Labiqah, A

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT

7 BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH
SKRIPSI
AMALIAH LABIQAH
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2012
Skripsi Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Amaliah Labiqah
Sistem Abdominal Rayap Tanah.
AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT

7 BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH
SKRIPSI
AMALIAH LABIQAH
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2012
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI
Judul : Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7
Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah
Penyusun : Amaliah Labiqah
NIM : 080810521
Pembimbing I : Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si
Pembimbing II : Dr. Sri Sumarsih, M.Si
Tanggal seminar : 16 Juli 2012
Disetujui oleh :
Pembimbing I, Pembimbing II,
Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si Dr. Sri Sumarsih, M.Si
NIP. 19630615 198701 2 001 NIP. 19600110 198810 2 001
Mengetahui,
Ketua Departemen Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga
Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA

NIP 19671115 199102 2 001
iii
PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI
Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam
lingkungan Universitas Airlangga. Diperkenankan untuk dipakai sebagai referensi
kepustakaan, tetapi pengutipan seijin penulis dan harus menyebutkan sumbernya
sesuai kebiasaan ilmiah.
Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat serta
karunia yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan
judul “Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri
Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap” dengan tepat waktu.
Skripsi ini disusun dengan dukungan dan bantuan berbagai pihak. Oleh
karena itu dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada :
1. Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen pembimbing I
dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si selaku dosen pembimbing II yang telah dengan
sabar meluangkan waktu dan pikiran untuk memberikan bimbingan
kepada penulis hingga skripsi ini dapat terselesaikan.
2. Drs. Ali Rohman selaku penguji proposal, Dr. Purkan, M.Si selaku dosen
penguji skripsi dan Drs. Handoko Darmokoesoemo, DEA selaku dosen
penguji skripsi sekaligus dosen wali yang telah memberikan masukan dan
pengarahan kepada penulis.
3. A. A. Istri Ratnadewi S.Si, M.Si yang telah memberikan projek penelitian.
4. Seluruh staf pengajar program studi S1 Departemen Kimia Fakultas Sains
dan Teknologi yang telah memberikan bekal ilmu yang semoga
memberikan manfaat di kemudian hari.
5. Kedua orang penulis yang selalu memberikan kasih sayang, semangat dan
do’a sehingga penulis mampu sampai pada tahap ini.
v
6. Kelompok peneliti Laboratorium Proteomik yang telah memberikan ilmu
dan bimbingan di Laboratorium.
7. Teman-teman kelompok penelitian Biokimia dan teman-teman S1, S2 dan
S3 Kimia Universitas Airlangga yang saling memberikan semangat,
dukungan dan saran dalam proses penyusunan skripsi.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh
karena itu kritik dan saran yang sifatnya membangun untuk menyempurnakan
sangat diperlukan oleh penulis. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat
bagi penulis dan pembaca.
Surabaya, 30 Juli 2012
Penulis
Amaliah Labiqah
vi
Amaliah Labiqah, 2012, Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal

Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah. Skripsi ini di
bawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si dan Dr. Sri
Sumarsih, M.Si, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi,
Universitas Airlangga, Surabaya.
ABSTRAK
Enzim-enzim xilanolitik berperan penting dalam mengolah limbah-limbah

pertanian yang sebagian besar mengandung hemiselulosa dengan xilan sebagai
komponen utamanya. Salah satu enzim xilanolitik yang mampu mendegradasi
xilan adalah enzim endo-1,4-β-xilanase. Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi
gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sistem
abdominal rayap tanah. Amplifikasi dilakukan dengan metode PCR menggunakan
sepasang primer forward dan primer reverse yang didesain masing-masing
dengan nama endoF dan endoR. Hasil elektroforesis produk PCR menunjukkan
gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dapat teramplifikasi dengan ukuran sekitar
0,5bp.
Kata kunci :bakteri xilanolitik, rayap tanah,endo-1,4-β-xilanase, amplifikasi,

PCR
vii
Amaliah Labiqah, 2012, Amplification Gene Encoding Endo-1,4-β-xylanase

From Xylanolytic Bacterial Isolate 7 of Soil Termite Abdominal System.
Script is under the guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si
and Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Department of Chemistry, Faculty of Science
and Technology, Airlangga University, Surabaya.
ABSTRACT
Xylanolytic enzymes play an important role in the processing of agricultural

wastes which contain most of the hemicelluloses with xylan as its mainc
omponent. Oneof enzyme that is able to degrade xylan is endo-1 ,4-β-xylanas
enzyme. In this research the amplification of the gene encoding endo-1 ,4-β-
xylanase was isolated from xylanolytic bacterial isolates 7 of soil termite
abdominal system. Performed by PCR amplification using the primer pair of
forward and reverse primers designe drespectively by name endoF and EndoR.
PCR product electrophoresis showed genes encoding endo-1,4-β-xylanase can be
amplified in size about 0,5 bp.
Keywords : xilanolitic bacteria, soil termite, endo-1,4-β-xilanase, amplification,

PCR
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ....................................................................................... i

LEMBAR PERNYATAAN ............................................................................. ii
LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. iii
LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI ...................................... iv
KATA PENGANTAR ...................................................................................... v
ABSTRAK................................................................................................ ........ vii
ABSTRACT................................................................................................ ...... viii
DAFTAR ISI ..................................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xi
DAFTAR LAMPIRAN............................................................................. ....... xii
DAFTAR SINGKATAN .................................................................................. xiii
BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ 1

1.1 Latar Belakang Masalah .................................................................. 1
1.2 Rumusan Masalah ........................................................................... 3
1.3 Tujuan Penelitian............................................................................. 4
1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 5

