1
besar. Dan jika radiasi yang diabsorpsi setara dengan energi radiasi sinar tampak
maka senyawa yang mengabsopsi itu tampak berwarna.
Hukum Lambert-Beer
Jika radiasi elektromagnetik dilewatkan pada suatu media (kuvet), maka
sebagian radiasi itu akan diabsorpsi atau ditransmisikan. Pada pengerjaan
spektrofotometri, radiasi yang dilewatkan tersebut sebagian diabsorpsi dan
sebagian lagi ditrasmisikan sehingga berlaku Hukum Lambert-Beer, yaitu A = a b
c. Absorptivitas (a) merupakan tetapan proporsionalitas yang tidak tergantung
kepada konsentrasi, tebal larutan dan intensitas radiasi yang dilewatkan. Ia hanya
tergantung kepada suhu, pelarut, struktur molekul dan panjang gelombang. Harga
absorptivitas tergantung kepada besaran c dan b. Jika c dinyatakan dalam molar,
maka a di sebut absorptivitas molar dan satuannya L mol-1, cm-1, jika c dinyatakan
dalam g/liter maka disebut absorptivitas dan satuannya L.g-1 cm-1. Jika c
dinyatakan dalam % (b/v, g/100 ml) maka a di sebut absorptivitas jenis (A11).
Dengan demikian absorptivitas dapat diinterprestasikan sebagai absorban dari
suatu senyawa pada panjang gelombang tertentu dari suatu larutan per unit
konsentrasi.
2
pengukuran absorpsi harus dilakukan pada panjang gelombang maksimum, karena
:
1. Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal dan pada
panjang gelombang tersebut, perubahan serapan untuk setiap konsentrasi
juga yang paling besar.
2. Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva serapan datar dan
pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi.
3. Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang di sebabkan oleh
pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika di gunakan
panjang gelombang maksimal.
Instrumentasi
Piranti yang digunakan untuk pengukuran spektrum di sebut
spektrofotometer. Ada 2 jenis spektrofotometer uv-vis yaitu Single Beam (berkas
tunggal) dan Double Beam (berkas ganda)
3
Sumber radiasi
Untuk pengukuran didaerah sinar tampak digunakan lampu halogan-
tungsten yang dibungkus kwarsa atau lampu filamen tungsten biasa. Untuk
pengukuran di daerah ultraviolet digunakan lampu deuterium. Dalam
spektrofotometer yang diukur adalah intensitas radiasi yang dipancarkan oleh
sumber radiasi. Lampu deuterium mempunyai batas waktu operasional sekitar 500
jam dan lampu tungsten sekitar 2000.
Monokromator
Alat ini untuk memperoleh radiasi monokromatis dari sumber radiasi
polikromatis. Monokmator terdiri dari radas dengan susunan celah masuk – filter
– kisi (grating difraksi) atau prisma dan celah keluar. Pada spektrofotometer
modern digunakan sistem monokromator ganda yaitu dua monokromator yang di
pasang secara paralel yang terdiri dari prisma dan kisi, yang menghasilkan sinar
monokromatis yang jauh lebih sempurna dibandingkan dengan monokromator
tunggal dan juga dapat mengurangi pengaruh radiasi asing.
4
sinar tampak dan kuvet silika untuk pengukuran di daerah ultraviolet dan sinar
tampak. Kuvet yang digunakan ketebalan 1 cm dengan kapasitas 4 ml.
Detektor
Detektor berfungsi sebagai penunjuk adanya radiasi yang di transmisikan
oleh sampel dan mengukur intensitas radiasi tersebut. Radiasi diubah menjadi
energi listrik oleh sel tabung foto. Detektor terbaru dengan teknologi maju dan
canggih adalah detektor ‘diode array’
Rekorder
Signal listrik yang keluar dari detektor diterima pada sirkuit potensiometer
yang dapat langsung mengukur transmitans atau absorban.
Aplikasi
Spektrofotometri UV-Vis digunakan untuk :
1. Pengujian identitas (identifikasi)
2. Eluisidasi struktur molekul
3. Pemeriksaan kemurnian
4. Penentuan kadar senyawa tunggal
5. Penentuan kadar senyawa multikomponen
6. Penentuan tetapan kesetimbangan asam basa
7. Penentuan tetapan laju reaksi kimia
Pengujian Identifikasi
Identifikasi senyawa ditentukan melalui pengukuran/pembuatan spektrum
absorpsi, panjang gelombang maksimum dan nilai absorptivitas molar. Pada
pengujian identitas senyawa kadang kadang dilakukan dengan mengukur
absorban suatu larutan dengan konsentrasi tertentu pada suatu panjang
gelombang tertentu. Disamping itu ratio absorban pada berbagai panjang
gelombang sangat berarti dalam identifikasi. Hasil yang di peroleh dibandingkan
dengan literatur atau dengan hasil pengukuran larutan baku pembanding.
