KROMATOGRAFI

LAPORAN PRAKTIKUM

disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Fisiologi Tumbuhan yang
diampu oleh :

Dr. Hj. Sariwulan Diana, M.Si.

Drs. H. Taufik Rahman, M.Pd.

oleh:

Kelompok 5

Pendidikan Biologi B 2016

Amelia Maulidiyanti 1605168

Maya Dwi Cahyani 1601994
Putri Jayati Kusumah 1601694
Rina Sumarni 1603887
Rivani Fathurizki Haerudin 1603769

PENDIDIKAN BIOLOGI

DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

BANDUNG

2019
A. Judul
Pemisahan Zat Warna Secara Kromatografi

B. Waktu dan Tempat Pelaksanaan Praktikum

Hari, tanggal : Senin, Tanggal : 28 Oktober 2019
Waktu : 13.00-15.00 WIB
Tempat : Laboratorium Fisiologi FPMIPA UPI

C. Tujuan
Memisahkan zat-zat warna yang terdapat pada daun suatu tumbuhan

D. Rumusan masalah
1. Zat warna apa saja yang terdapat pada daun Euphorbia milii ?
2. Zat warna apa yang dominan pada daun Euphorbia milii ?
3. Apakah warna daun mempengaruhi kandungan zat warna yang di
milikinya?