2.1 Rayap ............................................................................................... 5
2.2 Xilan ................................................................................................ 8
2.3 Enzim-enzim xilanase ..................................................................... 9
2.3.1 Enzim Ekso-xilanase ............................................................ 9
2.3.2 Enzim Endo-1,4-β-xilanase .................................................. 9
2.3.3 Enzim β-xilosidase ............................................................... 11
2.3.4 Enzim α-L-arabinofuranosidase ........................................... 11
2.4 Polimeration Chain Reaction ........................................................... 12
2.4.1 Langkah dan Komponen PCR ....................................... ..... 12
2.4.2 Desain Primer PCR .............................................................. 14
2.5 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa ......................... 18
2.6 Sekuensing DNA .............................................................................. 19
2.7 Sequence Aligment dan Program BLAST ........................................ 20
BAB III METODE PENELITIAN ................................................................. 22

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ......................................................... 22
3.2 Sampel, Bahan dan Alat Penelitian ................................................. 22
3.2.1 Sampel Penelitian ............................................................... 22
3.2.2 Bahan Penelitian .................................................................. 22
3.2.3 Alat Penelitian ..................................................................... 23
3.3 Prosedur Penelitian ......................................................................... 23
3.3.1 Pembuatan Media ................................................................ 23
3.3.1.1 Pembuatan LB cair .................................................. 23
3.3.1.2 Pembuatan LB padat .............................................. 23
ix
3.3.2 Peremajaan Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap

Tanah Isolat 7 ...................................................................... 24
3.3.3 Isolasi DNA Kromosom ...................................................... 24
3.3.4 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa ............. 25
3.3.5 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan
Teknik PCR ......................................................................... 26
3.3.6 Purifikasi Produk PCR ....................................................... 27
3.3.7 Sekuensing Amplikon dengan Metode Sanger ................... 27
3.4 Skema Kerja .................................................................................... 28
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi DNA Kromosom Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal
Rayap Tanah Isolat 7 ....................................................................... 29
4.2 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode
PCR ................................................................................................. 31
4.3 Purifikasi atau Pemurnian DNA Produk PCR................................. 41
4.4 Analisis Urutan Basa Nukleotida Gen Penyandi Endo-1,4-β-
xilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal
Rayap Tanah.................................................................................... 42
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan....................................................................................... 44
5.2 Saran ................................................................................................. 44
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 45
x
DAFTAR GAMBAR
Nomor Judul Gambar Halaman
2.1 Rayap .......................................................................................... 6
2.2 Sistem enzimatis dan aspek metabolisme rayap ......................... 7
2.3 Struktur xilan tumbuhan dan lokasi kerja enzim xilanolitik ....... 9
2.4 Siklus PCR .................................................................................. 14
2.5 Peta plasmid pYES2 .................................................................... 18
4.1 Hasil elektroforesis DNA kromosom ........................................... 30
4.2 Hasil alignment Bacillus subtilis............................................... 32
4.3 Analisis primer forward (endoF) ................................................. 34
4.4 Analisis primer reverse (endoR) .................................................. 35
4.5 Hasil alignment gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus
subtillis dengan primer endoF dan primer endoR ................................. 36
4.6 Hasil elektroforesis PCR menggunakan primer endoF dan endoR. 38
4.7 Analisis primer forward dan primer reverse desain 2.................. 39
4.8 Desain primer 2...................................................................... 40
4.9 Hasil elektroforesis PCR menggunakan desain primer 2............. 41
4.10 Hasil elektroforesis amplikon PCR yang telah dimurnikan.......... 42
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Judul Lampiran Halaman
1 Pembuatan Larutan TE............................................................... 49
2 Pembuatan Larutan Lisosim ......................................................... 49
3 Pembuatan Larutan STEP ............................................................ 50
4 Pembuatan Na-Asetat 3 M ........................................................... 50
5 Electropherogram hasil sekuensing ............................................. 50
xii
DAFTAR SINGKATAN
bp : base pair
ddH2O : double destilateH2O
DNA : Deoxyribo Nucleic Acid
dNTP : deoksiribonukleotida
EtBr : Etidium Bromide
GH :Glikosida Hidrolase
STEP : SDS-TrisCl-EDTA-Proteinase K
LB : Luria Bertani
TAE : Tris base-Asam Asetat-EDTA
TE : Tris Cl, EDTA
Tm : Melting Temperature
PCR : Polimeration Chain Reaction
RNA : Ribo Nucleic Acid
xiii
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Negara Indonesia memiliki kekayaan alam yang berlimpah, termasuk sektor
agroindustri. Produk dari sektor agroindustri menghasilkan limbah-limbah
pertanian yang diakumulasikan kurang baik di lingkungan dan terbuang sebagai
sampah. Limbah-limbah tersebut diantaranya adalah tongkol jagung, ampas tebu,
dedak padi dan jerami yang memiliki kandungan hemiselulosa. Komponen
penyusun hemiselulosa berdasarkan monomer penyusun gulanya terbagi menjadi
xilan, arabinan, manan dan arabinogalaktan (Beg et al, 2001). Jika dihidrolisis,
hemiselulosa memiliki potensi untuk menghasilkan produk yang bermanfaat.
Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang bisa dihidrolisis
menjadi xilosa dan xilooligosakarida. Hidrolisis xilan dilakukan dengan bantuan
biokatalis enzim yaitu enzim xilanase. Kelompok utama enzim xilanase yang
memutus ikatan glikosidik pada xilan terbagi menjadi endo-1,4-β-xilanase dan β-
xilosidase (Girio et al, 2010). Endo-1,4-β-xilanase berfungsi untuk memutus
ikatan β-1,4 pada rantai utama xilan menjadi xilooligosakarida. Sedangkan β-
xilosidase menghidrolisis xilooligosakarida menjadi xilosa. Pemanfaatan enzim
endo-xilanase dalam dunia industri diantaranya adalah untuk industri makanan,
farmasi, kertas, prebiotik serta bahan bakar yang dapat diperbaharui (Sriyapai et
al, 2010).
2
Enzim endo-xilanase telah diisolasi dan dikarakterisasi dari bermacam
mikroorganisme termasuk bakteri, ragi dan jamur berfilamen (Zhang et al, 2009).
Salah satu jenis organisme di alam yang melakukan aktivitas pendegradasi endo-