Eluisidasi struktur
5
Spektrum absorpsi memberikan informasi adanya gugus kromofor dan
gugus fungsi melalui profil spektrum, posisi panjang gelombang absorpsi
maksimum dan absorptivitasnya dalam pelarut tertentu. Melalui kaidah
woodward, parameter itu digunakan untuk menjelaskan struktur molekul yang
dianalisis. Namun data dari spektrum uv-vis ini belum mencukupi untuk
keperluan eluisidasi yang lengkap, masih dibutuhkan data pendukung lainnya
seperti analisis unsur, spektrum inframerah dan NMR.
Pemeriksaan Kemurnian
Ada beberapa cara yang umum dilakukan untuk pemeriksaan kemurnian
secara spektrofotometeri UV-Vis yaitu :
1. Melalui penetapan harga absorban maksimum
2. Melalui penetapan ratio absorban yang diukur pada dua panjang gelombang
yang berbeda. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan persyaratan yang
tertera dalam buku resmi.
6
Jika absorptivitas suatu senyawa pada panjang gelombang absorpsi
maksimumnya telah diketahui dari perhitungan ataupun dari literatur, maka kadar
larutan senyawa yang sama dapat dihitung juga. Larutan senyawa dengan kadar
tidak diketahui dibuat dalam pelarut yang sama sengan larutan senyawa yang
diketahui kadarnya.
Kadar larutan pembanding harus dibuat sesuai dengan kadar dimana
hukum Lambert-Beer masih dipenuhi. Maka kadar larutan uji dapat dihitung : c =
A/b.a , dimana A = absorban larutan uji, b = tebal kuvet dan a = absorptivitas
jenis.
Metode sederhana yang disebut one point dapat digunakan terutama pada
penentuan kadar secara rutin dimana pengukuran dilakukan dengan menggunakan
panjang gelombang absorpsi maksmum, suhu, pelarut dan piranti yang sama pula.
Larutan uji dibandingkan terhadap larutan baku yang kadar dan kemurniannya
diketahui. Pengukuran absorban larutan uji dan larutan baku dilakukan dengan
prosedur yang sama.
Maka Hukum Beer dapat ditulis : Ap = ab Cp dan As = ab C s
Selanjutnya kedua persamaan itu dibandingkan : Cs = As x Cp / Ap
7
3. Penentuan panjang gelombang maksimum
Dibuat dengan membuat kurva hubungan antara serapan dengan panjang
gelombang dari suatu larutan baku pembanding pada konsentrasi dan
pelarut tertentu. Konsentrasi pengukuran dapat dihitung dengan membagi
serapan kesalahan fortometri terkecil yaitu 0,4343 dengan nilai A11 ( C =
0,4343/ A11.b). jika tidak terdapat nilai A11 maka konsentrasi pengukuran
dapat dimulai dari konsentrasi 5,0 g/ml – 10 g/ml. Panjang gelombang
maksimum ditentukan dari panjang gelombang yang mempunyai serapan
maksimal. Untuk pengukuran pada daerah sinar tampak (visible) terlebih
dahulu harus dicari waktu kerja yang terbaik (operating time).
Dan untuk melihat apakah kurva kalibrasi ini memenuhi persyaratan atau
adanya hubungan yang linier antara serapan dan konsentrasi maka perlu
dihitung uji koefisien korelasi (r). Hubungan linier dikatakan paling baik
bila koefisien korelasi yang diperoleh mendekati 1 dan batas persyaratan
dari koefisien korelasi yang masih dapat diterima adalah r= 0,9950
(Clark’s, 2005) .0,95 (Shargel, L). Untuk melihat seberapa besar
8
pengaruh konsentasi terhadap serapan dapat dilihat dari uji koefisien
determinasi (r2), misal koefisien determinasi (r2) = 0,9999, artinya 99.99%
pengaruh konsentrasi terhadap serapan yang dapat dijelaskan oleh garis
regresi dan 0,1% yang tidak dapat dijelaskan oleh garis regresi tersebut.
Koefisien korelasi dapat dihitung menggunakan rumus :
1 1 1 1 1
Pada →A = Ai + Aii = i b cii ......................................(1)
2 2 2 2 2
Pada →A = Ai + Aii = i b cii ......................................(2)
9
PERCOBAAN 1
Tujuan percobaan
1. Mahasiswa memahami cara kerja instrumen Spektrofotometer UV untuk
analisis kuantitatif.