E. Dasar Teori
Pada tumbuhan didapatkan bermacam-macam pigmen yang berperan
menyerap energi cahaya. Pigmen fotosintetis terdapat dalam kloroplas yang
terdiri dari klorofil a, b, xantofil, karotenoid, bakterioklorofil pada bakteri.
Pigmen ini menyerap warna atau gelombang cahaya yang berbeda-beda.
Masing-masing menyerap maksimum pada gelombang cahaya tertentu. Pigmen
umumnya mempunyai penyerapan maksimum pada gelombang cahaya pendek
dan juga panjang. Untuk memaksimalkan penyerapan energi cahaya, maka pada
kloroplas terdapat kelompok pemanen cahaya yang disebut dengan antena yang
terdiri dari bermacam-macam pigmen, pigmen yang paling banyak pada
kloroplas adalah klorofil. Klorofil merupakan pigmen yang berwarna hijau yang
terdapat pada kloroplast. Pigmen ini berguna untuk melangsungkan fotosintesis
pada tumbuhan . Aneka bentuk dan ukuran kloroplast ditemukan pada berbagai
tumbuhan (Salisbury and Ross, 1995).
 Fotosintesis terjadi pada semua bagian berwarna hijau pada tumbuhan
karena mamiliki kloroplas, tetapi tempat utama berlangsungnya fotosintesis
adalah daun. Pigmen warna hijau yang terdapat pada kloroplas disebut dengan
klorofil dan dari zat inilah warna daun berasal. Klorofil menyerap energy
cahaya yang menggerakkan sintesis molekul makanan dalam kloroplas untuk
menghasilkan energi (Campbell, 2002).
Kadar dari klorofil yang terkandung dalam suatu organ tumbuhan dapat
diukur dengan metoda spektrofotometer. Sel penutup pada lembaran daun yang
mengandung klorofil, didalam stroma pada sel tersebut akan berlangsung
fotosintesis yang akan menghasilkan karbohidrat (gula). Gula tersebut
menyebabkan potensial osmotik cairan sel yang menurun, potensial air juga
akan menurun, dengan peristiwa itu timbul tekanan turgor yang dapat
menyebabkan terbentuknya stroma (Kimball, 1988).
Klorofil sangat penting bagi tumbuhan untuk melaksanakan fotosintesis dan
menghasilkan energi. Untuk itu kita perlu mengetahui banyaknya klorofil yang
terdapat pada selembar daun dan kandungan dari klorofil itu sendiri. Oleh
karena itu, dilakukanlah praktikum mengenai pigmen fotosintetik ini dengan
menggunakan beberapa metoda. Klorofil merupakan pigmen kloroplast yang
terdapat dalam plastid. Plastid merupakan struktur khusus, diselimuti oleh
system membran rangkap ditemui hanya pada tumbuhan dan beberapa protista.
Plastid mengandung ONA dan ribosom yang terbenam (bersama membrane)
dalam cair yang disebut stroma (Salisbury dan Ross, 1995).
Sel penutup memiliki klorofil dalam selnya sehingga dengan bantuan
cahaya matahari dapat melakukan fotosintesis. Terlalu banyak sinar
berpengaruh beruk terhadap klorofil. Larutan klorofil yang dihadapkan pada
sinar kuat akam berkurang hijaunya dan daun yang kena sinar matahari
langsung pada umumnya berwarna hijau kekuningan. Salah satu cara untuk
menentukan kadar klorofil daun dengan metoda atau alat spektofotometer.
Spektofotometer temasuk dalam analisa kuantitatif yang di dasarkan pada sifat
warna larutan yang terjadi, atau merupakan salah satu pembagian kalorimetri.
Disini dipakai alat spektrofotometer. Metoda ini dapat digunakan apabila,
sample yang di ukur harus berwarna, kestabilan warna cukup lama, intensitas
warna terjadi cukup tajam, warna larutan harus bebas dari gangguan. Warna
larutan yang terjadi berbanding lurus dengan kosentrasi larutan (Khopkar,
1990).
Ada dua macam plastid berwarna, yaitu kloroplas yang mengandung
klorofil dan berbagai pigmen yang menyertainya dan kromoplast yang
mengandung pigmen lain (contohnya pigmen merah pada tomat) (Salisbury dan
Ross, 1995). Klorofil akan memperlihatkan flouresensi berwarna merah yang
berarti warna larutan tersebut tidak hijau pada cahaya yang diluruskan dan akan
merah tua pada cahaya yang dipantulkan. Pada proses fotosintesis banyak
diperlukan senyawa kimia yang penting dalam mengubah cahaya menjadi
energi kimia pada tumbuhan tingkat tinggi, adalah pigmen yang terdapat
didalam kloroplas, melalui pigmen inilah cahaya memulai proses fotosintesis.
Pigmen tersebut dalam kloroplas yaitu pada membran internal yang disebut
tilakoid. Pigmen tersebut adalah klorofil a, klorofil b, dan keratinoid
(Sasmitamihardjo, 1990).
Klorofil terdapat didalam kloroplas yang merupakan pigmen yang aktif
didalam fotosintesis. Klorofi adalah molekul tetra-spiral yang dihubungkan aleh
atom Mg, yang berbrntuk oval yang terkandung dalamnya. Penyerapan yang
esensial oleh kloroplas didalam menbran tilakoid. Tiap-tiap foton dapat
mengelurakan electron kedalam klorofil, klorofil hijau akan menyerapa warna
yang panjang gelombangnya pendek, berenergi tinggi yang efektif dalam
fotosintesis. Penyerapan terhadap panjang gelombang relatif bervariasi dan
dapat diukur denan menggunakan spektrofotometer. Gambaran dari banyaknya
penyerapan dari fungsi panjang gelombang disebut dengan spectrum
penyerapan (Dwijoseputro, 1980).
Ada 6 tipe klorofil yaitu klorofil a, b, dan c, dorobium serta klorofil 650 dan
660. klorofil a dan b terdapat pada semua organisme yang melakukan
fotosintesis. Uluran kloroplas bervariasi pada setiap spesies, pada tanaman
tingakat tinggi diameter kloroplas antara 4-6 mm. Kloroplas pad sel polipoid
lebih besar dibandingkan tanaman yang selnya bukan polipoid. Perubahan
bentuk dan volume kloroplas dapat disebabkan oleh cahaya, keadaan yang gelap
kloroplas dapat direduksi dengan penambahan ATP (Devlin, 1975).
 Warna hijau pada kloroplas disebabkan oleh adanya empat tipe utama
pigmen didalamnya yaitu klorofil a, dan klorofil b, berwarna hijau karena
bnayak menyerapa warna lembayung dan merah dan memancarkan sinar hijau,
selain klorofil da xantofil dan karoten. Benda-benda berwarna menyerap cahaya
dengan berbagai panjang gelombang sampai pada tingkat tertentu, dan warna
yang timbul pada warna tersebut adalah cahaya yang diserap paling sedikit.
Pada proses fotosintesis warna yang paling sedikit diserap adalah warnadengan
cahaya hijau, warna inilah tersebar dipantulkan oleh tumbuhan sehingga tampak
warna hijau (Sastamitamihardjo, 1990).
Untuk memisahkan zat-zat warna yang terdapat pada suatu tumbuhan dapat
dilakukan dengan berbagai cara, tetapi teknik kromatografi merupakan teknik
yang banyak digunakan. Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael
Tswett, seorang ahli botani Rusia, pada tahun 1906. Kromatografi berasal dari
bahasa Yunani ‘Kromatos’ yang berarti warna dan ‘Graphos’ yang berarti
menulis. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sederhana.
Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan
distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fasa, salah satu diantaranya
bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat
itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam
absorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan
ion dinamakan kromatografi sehingga masing-masing zat dapat diidentifikasi
atau ditetapkan dengan metode analitik (Anonim, 1995).
Pada dasarnya, teknik kromatografi ini membutuhkan zat terlarut
terdistribusi di antara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya
bergerak (fase gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga
terpisah dari zat terlarut lainnya yang tereluasi lebih awal atau lebih akhir.
Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh cairan atau gas
yang disebut eluen. Fase diam dapat bertindak sebagai zat penyerap atau dapat
betindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan
fase gerak (Anonim, 1995).
Prosedur kromatografi masih dapat digunakan, jika metode klasik tidak
dapat dilakukan karena jumlah cuplikan rendah, kompleksitas campuran yang
 hendak dipisahkan atau sifat berkerabat zat yang dipisah. Kromatografi ada
bermacam-macam diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis,
penukar ion, penyaringan gel dan elektroforesis (Anonim, 1995).