xilanase adalah rayap yang mendegradasi hemiselulosa dengan enzim xilanolitik
dari tubuh rayap itu sendiri atau oleh mikroorganisme yang bersimbiosis dengan
rayap (Purwadaria et al, 2004; Faulet et al, 2006). Tarumingkeng (1971),
menyebutkan bahwa protozoa flagellata atau bakteri dalam intestin rayap
menghasilkan enzim-enzim untuk membantu rayap memanfaatkan selulosa dalam
sistem pencernaannya. Protozoa flagellata dalam intestin bagian belakang dari
berbagai jenis rayap (terutama rayap tingkat rendah seperti Mastotermitidae,
Kalotermitidae, dan Rhinotermitidae) berperan sebagai simbion untuk memecah
selulosa sehingga dapat dicerna dan diserap oleh rayap.
Ratnadewi dkk. (2007), telah melakukan penelitian tentang isolasi,
purifikasi serta karakterisasi untuk mendapatkan enzim endo-xilanase dari bakteri
xilanolitik sistem abdominal rayap tanah yang disebut sebagai isolat 7 dan telah
diidentifikasi secara mikrobiologis memiliki homologi dengan Bacillus subtillis.
Bacillus subtillis merupakan bakteri penghasil enzim endo-xilanase GH11. Pokok
riset saat ini telah mengarah pada kebutuhan akan suatu isolat dan identifikasi
organisme yang merupakan penghasil utama (hyper-producer) sebagai produsen
enzim xilanolitik baru. Berhubungan dengan hal tersebut penelitian yang banyak
dikembangkan diantaranya amplifikasi gen, kloning, karakterisasi dan ekspresi.
Amplifikasi merupakan proses pengambilan gen tertentu dari suatu DNA
kromosom yang dilakukan secara in vitro melalui teknik PCR (Brown, 2001).
3
Amplifikasi gen, dapat memperkaya sekuens fragmen gen DNA secara berlimpah
dan dapat digunakan untuk memperkuat gen spesifik sebelum diklon. Cara kerja
dari amplifikasi menggunakan teknologi PCR sangat spesifik. PCR membutuhkan
suatu primer spesifik yang akan membantu DNA polimerase menambahkan basa
nukleotida pada DNA cetakan sehingga fragmen DNA dapat diperbanyak dengan
proses yang sangat cepat.
Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-
xilanase yang berasal dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat
7. Gen endo-1,4-β-xilanase diamplifikasi dengan metode PCR menggunakan
sepasang primer yang akan didesain berdasarkan urutan basa nukleotida gen
penyandi endo-1,4-β-xilanase asal Bacillus subtilis GH 11 dari Genbank. Primer
untuk mengamplifikasi gen penyandi enzim endoxilanase yaitu endoF untuk
primer forward dan endoR untuk primer reverse. Hasil amplifikasi PCR ini
kemudian dianalisis urutan basa nukleotida penyusunnya dengan melakukan
sekuensing.
1.2 RumusanMasalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan maka dapat dirumuskan
masalah penelitian : apakah gen penyandi endo-xilanase dari bakteri xilanolitik
sistem abdominal rayap tanah isolat 7 dapat diamplifikasi dengan metode PCR?
4
1.3 Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang masalah dan rumusan masalah yang telah
dikemukakan, maka tujuan dari penelitian ini adalah mengamplifikasi gen
penyandi endo-xilanase dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah
isolat 7 dengan metode PCR.
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini yaitu memberikan informasi ilmiah mengenai proses
amplifikasi dan urutan sekuens gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dari bakteri
xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7. Untuk selanjutnya dapat
dikembangakan penelitian yang bebabasis kloning dan ekspresi gen penyandi
enzim endo-xilanase.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Rayap
Rayap merupakan serangga pemakan selulosa yang berukuran sedang,
merupakan ordo Isoptera yang terdiri dari kira-kira 1900 jenis di dunia.Rayap
hidup dalam kelompok-kelompok yang terpadu.Walaupun rayap secara populer
disebut sebagai semut putih, rayap bukanlah semut.Rayap paling erat
kekerabatannya dengan kecoak. Rayap bertubuh lunak dan berwarna putih, sayap
depan dan belakang sama ukurannya dan diletakkan datar di atas abdomen saat
tidur.Rayap seringkali membersihkan satu sama lain dengan bagian mulut mereka
sebagai satu akibat dari daya tarik sekresi yang biasanya dapat diperoleh pada
tubuhnya. Makanan rayap terdiri dari kupasan kulit dan tinja individu-individu
lain, tumbuhan, kayu-kayuan dan bahan-bahan lain yang mengandung
selulosa.Semula agak mengherankan para pakar bahwa rayap mampu mencerna
selulosa karena manusia sendiri tidak mampu mencernakan selulosa, sedangkan
rayap mampu melumatkan dan menyerapnya sehingga sebagian besar hanya
tinggal lignin saja. Keadaan menjadi jelas setelah ditemukan berbagai protozoa
flagellata dalam usus bagian belakang dari berbagai jenis rayap (terutama rayap
tingkat rendah: Mastotermitidae, Kalotermitidae dan Rhinotermitidae), yang
ternyata berperan sebagai simbion untuk melumatkan selulosa sehingga rayap
mampu mencernakan dan menyerap selulosa. Bagi yang tak memiliki protozoa
seperti famili Termitidae, bukan protozoa yang berperan tetapi bakteri dan bahkan
5
6
pada beberapa jenis rayap seperti Macrotermes, Odontotermes dan Microtermes
memerlukan bantuan jamur perombak kayu (Tarumingkeng, 2001). Klasifikasi
dari rayap adalah sebagai berikut
Gambar 2.1 Rayap (Wikipedia, 2011)
Domain : Eukariota
Kerajaan : Animalia
Sub Kerajaan : Metazoan
Filum : Artropoda
Kelas : Serangga
Ordo : Isoptera
Famili : Mastotermitidae
Kalotermitidae
Termopsidae
Hodotermitidae
Rhinotermitidae
Serritermitidae
Termitid
7
Adapun sistem enzimatis dan aspek metabolisme dalam tubuh rayap
ditunjukkan pada Gambar2.2 berikut.
Perut bagian utama

