ACARA 7

 pengertian PCR
Metode perbanyakan/amplifikasi DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme atau
secara in vitro. Terdapat tahapan yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi
duplikasi jumlah target DNA untai ganda sampai jutaan kopi fragmen DNA. Sehingga, DNA
dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relative singkat untuk memudahkan
analisis DNA selanjutnya.
 Suatu segmen asam nukleat diperbanyak (diamplifikasi) menggunakan primer (batasan
sekuens basa nitrogen yang ada pada hulu dan hilir segmen).
 Tujuan PCR adalah mengamplifikasi DNA target sehingga menghasilkan sejumlah salinan
fragmen.
 Prinsip utama : siklus secara berulang denaturasi, annealing, dan ekstensi.
- Predenaturasi, denaturasi (pemutusan double stranded menjadi single stranded) suhu 95,
- Annealing (penempelan primer pada untai dna) suhu 55,
- extention (pemanjangan) suhu 72,
- cooling (pendinginan) suhu 4.

 Komponen PCR dan pengertian atau fungsinya

- DNA Template
Pencetak dalam pembentukan molekul DNA baru yang sama
- Enzim DNA polymerase
Sebagai katalis polimerisasi pada proses ekstensi DNA
- dNTPs
Sebagai building block DNA pada proses ekstensi DNA
- Primer
Sebagai awalan sintesis DNA berupa potongan pendek DNA untai tunggal
- PCR buffer dan kation Mg2+
Menstabilkan pH media dan kofaktor untuk menstimulasi aktivitas DNA polymerase
 - Nuclease free water
Sebagai pelarut campuran pada sampel dan reagen PCR
 Alat u/ PCR thermal cycler
Alat yang digunakan untuk mengamplifikasi atau menggandakan untaian basa-basa DNA
tertentu melalui pengaturan suhu, penggunaan enzim dan komponen lainnya
 Faktor yang berpengaruh pada PCR
 Primer 20-40 basa apabila terlalu pendek akan menempel scr tdk spesifik. kl kepanjangan,
spesifisitas rendah dan mahal komposisi primer jgn basa gc berulang kl berulang akan terjadi
miss annealing
 RFLP
Dipilih karena lebih mudah cepat sederhana, kekurangan lama karna terjadi 2x. penggunaan
enzim setelah PCR. Adanya daerah polimorfik sisi restriksi endonuklease. prosesnya lama
karena terdapat tahap restriksi dan pcr itu sendiri. apabila melalui proses pengolahan masih
terdeteksi berarti pengolahan tidak berpengaruh terhadap dna.
PCR RFLP memungkinkan untuk mengidentifikasi fragmen DNA berdasarkan pola unik
pemotongan enzim restriksi di daerah DNA tertentu dan melihatnya dalam gel.
Kelemahan pcr biasa itu 1 langkah jalan saja, PCR RFLP :2 kali karena harus restriksi dulu.
2 primer yg biasa digunakan PCR RFLP untuk penentuan jenis spesies seperti kontaminan
babi yaitu universal dan spesifik. Misal terdapat kontaminasi babi itu yang kepotong enzim
restriksi, jumlah tergantung konsentrasi.
 Prinsip kerja pcr rflp (Adanya polimorfi sisi restriksi untuk masing masing gen)
 Pcr dulu baru enzim restriksi
 Larutan pemisah agar noda atau senyawa dpt terpisah dan tidak berekor ?

MINI PROJECT

PREPARASI

1. Sampling
 Sampling yg perlu diperhatikan :
- Umur tanaman (kandungan daun tua dan mida beda),
- Organ tanaman untuk sampling (daun, akar),
- Waktu pemanenan (waktu sintesis metabolik berbeda-beda),
- Teknik pengambilan, dan lingkungan (habitat, eg: tanaman dataran rendah dan
tinggi memiliki kadar senyawa yg berbeda).
 umur sampel, organ sampel, tempat pengambilan. harus diperhatikan karena
mempengaruhi kualitas dan kuantitas sampel
 manual: gak menimbulkan reaksi tertentu tp dipengaruhi sm orang yang melakukan
sampling. pake tangan: lebih baik karena tdk mempengaruhi sampel