F. Alat dan Bahan

Tabel F.1
Alat yang digunakan pada Praktikum Memisahkan Zat-Zat Warna yang
terdapat pada Daun suatu Tumbuhan
No. Nama Alat Jumlah
1. Gunting 1 buah
2. Penggaris 1buah
3. Pensil 1buah
4. Kertas kromatografi 1 lembar
5. Kuvet 1 buah
6. Mikropipet 1 buah
7. Mortar 1buah
8. Neraca digital 1 unit
9. Pestel 1 buah
10. Sentrifuge 1 unit
11. Spatula 1 buah
12. Tabung kultur 1 buah

Tabel F.2
Bahan yang digunakan pada Praktikum Memisahkan Zat-zat Warna yang
terdapat pada Daun Suatu Tumbuhan
No. Nama Bahan Jumlah
1. Daun Euphorbia milii 3 gram
2. Larutan aceton 5 ml
G. Langkah Kerja
Daun tumbuhan Daun Euphorbia milii Daun Euphorbia milii
Euphorbia milii disiapkan yang sudah ditimbang yang sudah dihaluskan
dan ditimbang dengan ditumbuk dengan dimasukkan sedikit demi
menggunakan neraca menggunakan mortar dan sedikit kedalam kuvet
digital sampai sebanyak pestel sampai teksturnya dengan menggunakan
3g halus spatula

Kemudian sebanyak 5ml

mulut kuvet ditutup mulut kuvet ditutup
larutan aceton dituangkan
dengan menggunakan dengan menggunakan
kedalam kuvet yang sudah
alumunium foil, kemudian alumunium foil, kemudian
berisi daun Euphorbia
kuvet dimasukkan kuvet dimasukkan
milii yang sudah
kedalam sentrifuge kedalam sentrifuge
dihaluskan

Sementara menunggu
Daun Euphorbia milii hasil sentrifugasi, kertas
yang sudah dihaluskan di kromatografi disiapkan,
sentrifugasi dengan pada bagian ujung kertas
menggunakan sentrifuge dibuat gari vertical
selama 20 menit dengan sepanjang 2 cm, kemudian
kecepatan putaran 600rpm ditentukan titik tengah
pada garis tersebut
Setelah ditentukan titik
tengah garis peda kertas,
dari bagian ujung tengah
kertas digunting, sampai
bagian ujung kerts
berbentuk segitiga

supernatan yang sudah

Bagian supernatan pada
diambil dengan Setelah 20 menit,
ektrak daun diambil
menggunakan mikropipet disentrifugasi, kuvet yang
sedikit demi sedikit
diteteskan sebanyak 8X berisi ekstrak daun
dengan menggunakan
pada kertas kromatografi Euphorbia milii diambil
mikropipet
yang sudah disiapkan

Kertas yang sudah kering

Setelah supernatan selesai dimasukkan kedalam
diteteskan pada kertas tabung kultur yang udah Kertas kromatografi yang
kromatografi, kertas berisi larutan aceton, dimasukkan kedalam
kromatografi didiamkan bagian ujung kertas tabung kultur didiamkan
± 7 menit, sampai tetesan kromatografi ±1 cm selama 20 menit
supernatant kering dibiarkan terendam
didalam larutan aceton

Gradasi warna yang

Jarak warna yang Setelah 20 menit kertas
terdapat pada kertas
diperoleh dicatat dan hasil kromatografi dikeluarkan
diamati dan diukur jarak
pengamatan dari tabung kultur untuk
setiap perubahan
didokumentasikan diamati
warnanya
 Gambar G.1 Bagan Alur Langkah Kerja Praktikum Memisahkan Zat-zat
Warna yang terdapat pada Daun Suatu Tumbuhan
H. Hasil Pengamatan
Tabel H. 1
Hasil pengamatan pemisahan warna secara kromatografi kelompok 5B