Hidrogenosom
Bakteri
metanogeni
k
Perut bagian tengah
(endoglukanase, Bakteri
pereduksi CO2 Asetat
sellobiase) asetogenik
CO2, H2,
asetil As. Org. asetat Asetat
Piruvat
Ko-A Lingkungan
Selulase Pakan
Glukosa anaerobik
prectodeal
Mono-,di-, & Bakteri
oligosakarida fermentatif
Bakteri
Selulosa Kelenjar saliva fakultatif &
native Bakteri fiksasi obligat
(endoglukanase, Asam amino
N2 heterotrofik anaerob
sellobiase)
Flagellata
Selulosa anaerob
Gambar 2.2. Sistem enzimatis dan aspek metabolisme rayap (Radek, 1999)
Berdasarkan lokasi sarang utamanya, rayap digolongkan menjadi sebagai
berikut (Tarumingkeng, 2001) :
a. Rayap pohon, yaitu jenis-jenis rayap yang menyerang pohon yang masih
hidup, bersarang dalam pohon dan tak berhubungan dengan tanah, misalnya
Neotermes tectonae (Kalotermitidae) yang merupakan hama pohon jati.
b. Rayap kayu lembab, yaitu rayap yang menyerang kayu mati dan lembab,
bersarang dalam kayu, tak berhubungan dengan tanah, misalnya jenis-jenis
rayap genus Glyptotermes spp. (Kalotermitidae).
c. Rayap subterranean, yaitu rayap yang umumnya hidup di dalam tanah yang
mengandung banyak bahan kayu yang telah mati atau membusuk, serta
tunggak pohon baik yang telah mati maupun masih hidup.
8
d. Rayap kayu kering, yaitu rayap yang hidup dalam kayu mati yang telah
mengering dengan sarang yang tidak berhubungan dengan tanah karena
habitatnya yang kering, misalnya Cryptotermes sp (Kalotermitidae).
e. Rayap tanah, yaitu rayap yang bersarang dalam tanah terutama dekat
bahanorganik yang mengandung selulosa seperti kayu, serasah, dan humus,
misalnya yang terdapat di Indonesia adalah famili Termitidae.
2.2 Xilan
Xilan merupakan komponen utama dari hemiselulosa pada dinding sel
tanaman yang terikat kovalen dan non-kovalen pada selulosa, lignin, pektin dan
polisakarida lainnya untuk membentuk dinding sel (Zhou et al.,2008). Xilan
adalah suatu polimer dengan rantai tulang punggung homopolimer unit-unit residu
β-1,4 D-xilopiranosa yang disubtitusi oleh O-asetil, α-L-arabinofuranosil, dan
kelompok glukoronosil (Cheng et al,2008). Keberadaan xilan yang bersifat dapat
diperbaharui ini sangat berlimpah, terutama pada limbah pertanian, sehingga
mempunyai potensi yang sangat besar untuk diuraikan menjadi produk akhir yang
berguna (Puspaningsih, 2005).Untuk menghasilkan produk yang berguna,
diperlukan hidrolisis xilan.Hidrolisis xilan dengan enzim membutuhkan enzim-
enzim pendegradasi xilan.Enzim-enzim pendegradasi xilan disebut enzimxilanase.
Berikut struktur xilan pada tumbuhan beserta lokasi kerja enzim-enzim xilanolitik
yang membantu hidrolisis xilan
9
Gambar 2.3 Struktur xilan tumbuhan dan lokasi kerja enzim xilanase(Beg et al,
2001)
2.3 Enzim-enzim Xilanase
2.3.1 Enzim Ekso-xilanase
Eksoxilanase adalah enzim yang mengkatalisis hidrolisis ikatan β-1,4-D-
xilosa pada kerangka utama xilan untuk menghasilkan xilobiosa pada
heteroarabinoxilan (Saha, 2003). Enzim ini mampu memutus rantai polimer xilosa
pada ujung non pereduksi, sehingga menghasilkan xilan sebagai produk utama
dan sejumlah oligosakarida rantai pendek (Richana, 2002).
2.3.2 Enzim Endo-1,4-β-xilanase
Endo-1,4-β-xilanase pada awalnya telah dilaporkan sebagai pentosanase
yang selanjutnya diperkenalkan oleh International Union of Biochemistry and
Molecular Biology (IUBMB) pada tahun 1961 dengan kode EC 3.2.1.8. Endo-1,4-
10
β-D-xilanase sering disebut sebagai xilanase, endoxilanase, 1,4-β-D-xilan-
xilanohidrolase, β-1,4-xilanase dan β-xilanase (Ratnadewi,2007).Endo-1,4-β-
xilanase dapat dihasilkan oleh bakteri, fungi, actinomycetes dan beberapa lainnya
dihasilkan oleh tumbuhan dan hewan. Berdasarkan homologi asam amino sekuens
dan analisis ikatan hidrofobik endo-1,4-β-xilanase digolongkan ke dalam 2 famili
glikosil hidrolase (GHF) yaitu GH 10 dan GH 11. GHF 10 dapat ditemukan pada
tanaman, fungi, dan bakterial enzim.GHF 11dapat ditemukan pada fungi dan
bacterial enzim (Zhou et al,2008). Berdasarkan massa molekul dan titik
isoelektrik (pI), famili 10 memiliki massa molekul yang tinggi (>30 kDa) dan pI
yang rendah, sedangkan famili 11 memiliki massa molekul yang rendah (<30
kDa) dan pI yang tinggi (Sriyapai et al,2011). Perbedaan sifat katalitik dari kedua
famili tersebut adalah famili 10 mampu menyerang ikatan glikosidik di sebelah
titik cabang dan mengarah ke ujung non-pereduksi dengan menggunakan dua
residu xilopiranosil non-substitusi antara cabang-cabang, sedangkan famili 11
menggunakan tiga residu xilopiranosil non-substitusi (Puspaningsih, 2005).
Enzim xilanase merupakan kompleks enzim yang memiliki kemampuan
menghidrolisis xilan atau polimer dari xilosa dan xilooligosakarida. Oleh karena
fungsinya tersebut, enzim xilanase dimasukkan dalam golongan hidrolase. Potensi
dari aplikasi xilanase saat ini menjadi perhatian utama bagi para peneliti. Pada
pembuatan kertas dan pulp, xilanase digunakan untuk proses bleaching. Xilanase
membuat pulp kertas dengan menghidrolisis xilan dan melepaskan lignin sehingga
mengurangi penggunaan Klorin sebagai agen bleaching (Mishra and
Thakur,2011).Jika xilanase dikombinasikan dengan pektinase, bisa menjadi
11
alternatifideal untuk mengurangi polusi degradasi alkalin di alam untuk
memproduksi serat dengan kualitas yang baik (Huang et al., 2006).Xilanase dalam
industri makanan banyak digunakan untuk pengembang roti, penjernihan jus,
ekstraksi kopi, minyak nabati dan pati. Industrilain yang banyak memanfaatkan
penggunaan xilanase yaitu industri farmasi, pakan ternak dan pasta gigi.
2.3.3 Enzim β-xilosidase
Enzim ini diproduksi oleh bermacam-macam bakteri dan fungi, dan
mungkin juga ditemukan di kulturfluid (Coughlan et al., 1992).Berdasarkan
persamaan runtunan N-terminalnya, maka enzim β-xilosidase dapat digolongkan