 mekanik
 kadang ada gesekan yg menimbulkan panas sehingga dapat mempengaruhi kandungan
senyawa pd sampel
2. sortasi basah: memisahkan sampel dr bahan pengotor. ex: dicuci trs dikuliti.
3. Pencucian
setelah sampling, dicuci untuk menghilangkan kotoran, seperti debu, mikroorganisme, dan
jamur. bagian yg rusak dipisahkan. Lalu dipotong untuk mempercepat proses pengeringan
(makin luas pengeringan makin lama)
 perendaman bertingkat: pd sampel yg kotor dikit. keuntungan, hemat air
 penggunaan air mengalir: pd sampel yg banyak kotor, butuh air banyak
4. perajangan
5. teknik penimbangan sampel
6. pengeringan sampel
untuk menghilangkan kadar air dlm sampel, karna bs jadi pertumbuhan mikroba, dan juga
menghentikan proses enzimatis
tujuan: supaya simplisia gak rusak dan tahan lama
suhu 30-90 (jgn lebih dr 60 karna takutnya senyawa merabolit rusak) kelembaban,
 Pengeringan buatan (oven (mengeringkan 40-60 derajat, kalo terlalu tinggi senyawa dpt
terdegradasi) sampel bisa kering merata. cepat. praktis. memungkinkan sirkulasi udara
 Freeze dry (pengeringan beku, dilakukan dengan menyublimasi air pada sampel setelah
dibekukan cocok untuk senyawa yg mudah rusak karena panas atau dengan suhu tertentu
dapat hilang atau menguap) cocok u senyawa termolabil atau gak kuat suhu tinggi.
sampel didinginkan lalu dikeringkan lalu desorbsi atau pengeringan sekunder di mana
analit dalam sampel akan keluar ke latutan.
Kekuragannya : mahal butuh tenaga ahli
 Pengeringan alami.
sinar matahari, diangin anginkan, dan ternaung (tdk langsung terkena matahari bs ditutup
kain). kekurangannya membutuhkan waktu yg lebih lama suhu tidak konstan. kelebihan
tidak mmbtuhkan biaya yg besar. hasil pengeringan simplisia
sinar matahari. mudah murah. resiko degradasi senyawa tinggi, pemanasan gak merata
diaanginkan, sinar matahari tp ditutup pk kain item.
 Pengeringan juga dapat mengurangi proses enzimatis (pause) internal, menghambat
pertumbuhan mikroba (e.g: jamur yang hidup di tempat lembab), dan penyimpanan lama.
7. sortasi kering: memisahkan bahan yg gak terpakai kek gosong
 dihaluskan untuk memperkecil ukuran praktikel. semakin kecil maka semakin
mempermudah pelarut masuk ke dalam sel sehingga senyawa yg di dapat lbh banyak.
8. Pengepakan
 kemasan harus dipisahkan dari bahan-bahan yang mudah bereaksi dengan simplisia,
mampu melindungi simplisia dari cemaran mikroba, tidak beracun, dan dapat menjamin
mutu produk yang dikemas
9. Faktor yang dapat mempengaruhi simplisia:
  suhu (harus kering),
 tidak adanya oksigen (karena terjadi oksidasi reduksi yg dapat merusak),
 adanya pengotor merupakan kontaminan,
 cahaya.
- syarat: menjamin mutu produk. mampu melindubgi simplisisa. inner. kedap udara
- karung goni. plastik. karton. botol kaca
- faktor perusak simplisia: radiasi cahaya dapat merubah struktur senyawa simplisia, oksigen
menyebabkan oksidasi, pengotor atau sekret hewan
- yg harus diperhatikan suhu gak bileh lebih 30, ventuilasi cukup, kelembaban,

