan Pemisahan Zat Warna Secara Kromatografi Kelas B

No Kelompok Nama tumbuhan Rf

Kl. a Kl. b Xantofil Karoten
ke-
1 1 Psidium guajava 0,145 0,072 0,557 0,78
2 2 Spathodea campanoiata 0,23 0,12 0,52 0,94
3 3 Trimezia sp. 0,11 0,04 0,50 0,94
4 4 Syzigium oleana 0,163 0,094 0,656 0,806
5 5 Dracaena anguistifolia 0,18 0,076 0,019 0,18
6 6 Agathis alba 0,14 0,21 0,71 0,89
7 7 Trimezia martinicensis 0,058 0,16 0,39 0,79
8 8 Manihot sp. 0,127 0,255 0,509 0,892

I. PEMBAHASAN
Pemisahan zat warna pada praktikum yang telah dilakukan
menggunakan kromatografi untuk memisahkan campuran dari substansinya
menjadi komponen-komponen. Kertas yang digunakan pada metode ini
adalah kertas saring dan larutan aseton. Penggunaan aseton berfungsi untuk
pelarut klorofil. Pelarut ini akan menembus pada kertas dengan gara kapiler
dan mendorong pigmen warna hingga terjadi degradasi warna pada kertas.
 Bila aliran pelarut telah bergerak sampai waktu yang ditentukan, kertas
diambil dan diberi tanda. Kertas akan menempatkan seperti noda-noda yang
terpisah. Jika dilihat pada tabel hasil pengamatan terlihat bahwa urutan
pigmen pada kertas daring dengan urutan yang pertama adalah klorofil a
(hijau pekat), klorofil b, Xantofil, dan karoten pada daun tumbuhan Agathis
alba.
Klorofil a (C5H72O5N4Mg) berperan secara langsung dalam reaksi
terang fotosisntesis, yang mengubah energi matahari menjadi kimiawi.
Klorofil b (C55H70O6N4Mg) merupakan pigmen dari tilakoid yang dapat
menyerpa cahaya yang mentransfer energi ke klorofil a yang kemudian
mengawali reaksi terang. Xantofil (C4OH54(OH)2) adalah suatu pigmen yang
membantu dalam penerimaan sinar, sedangkan Karoten (C4OH56) adalah
pigmen fotosintesis berwarna orange yang penting untuk fotosisntesis.
Pigmen yang menempuh jarak paling jauh adalah Karoten, dan
pigmen yang menempuh jarak yang paling dekat yaitu klorofil a. Dengan
demikian urutannya adalah Karoten (C4OH56), Xantofil (C4OH54(OH)2),
Klorofil b (C55H70O6N4Mg), dan Klorofil a (C55H72O5N4Mg). Dengan
demikian berat molekul paling kecil sampai paling besar berturut-turut adalah
Karoten, Xanthofil, Klorofil b, dan Klorofil a, dilihat dari atom C nya.
J. JAWABAN PERTANYAAN
1. Jelaskan fungsi pigmen klorofil a, klorofil b, karoten dan xantofil!
Jawab:
a. Klorofil a berperan secara langsung dalam reaksi terang fotosintesis,
yang mengubah energi matahari menjadi energi kimiawi.
b. Klorofil b merupakan pigmen lain dalam membrane tilakoid yang
dapat menterap cahaya dan mentransfer energinya ke klorofil a, yang
kemudian mengawali reaksi terang.
c. Xantofil adalalah suatu pigmen yang membantu dalam penerimaan
sinar.
d. Karoten adalah pigmen fotosintesis berwarna oranye yang penting
untuk fotosintesis. Zat ini membentuk warna oranye dalam wortel
 dan banyak buah dan sayur lainnya. Dia berperan dalam fotosintesis
dengan menyalurkan energi cahaya yang dia serap ke klorofil dan
memperluas spectrum dari warna-warna yang dapat menggerakkan
fotosintesis.
2. Apakah fungsi aseton dan ether dalam praktikum ini?
Jawab: Fungsi aseton dan ether adalah sebagai pelarut klorofil.
3. Bagaimana rumus bangun dari klorofil a, klorofil b, zantofil dan
karoten?
Jawab:
a. Klorofil A, {C55H72O5N4Mg}
b. Klorofil B, {C55H70O6N4Mg}
c. Xantofil, {C4OH54(OH)2}
d. Karoten, {C4OH56}
4. Pigmen apakah yang terdapat paling atas pada kertas kromatografi
dan pigmen mana yang terdapat paling bawah? Apakah artinya?
Jawab: Pigmen yang terletak paling atas adalah karoten dan pigmen
yang terletak paling bawah adalah klorofil a. Artinya bahwa karoten
menempuh jarak yang paling jauh dari titik awal dibandingkan dengan
pigmen lain karena memiliki berat molekul yang paling kecil.
K. PENUTUP
1. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan, dapat disimpulkan
bahwa pemisahan zat warna secara kromatografi yang dilakukan pada
setiap daun yang dibawa oleh masing-masing kelompok terdapat klorofil a
(hijau tua), klorofil b (hijau muda), xantofil (kuning), dan karoten (jingga).
Pigmen yang terletak paling atas adalah karoten dan pigmen yang terletak
paling bawah adalah klorofil a. Artinya bahwa karoten menempuh jarak
yang paling jauh dari titik awal dibandingkan dengan pigmen lain karena
memiliki berat molekul yang paling kecil.
2. Saran
 Untuk pengamatan selanjutnya disarankan agar lebih teliti dalam
pengamatan dan pada setiap tahapan langkah kerja yang dilakukan agar
tidak terjadi kekeliruan dalam hasil pengamatan.
 DAFTAR PUSTAKA

Aloysus, Suyitno. (2008). Klorofil / Pigmen Fotosintesis. [Online]. Tersedia :

http://staff.uny.ac.id/sites/default/files/pengabdian/suyitno-aloysius-
drs-ms/modul-praktikum-analaisis-klorofil.pdf. (19 November 2016)

Kristianingrum, Susila. (tanpa tahun). Kromatografi Kertas. [Online]. Tersedia :

http://staff.uny.ac.id/sites/default/files/pendidikan/Susila
%20Kristianingrum,%20Dra.,%20M.Si./Handout-KA%20II-
KROM.KERTASs.pdf. (19 November 2016)

Tim Fisiologi Tumbuhan. (2016). Penuntun Praktikum Fisiologi Tumbuhan.

Bandung: JICA

UNLAM. (2011). Pemisahan Pigmen dari Tanaman. [Online]. Tersedia :

https://www.google.co.id/url?
sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=8&cad=rja&uact=8&ved=
0ahUKEwio_o3TxrTQAhXHo48KHRGeBW0QFghLMAc&url=https
%3A%2F%2Falchemist08.files.wordpress.com
%2F2012%2F05%2Fpercobaan-4-pigmen.docx&usg=AFQjCNEvP-
eQiGLVP_oRIlySFSLNTWjzPA&sig2=w7XmgXt6FCgrFunVh1KFD
Q. (19 November 2016)