ke dalam famili glikosida hidrolase 10, 3, 39, 43, 52, dan 54 (Henrisat et al.,
2003). Enzim ini berfungsi untuk menghidrolisis 1,4- β-D-xilooligosakarida dari
ujung non-pereduksi dan melepaskan xilosa. Selain itu enzim β-xilosidase juga
mempunyai aktivitas transferase, sebagai tambahan terhadap proses hidrolisis
secara langsungdan menunjukkan kekhususan untuk gula dan ikatan.
2.3.4 Enzim α-L-arabinofuranosidase
Corral et al (2006) menyebutkan ada dua tipe enzim α-L-
arabinofuranosidaseyaitu :
a. α-L-arabinofuranosidase tipe ekso (EC 3.2.1.55) yang menunjukkan aktivitas
hidrolisisnya terhadap p-nitrofenil- α-L-arabinofuranosida dan arabinan yang
bercabang.
b. α-L-arabinofuranosidase tipe endo (EC 3.2.1.99) yang hanya dapat
menghidrolisis arabinan yang linear dan tidak menunjukkan aktivitasnya
terhadap p-nitrofenil- α-L-arabinofuranosida.
12
Enzim α-L-arabinofuranosidase mempunyai fungsi untuk menghidrolisis ujung
non-pereduksi antara ikatan α-L-arabinofuranosidase dengan berbagai
polisakarida yang mengandung arabinofuranosidase(Debche et al., 2002).
Polisakarida yang mengandung arabinofuranosidase yaitu seperti arabinoxilan,
arabinogalaktan, dan L-arabinan. Aktivitas enzim endo-xilanase dan β-xilosidase
dapat dihambat oleh adanya subtituen α-L-arabinofuranosidase karena struktur α-
L-arabinofuranosidase yang cukup besar yang menyebabkan halangan ruang bagi
aktivitas enzim endo-xilanase dan β-xilosidase (Debche et al., 2002; Shallom et
al., 2002). α-L-arabinofuranosidaseyang belum melalui proses
pemurniandiketahui mempunyai berat molekul yang berkisar antara 53-495 kDa
dan nilai pI beravariasi antara 3,6 sampai 9,3 serta pH optimum sekitar 2,5 sampai
6,9 (Corral et al, 2006).
2.4 Polimeration Chain Reaction (PCR)
2.4.1 Langkah dan Komponen PCR
PCR adalah suatu metode untuk melipatgandakan suatu pita DNA secara in
vitro.Metode PCR dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1986. Yuwono
(2006) mengemukakanempat komponen utama pada proses PCR yaitu : (1) DNA
cetakan yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, (2) oligonukleotida
primer yang digunakan untuk mengawali sintesis DNA, (3) deoksiribonukleotida
(dNTP), dan (4) enzim polimerase yang melakukan katalis.
Reaksi pelipatgandaan DNA dimulai dengan denaturasi DNA cetakan
sehingga rantai DNA untai gandaakan terpisah menjadi DNA untai
13
tunggal.DNAuntai ganda didenaturasi oleh pemanasan pada reaksi dengan suhu
90°-95˚C selama 5 menit (Irawan, 2008). Untuk proses pengkopian DNA, reaksi
campuran diturunkan ke dalam suhu 50-60 °C yang disebut sebagaiproses
penempelan atau annealing. Pada proses annealing, primer akan membentuk
jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuens yang komplementer
dengan sekuens primer. Dalam proses annealing, pemilihan suhu yang tepat
adalah hal yang kritis. Setiap sistem PCR harus dilakukan secara optimal. Jika
tidak demikian bisa jadi mengangkat DNA lain ke dalam DNA spesifik atau bisa
jadi tidak memproduksi produk amplifikasi secara keseluruhan (Walker and
Rapley,2009). Amplifikasi gen pada dasarnya akan lebih efisien jika dilakukan
pada suhu yang rendah, tetapi biasanya akan terjadi mispriming yaitu penempelan
primer pada cetakan yang salah (Yuwono,2006). Pada suhu yang lebih tinggi,
spesifitas reaksi amplifikasi akan meningkat, tetapi secara keseluruhan
efisiensinya akan menurun. Setelah dilakukan annealing,suhu dinaikkan
72°C.Pada suhu ini DNA polimerase akan melakukan polimerasi rantai DNA
yang baru berdasarkan informasi pada DNA cetakan.Setelah terjadi polimerasi,
rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan.
DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan rantai hidrogen antara
rantai DNA cetakan dengan rantai DNA baru hasil polimerasi selanjutnya akan
didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95°C, rantai DNA
yang baru selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi
selanjutnya. Reaksi diulang 30-40 siklus sehingga pada akhir siklus akan
didapatkan molekul DNA rantai ganda baru hasil polimerasi dalam jumlah yang
14
jauh lebih banyak dibandingkan jumlah cetakanyang digunakan.Yuwono (2006)
menyebutkan beberapa aplikasi PCR dalam kehidupan yaitu untuk amplifikasi
DNA genom, menghitung jumlah mRNA, analisis sidik jari DNA, probe DNA.
Gambar 2.4 Siklus PCR (Brown,2010)
2.4.2 Desain Primer PCR
Kunci dari PCR terletak pada desain dua oligonukleotida primer. Fungsi
dari primer yaitu mengapit atau membatasi sekuens DNA yang akan
diamplifikasi. Tanpa adanya primer, reaksi polimerasi DNA tidak akan terjadi
15
meskipun enzim dan komponen DNA lainnya sudah tersedia. Primer yang
digunakan dalam amplifikasi umumnya terdiri dari dua jenis primer, yaitu primer
forward dan primer reverse. Kualitas primer sangat mempengaruhi keberhasilan
pada saat PCR, untuk itu dalam mendesain primer ada beberapa parameter yang
digunakan.
Berikut beberapa hal yang perlu diperhatikan dalammendesain primer:
1) Panjang Primer
Panjang primer optimum antara 20-30 bp, Jika primer terlalu pendek
primer dapat melekat pada banyak tempat sepanjang DNA
cetakan.Sebaliknya, jika primer terlalu panjang, dapat menyebabkan
kegagalan replikasi.
2) Melting Temperature (Tm)
Suhu annealing dari PCR didasarkan pada Melting Temperatur (Tm) dari
primer.Suhu leleh atau melting temperature (Tm) adalah temperatur
dimana setengah dari duplex DNA akan terpisah menjadi utas tunggal.
Agar primer dapat menempel ke dalam cetakan, temperatur annealing
harus memenuhi Tm primer.Hasil terbaik biasanya diperoleh jika primer
memiliki 60-70 °C (White, 1997).Primer dengan nilai Tm tinggi, bisa jadi
primer tidak menempel ke dalam DNA target. Sedangkan jika terlalu
rendah, primer akan mengalami mis-annealke sekuens yang tidak