EKSTRAKSI

 pengertian
Proses pemisahan suatu atau beberapa senyawa akif dari hewan/tumbuhan dengan
bantuan pelarut. Pemisahan terjadi atas dasar kelarutan yang berbeda dari komponen-
komponen tersebut.
ekstraksi etanol 96% dengan perbandingan 1:10 (simplisia:pelarut), tanin dan fenol
(polar), pelarut (semipolar)
 Hasil ekstraksi dipengaruhi beberapa factor, yaitu:
a. Pemilihan bagian tanaman yang digunakan Tanaman yang digunakan bisa berasal
dari tanaman liar atau tanaman budidaya. Pemilihan tanaman sebagai bahan simplisia
harus memperhatikan umur tanaman, bagian tanaman, dan lingkungan tumbuhnya.
Simplisia dapat diolah melalui pengeringan, fermentasi atau pengolahan kusus
lainnya. Proses pengeringan dapat menggunakan cahaya matahari atau dengan alat
pengering. Simplisia yang telah kering dapat dibuat serbuk untuk mempermudah
proses ekstraksi.
b. Pemilihan pelarut Pelarut yang baik harus memenuhi syarat-syarat : toksisitas rendah,
mudah menguap pada suhu yang tidak terlalu tinggi, tidak menyebabkan perubaha
pada ekstrak (tidak membentuk komplek/bereaksi dengan ekstrak), dan mudah
menyerap atau melarutkan senyawa.Pemilihan pelarut harus mempertimbnagkan:
jumlah senyawa yang akan diekstraksi, kecepatan ekstraksi yang dikehendaki, sifat
Senyawa yang dikehendaki, kemudahan dalam penanganan ekstrak dan toksisitas
terhadap uji biologis Air merupakan pelarut yang universal karena sebagian besar
senyawa dapat larut dalam air. Namun demikian hasil penelitian menunjukkan bahwa
ekstrak air kurang memiliki aktivitas biologis. Pelarut polar yang sering digunakan
adalah alcohol yaitu methanol dan ethanol. Pelarut ini biasa digunakan untuk studi
awal. Methanol lebih polar dari ethanol tetapi lebih toksid. Pelarut nonpolar yang
sering digunakan adalah chloroform dan ether. Pelarut ini dapat melarutkan senyawa
nonpolar .
 Metode yang dipakai : maserasi
 Meserasi digunakan untuk mengekstrak simplisia yang mengandung komponen yang
mudah larut dalam pelarut. Ekstraksi ini dilakukan dengan cara merendam simplisia
dalam pelarut dengan pengadukan dan penggantian pelarut.
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Maserasi dilakukan dengan cara merendam
serbuk simplisia dengan pelarut. Perendaman dilakukan selama 3 hari dengan
penggantian pelarut setiap 24 jam sekali dan dilakukan pengadukan selama beberapa kali.
Maserat yang didapat dari rendaman serbuk simplisia disaring dengan kertas saring.
Setelah itu, ekstrak dipisahkan dari pelarutnya dengan cara penguapan menggunakan
rotary evaporator dengan suhu 50 0C sampai diperoleh ekstrak yang pekat.
maserasi 3 harin penggantian 1x24jam. Hasilnya maserat. Pelarut dipilih berdasarkan
sifat senyawa target atau kepolaran senyawa target.
- Perkolasi
Perkolasi umumnya digunakan untuk mengekstraksi zat-zat yang berkasiat keras.
Proses ekstraksi dengan jalan melewatkan pelarut yang sesuai secara lambat dalam
suatu percolator.
- Dekoksi Dekoksi adalah teknik ekstraksi dengan menggunakan pelarut (biasanya air)
yang dipanaskan pada suhu 90-98 oC selama 30 menit . Teknik ekstraksi ini umumnya
untuk simplisia yang keras/sulit dihaluskan misal kulit kayu (korteks), kayu (lignum),
akar (radix), batang, kulit buah dan biji
- Sokletisasi
Ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru, dilakukan dengan alat soklet,
sehingga terjadi ekstraksi secara kontinyu dengan jumlah pelarut yang relatif konstan
dengan adanya pendingin balik

 pelarut berganyung senyawa target

mudah. murah. Cocok. membutuhkan waktu lama. pelarut banyak yaitu selama 3- hari
terhagantung jenis tanaman
  Alat untuk menguapkan adalah rotary evaporator, water bath, cawan penguapan
(porcelain), hotplate, panci. Ketika sampel terlalu sedikit harus menggunakan waterbath
karena kl menggunakan rotary evaporator menyebabkan kegosongan yg dapat merusak
sampel. setelah di evaporasi menggunakan evaporator sampel diambil kemudian di
waterbath untuk menghasilkan pasta yang lebih padat/kental. Hasilnya pasta. lalu
dihitung rendemen: berat ekstrak pasta/berat simplisia x 100%.
 metode: ultras
sampel dlm wadah pake botol kaca trs dikasih tekanan mekanik ada yg pake waterbath
ada yg soklet elstraksi kontinu. pelarut lb dikit drpd maserasi karna pake pemanasan,
akan memengatuhi senyawa merabolit
 perkolasi mengalirkan pelarut ke servuk simplisia pake perkolator hasilnya perkolat.
pelarut harus sesuai berdasar polar non pola
 pelarut harus murah. mudah diuapkan
 Persen menghitung rendemen untuk mengistimasi kebutuhan simplisia dalam
nendapatkan jumlah senyawa. waterbath pake 70 derajat. Kloroform tidak boleh
waterbath karena toxic dan beracun.
 Semakin banyak pelarut maka semakin banyak senyawa yg didapatkan. Pelarut memiliki
sifat jenuh sehingga kl terlalu lama dan sedikit maka akan menimbulkan jenuh dan tdk bs
melarutkan senyawa pd simplisia.