No Sampel Sebelum dilakukan kromatografi Setelah dilakukan kromatografi Jumlah warna

1. Daun Euphorbia 4
milii

Gambar 1. Ekstrak daun sebelum Gambar 2. Ektrak daun setelah

dilakukan kromatografi dilakukan kromatografi
(Dok. kelompok 5B, 2019) (Dok. kelompok 5B,2019)

Tabel H.2

hasil pengamatan pemisahan warna secara kromatografi kelas B 2016

Kel. Nama tumbuhan Warna Keberadaan

daun Kl b Rf Kl a Rf Karoten Rf Xan Rf
1 Sauropus Hijau  0.81  0,95  1  0,98
androgynus
2 Manihot Hijau  0,74  0,91  1  0,95
esculenta
3 Althenantera Ungu  0,68  0,84  0,97  0,95
dentata
4 Rhoeo discolor Ungu,  0,75  0.91 - -  1
Hijau
5 Euphorbia milii Hijau  0,70  0,86  0,89  0,88
6 Althenantera Ungu  0,66  0,76 - -  0,83
dentate
7 Ixora sp Hijau  0,72 - -  1  0,95
8 Syzygium oleana Merah  0,18 - - - - - -
9 Bougainvillea Hijau  0,84  0,15  1  0,95
spectabilis

I. Pembahasan
Berdasarkan hasil pengamatan pemisahan zat warna secara kromatografi
pada daun Euphorbis milii yaitu dengan melihat kandungan pigmen warna pada
 daun yang bewarna hijau tua dan pada daun yang berwarna hijau muda. Setelah
daun yang berwana hijau tua dan yang berwarna hijau muda dipisahkan, masing-
masing dari warna daun tersebut dihaluskan setelah itu dilakukan pemisahan
warna secara kromatografi untuk melihat warna apa saja yang terkandung dalam
daun berwarna hijau tua dan di dalam daun yang berwarna hijau muda. Setelah
dilakukan pemisahan warna secara kromatografi dihasilkan warna hijau muda
yang tipis pada daun hijau muda dari Euphorbis milii sedangkan pada daun yang
berwarna hijau tua menghasilkan warna hijau muda, hijau tua serta warna kuning.
Warna hijau dihasilkan dari pigmen klorofil dan warna kuning dihasilkan dari
pigmen xantofil. Klorofil yang terdapat pada daun Euphorbis milii baik yang
berwarna muda dan tua yakni klorofil b, karena mampu menyerap cahaya jingga
dan biru serta memantulkan cahaya hijau dan kuning pada proses fotosintesis.
Semua warna yang muncul sedikit dan tipis, warna yang muncul tidak begitu
pekat. Warna daun yang muncul sedikit dan tipis karena daun Euphorbis milii
hanya memiliki warna hijau tua dan hijau muda dan tekstur daun berserat sehingga
pigmen warna yang keluar tidak begitu pekat.

J. Kesimpulan
Berdasarkan data hasil pengamatan, daun Euphorbia milii memiliki zat
warna klorofil a, klorofil b, beta karoten dan xantofil. Zat warna yang paling
mendominasi adalah klorofil b yang berwarna hijau muda karena warna daun dari
Euphorbia milii ini juga berwarna hijau muda. Warna daun mempengaruhi zat
warna yang terdapat pada daun tersebut, seperti Syzygium oleara yang berwarna
merah hanya memiliki klorofil b, daun Rhoeo discolor tidak memiliki zat warna
karoten jadi kandungan zat warna pada setiap daun berbeda-beda

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, (1995). Farmakope Indonesia Ed. IV. Diakses

darihttp://www.chemistry.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kro
matografi1/kromatografi_kolo/Depkes RI. [11 November 2019]

Campbell, N.A., Reece, J.B., & Mitchell, L.G. (2002). Biologi. Jilid 1.
Edisi Kelima. Alih Bahasa: Wasmen. Jakarta: Penerbit Erlangga
Devlin, R.M., 1975. Plant Phsiology, Third Edition, D. Van Nostrand.
Company. New York.

Dwidjoseputro, D. (1980). Pengantar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta :

PT.Gramedia

Khopkar S.M. (1990). Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : Universitas

Indonesia Press

Kimball, John W., (1988). Biologi. Edisi Kelima. Jilid 2. Alih Bahasa: Siti
Soetarmi Tjitrosomo dan Nawangsari Sugiri. Jakarta: Erlangga

Salisbury, Frank B dan Cleon W Ross. 1995. Fisiologi Tumbuhan Jilid 1.

Bandung: ITB.

Sasmitamihardja, D. 1990. Dasar- dasar Fisiologi Tumbuhan. Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Bandung: ITB