komplemen. Nilai Tm primer bisa dihitung dengan formula Tm = 2(A+T) +
4(G+C).Sepasang primer harus memiliki Tm yang nilainya
16
berdekatan.Jika selisihnya lebih dari 5 °C maka bisa menyebabkan tidak
terjadinya amplifikasi.
3) GC Content
GC content (prosentase jumlah G dan C terhadap jumlah basa total pada
primer) harus berkisar antara 50% G/C dan 50% A/T
4) GC Clamp
Ketika mendesain primer biasanya kita memilih primer yang memiliki G
atau C pada posisi terakhir ujung 3′, karena bisa meningkatkan ikatan
spesifik pada ujung 3′ karena seperti kita tahu ikatan G atau C lebih kuat.
Namun perlu dihindari lebih dari 3 basa G atau C pada 5 basa terakhir
ujung 3′ karena ujung 3′-nya bisa melipat membentuk GC clamp yang
mengakibatkan ujung 3′ primer tidak terikat pada cetakan.
5) Struktur Sekunder Primer
Struktur sekunder primer dapat disebabkan oleh interaksi intra dan inter-
molekuler primer. Hal ini juga amat mempengaruhi kualitas dan kuantitas
produk PCR, karena akan mengurangi kemampuan primer menempel pada
cetakan.
Berikut ini beberapa jenis struktur sekunder primer:
i) Hairpin
Hairpins terbentuk akibat interaksi intramolekuler primer sehingga
membentuk semacam lipatan
17
ii) Self Dimer
Self dimer terbentuk oleh interaksi intermolekuler antara dua
molekul primer yang sama, dimana primer homolog terhadap
dirinya sendiri. Biasanya kita menambahkan primer dalam jumlah
besar dibanding jumlah DNA cetakan, dan ketika primer lebih suka
membentuk dimer intermolekuler ketimbang berhibridisasi dengan
DNA cetakan, maka yield produk tentu akan berkurang.
iii) Cross Dimer
Primer cross dimer terbentuk karena interaksi intermolekuler antara
primer sense dan antisense, dimana keduanya memiliki homologi.
6) Runs
Runsmerupakanpengulangan satu jenis basa. Runs juga harus dihindari
karena dapat menyebabkan mispriming. Jumlah maksimum run yang dapat
diterima adalah 4 basa.
Pada desain primer basa nukleotida yang diambil juga bisa ditambahkan sisi
restriksi sehingga produk PCR yang dihasilkan bisa dimasukkan atau diinsersikan
ke dalam suatu plasmid. Urutan sisi pengenal enzim restriksi yang ditambahkan
18
adalah sisi pengenal enzim restriksi yang terdapat pada multiple cloning side
(MCS) pada vektor plasmid yang diinginkan dan tidak terdapat pada hasil
aligment daerah lestari yang diambil primernya. Pada penelitian ini akan
ditambahkan urutan sisi pengenal enzim restriksi yang terdapat pada plasmid
pYES2. Berikut peta plasmid pYES2 pada Gambar 2.5
Gambar 2.5 Peta Plamid pYES2
2.5 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesismerupakan suatu metode yang digunakan untuk
menganalisis DNA.Gel yang digunakan tersusun atas agarosa atau poliakrilamida.
Agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang ukurannya
19
mempunyai rentang beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa.Sedangkan
poliakrilamida digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil.Gel
agarosa merupakan jaring-jaring kompleks molekul polimer. Molekul DNA yang
bermuatan negatif bergerak melalui gel dengan kecepatan yang berbeda sesuai
ukuran. Elektroforesis gel agarosa seringkali dilaksanakan dengan menggunakan
fragmen-fragmen DNA penanda yang ukurannya sudah diketahui sehingga
memungkinkan ditentukannya ukuran DNA dengan cara interpolasi. Pita-pita
DNA dalam gel terwarnai dengan zat warna etidium bromida.Pita DNA dapat
dilihat dengan bantuan sinar UV (Old and Primrose, 1989).
Beberapa faktor yang mempengaruhi perpindahan DNA dalam gel agarosa
yaitu ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, besarnya voltase yang
digunakan, arah medan listrik, suhu dan komposisi basa, komposisi buffer
elektroforesis(Sambrooket al, 1989).
2.6 Sekuensing DNA
Sekuensing DNA merupakan metode yang digunakan untuk membaca
urutan nukleotida pada molekul DNA yang ditentukan. Ada dua metode yang
digunakan dalam DNA sekuensing yaitu secara enzimatik (pengakhiran rantai)
oleh F. Sanger dan A.R. Coulsan dan cara degradasi kimiawi oleh A. Maxam dan
W. Gilbert (Brown, 2005 ;Smith and Wood, 1991).
Langkah pertama pada eksperimen dengan metode enzimatik dikatalis
oleh fragmen Klenov DNA polimerase I. primer bergabung dengan vektor pada
posisi yang berdekatan dengan poli penghubung. Reaksi sintesis untai DNA
20
komplementer dimulai dengan penambahan polimerase Klenow dan masing-
masing dari keempat deoksinukleotid (dATP, dTTP, dGTP,dCTP).Masing-masing
dATP, dTTP, dGTP,dCTPbersama dengan dNTP membentuk suatu untai DNA
dengan bantuan DNA polimerase dan primer. Dari reaksi tersebut fragmen yang
kesemuanya berakhir dengan satu macam basa dideoksiribosa dibagian ujung
karena basa ini tidak bisa membentuk ikatan fosfodiester. Fragmen-fragmen yang
terbentuk dianalisis dengan elektroforesis gel poliakrilamid. Satu lajur hanya
bermakna satu basa nukleotida.
Metode kedua yaitu metode sekuensing secara degradasi kimiawi dengan
menggunakan piperidin, dimetil sulfat dan hidrazin yang secara selektif
menyerang purin dan pirimidin sehingga menghasilkan fragmen-fragmen.Dalam
proses reaksi tersebut, dimetil sulfat dan piperidina memotong guanin (G),
sedangkan Dimetilsulfat dan Piperidina dalam Asam format akanmemotong kedua
Guanin (G) dan Adenin (A). Demikian pula, hidrazin dan piperidina akan
memotong kedua Timin dan Sitosin sedangkan hidrazin dan piperidina dalam
NaClmemotong Sitosin (C). DNA target sebelumnya dilabeli dengan radioaktif
dan dapat dianalisis melalui autidiograf. Jika fragmen diidentifikasi melalui
elektroforesis gel poliakrilamid akan membentuk empat jalur yaitu jalur 1 basa G,
jalur 2 basa G dan A, jalur 3 basa T dan C dan jalur 4 basa C.
2.7 Sequence Aligment dan Program BLAST
Suatu proses penyusunan atau pengaturan dua atau lebih sekuens sehingga