KROMATOGRAFI

 Kromatografi adalah teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaan distribusi analit
pada dua fase yang berbeda. Dikenal dua fase dalam kromatografi yaitu:
- fase diam /stasioner yang menahan analit
fase diam dapat berupa padatan atau cairan.
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut
dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam 23 sampel.
Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah,
begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa
yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf
yang rendah. Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang
harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya
- fase mobil/gerak yang membawa analit.
Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen.. Pemilihan eluen
didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa
pelarut dengan polaritas yang berbeda. Eluen KLT dipilih dengan cara trial and error.
Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh.
Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak
yang ditempuh oleh eluen. R. Fase gerak dapat berupa cairan atau gas sedangkan Jika
 fase gerak berupa gas maka disebut kromatografi gas. Jika fase gerak berupa cairan
maka disebut kromatografi cair.
Menghitung nilai Rf

 Alat dan Bahan

a. Alat: Chamber, pinset
b. Bahan: Plat silica, pelarut,
 Kromatografi lapis tipis adalah metode kromatografi cair yang paling sederhana. Pada
kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas serupa dalam hal fase diamnya yaitu
berupa lapisan tipis dan fase gerak mengalir karena kerja kapiler.
 klt untuk tanin dan fenol.
 fase gerak berupa eluen dari metanol : etil asetat (2:3),
- fase diam adalah plat silika (2x10cm). digaris 1,5 (bawah) dan 0,5.
- Lalu dilakukan penjenuhan untuk mengetahui apakah eluen sudah dalam keadaan
jenuh. makin jenuh hasil klt akan semakin maksimal.
- sampel diambil seujung tusuk gigi lalu dicampur larutan pemisah kloroform dan
ethanol (1:1) agar senyawa terpisah dengan baik, dan membuat noda pada klt tidak
berekor.
- setelah itu di visualisasi dengan uv-transilluminator dengan panjang gelombang 254
dan 365.
- Lalu disemprot FeCl3 1% untuk mendeteksi tanin (warna hijau kehitaman) dan fenol
(hitam pekat, merah, dan biru) dilihat perubahan warna.
- lalu diukur Rf: jarak migrasi senyawa pada sampel/jarak migrasi eluen. Rf untuk
standar untuk mengecek apa atau tidaknya senyawa.
- Prinsip kromatografi antara standar dan sampel harus dikerjakan secara bersamaan.
 Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan adsorben seperti silika
gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa. Adsorben tersebut berperan sebagai fasa
diam.
 Prinsip pemisahan pada KLT dapat didasarkan pada: adsorbsi, partisi atau kombinasi
keduanya.
 Pemisahan molekul dalam kromatografi didasarkan pada perbedaan pola pergerakan antara
fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada
larutan.
 Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati fase diam.
 Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan fase diam cenderung bergerak lebih
lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.
 Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan perbedaan
kecepatan pergerakan.
  Dalam kromatografi, dikenal beberapa istilah, antara lain:
- Analit adalah zat yang dipisahkan.
- Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan. Adanya
puncak karakterisitik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda.
- Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit.
- Fasa gerak adalah fasa zat yang bergerak pada arah tertentu.
- Fasa diam adalah fasa yang tetap pada tempatnya.
- Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem.
- Volume retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen
analit
 Kromatografi dapat bersifat preparatif maupun analitik.
 Tujuan kromatografi preparatif biasanya adalah untuk memisahkan senyawa dalam campuran
(biasanya digunakan untuk pemurnian).
 Kromatografi analitik digunakan untuk mengetahui 22 perbandingan senyawa dalam
campuran.
 Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan
besar yaitu gas chromatography dan liquid chromatography

 base line batas atas,

 etil asetat metanol 3:2
 pemisah metanol klorofirm 1:1
 pereaksi karna mendereksi fenol pake FeCl3
 plat silika diberi baseline
 fungsi baseline sbg batas
 eluen pake etil sm methanol
 kertas saring 2x10 cm
 ditotolkan dgn pipa kapiler
 diamati dgn uv trans
 plat fisemprot dgn peraksi trs
 penyeraoan klt, plat harus tegak lurus
 plat silika
 FeCl3 akan terbentuk warna yg mengindikasikan senyawa fenol