2. Mahasiswa mampu menhitung konsentrasi pengukuran vitamin B6 dalam
pelarut HCL 0,1 N menggunakan A11.
3. Mahasiswa mampu menghitung kadar vitamin B6 dalam tablet menggunakan
persamaan regresi dan cara pendekatan.
Baku Pembanding
Piridoksin Hidroklorida (vitamin B6) BPFI, sebelum digunakan dikeringkan
dalam hampa udara diatas silika gel P selama 4 jam (F.I Ed IV,1995).
Persyatratan Kadar
Tablet piridoksin HCL mengandung piridoksin hidroklorida, C18H11NO3. HCL
tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih dari 115,0% dari jumlah yang tertera
pada etiket (F.I Ed IV).
10
Alat
1. Spektrofotometer UV-VIS 1240 (Shimadzu)
2. Labu tentukur 25 ml dan 50ml
3. Corong penyaring
4. Mortir dan stamfer
5. Volume pipet 2 ml, 5 ml dan 10ml
6. Beaker gelas 250 ml
Bahan
1. Piridoksin HCL BPFI
2. Tablet Piridoksin generik (10mg/tablet)
3. HCL 0.1N
N HCl pekat = x = =
= 11.96 12 N
Untuk membuat 1000 ml larutan HCl o.1 N dengan mengencerkan 8,5 ml asam
klorida pekat dengan aquades sampai 1000 ml.
V1 N1 = V2 N2
V1. 12 = 1000 ml 0.1
V1 = 8.333 ml 8.5 ml
11
III. Penentuan panjang gelombang maksimum
Peentuan konsentrasi pengukuran menggunakan rumus :
A = A11 . b. C (g/100 ml)
0,4343 = 523 x 1 x c (g/100 ml)
C =0,0008304 (g/100 ml) = 0,8304 mg/100ml = 8,304 /ml
0,8 /ml pipet 2,0 ml LIB II (100 /ml) masukkan kedalam labu tentukuru
25 ml, encerkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda (8,0 /ml).
Kemudian larutan ini diukur serapannya pada λ 200 nm – 400 nm
( Lampirkan data dan gambar kurva serapan)
Y = aX =b
∑ ∑ ∑
R=
√ ∑ ∑ ∑ ∑
12
V. Prosedur Penentuan Kadar Tablet Piridoksin HCL (Vitamin B6)
Timbang dan serbukkan tidak kurang 20 tablet kemudian seksama sejumlah
serbuk setara 10 mg piridoksin HCl, masukkan ke dalam labu tentukur 100
ml, tambahkan 20 ml HCl 0,1 N, kocok kemudian encerkan dengan HCl 0,1
N sampai garis tanda, saring, buang 10 ml filtrat pertama dan filtrat selanjtnya
ditampung (konsentrasi teoritis 100 )
Pipet 2,0 ml filtrat, masukkan kedalam labu tentukur 25 ml, encerkan dengan
HCl 0,1 N sebagai blanko.
Konsentrasi sampel (X) dapat dihitung dengan mensubtitusikan serapan yang
diperoleh ke (Y) ari persamaan regrasi : Y = aX = b sehingga diperoleh X dan
ini disebut dengan konsentrasi perolehan.
Konsentrasi sampel juga dapat juga dihitung menggunakan rumus pendekatan
:
Rumus pendekatan :
13
Data penimbangan serbuk dan kadar
NO Bobot Serbuk Bobot Serapan Kadar Kadar Kadar
yang rata-rata (A) perolehan vitamin (%)
ditimbang (mg) vitamin B6/etiket(mg)
(mg) B6/tablet(mg)
1. 0,00
2. 4,00
3. 6,00
4. 8,00
5. 10,00
6. 12,00
VI. Tugas :
1. Jelaskan mengapa λ Maks harus ditentukan.
2. Berikan komentar dari hasil penentuan panjang gelombang
3. Hitung berat penimbangan serbuk yang setara dengan 10 mg piridoxin
HCl
4. Hitung persamaan regresi dan berikan kesimpulan dari koefisien korelasi
yang diperoleh
5. Hitung kadar vitan B6 dalam tablet menggunakan persamaan garis regresi
dan pendekatan
6. Jelaskan perlakuan terhadap baku pembanding
7. Jelaskan cara identifikasi vitamin B6 dalam sampel yang ditentukan
8. Berikan kesimpulan dari hasil percobaan dengan persyaratan kadar
vitamin B6 dalam tablet menurut Farmakope Indonesia.
Lembar Kerja :
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
14
15