persamaan sekuens-sekuens disebut sebagai sequence aligment. Metode ini
21
digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari sekuens yang ada
sebelumnya. Ketidakcocokan dalam aligment diasosiasikan dengan proses mutasi,
sedangkan kesenjangan diasosiasikan dengan proses insersi atau delesi. Selain itu
sequence aligment juga digunakan untuk mencari sekuens yang sama dalam basis
data sekuens. BLAST adalah salah satu metode alignment yang sering digunakan
dalam penelusuran basis data sekuens. BLAST menggunakan alogaritma heuristik
dalam penyusunan aligmnet. Kelompok program dari NCBI BLAST terdiri dari :
1. Blastp, membandingkan sekuens asam amino dengan sekuens protein
database
2. Blastn, membandingkan sekuens suatu nukleotida dengan database sekuens
nukleotida lain
3. Blastx, membandingkan sekuens nukleotida dengan database asam amino
4 . tBlastn, pencarian database nukleotida yang telah ditranslasikan dengan
pertanyaan (query) suatu protein
5. tBlastx, pencarian database nukleotida yang telah ditranslasikan dengan
pertanyaan (query) nukleotida yang telah ditranslasikan pula.
Program BLAST dapat juga digunakan untuk beberapa tujuan diantaranya yaitu
mengidentifikasi suatu spesies, melokasikan domains, membuat pohon
filogenetik, mencocokkan DNA serta membandingkan spesies yang masih
memiliki kekerabatan.
22
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Proteomik Institude of Tropical
Disease (ITD) Universitas Airlangga. Penelitian dimulai pada bulan Januari
sampai dengan Juni 2012.
3.2 Sampel, Bahan dan Alat Penelitian
3.2.1 Sampel Penelitian
Sampel penelitian yang digunakan dalam penelitian yaitu bakteri sistem
abdominal rayap tanah isolat 7 dari penelitian Ratnadewi dkk. (2007).
3.2.2 Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian yaitu primer forward
(endoF), primer reverse (endoR), DNA Taq Polimerase, dNTP, Buffer Taq,
dNTP, MgSO4, Tris Cl, Tris HCl, MgCl2, (NH4)2SO4, ddH2O, KIT QIAGEN (QI
Aquick Gel Extraction Kit 50), media Luria Bertani (LB) padat dengan
komposisi: tripton 1%, NaCl 1%, yeast ekstract 0.5% dan bacto-agar 2%. LB
cair yaitu LB tanpa penambahan bacto-agar, buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan
50 mM EDTA), larutan lisozim, larutan STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8,
proteinase K ), fenol jenuh, Na-asetat, etanol absolut, etanol 70%, TAE (Tris
base, Asam Asetat, EDTA pH 8), agarosa, Buffer Loading (campuran Bromofenol
biru dan sukrosa).
22
23
3.2.3 Alat Penelitian
Peralatan yang digunakan dalam penelitian yaitu pH meter, autoklaf, (OSK
6508 Steam pressure apparatus Ogawa Seiki Co., LTD), laminair air flow cabinet
(Kottermann 8580), sentrifuga Beckman (tipe TJ-6), timbangan analitik (Mettler
Toledo), oven (Memmert, Jerman), rotary shaker, lemari pendingin -20 0C (Royal
Chest Freezer BD195), eppendorf, mikro pipet, waterbath, shaker incubator
(Heidolph Polymax 1040), thermocycler, UV transluminator dan alat-alat gelas
yang biasa digunakan di laboratorium.
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Pembuatan Media
3.3.1.1 Pembuatan LB Cair
Media LB cair dibuat dengan melarutkan yeast extract 0,5% (b/v), bacto
trypton 1% (b/v), NaCl 1% (b/v) dalam akuades sampai 100 mL dalam
Erlenmeyer. Bahan yang sudah dicampur kemudian disterilkan menggunakan
autoklaf 121 oC selama 15 menit.
3.3.1.2 Pembuatan LB Padat
Media LB padat dibuat dengan melarutkan bacto-agar 2% (b/v), yeast
extract 0,5% (b/v), bacto trypton 1% (b/v), NaCl 1% (b/v) ke dalam akuades
sampai 100 mL dalam Enlemeyer. Campuran bahan kemudian disterilkan
menggunakan autoklaf 121 oC selama 15 menit. Media yang masih hangat-hangat
kuku kemudian dipindah ke dalam cawan petri steril hingga memadat.
24
3.3.2 Peremajaan Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap
Tanah
Bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7 diremajakan
dengan cara ditumbuhkan pada media LB padat. Koloni Bakteri xilanolitik sistem
abdominal rayap tanah diambil dari biakan lama dengan menggunakan kawat ose.
Kawat ose kemudian digoreskan pada media LB padat lalu diinkubasi pada suhu
37 ˚C selama ±18 jam. Pemindahan biakan bakteri pada media LB ini dilakukan
pada laminar dengan proses yang steril.
3.3.3 Isolasi DNA Kromosom
Koloni bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7
diinokulasikan ke dalam 100 ml LB cair dan diinkubasi pada shaker incubator
pada suhu 37 0C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Suspensi sel
kemudian disentrifugasi 6.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4˚C. Pellet sel
disuspensikan dengan 5 ml buffer TE (Tris HCL EDTA) yang merupakan
campuran tris HCl pH 8 50 mM dan EDTA 50 mM. Pellet yang diperoleh
dibekukan pada suhu -20˚C selama ±30 menit. Setelah itu ditambahkan larutan
lisozim 10 mg/ml sebanyak 500 μL ke dalam sel beku dan kemudian dicairkan
pada suhu kamar (23˚C). Larutan yang sudah mencair dipindahkan ke dalam
penangas es selama 45 menit. Suspensi sel ditambahkan larutan STEP fresh (SDS
1%, Tris Cl, EDTA pH 8, Proteinase K) sebanyak 1 ml dan dicampur dengan
baik. Campuran dipanaskan dalam waterbath 50˚C selama 1 jam sambil digoyang
perlahan. Suspensi sel kemudian ditambahkan 6 ml fenol jenuh dalam buffer tris
kemudian campur perlahan selama 5 menit hingga terbentuk emulsi. Campuran
25
disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit. Fasa paling atas dipindahkan pada
tabung eppendorf baru yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan Natrium
Asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari volume total, lalu dicampur perlahan.
Kemudian ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan
kemudian tabung dibolak-balik agar tercampur dengan baik. Setelah itu, campuran
diinkubasi pada suhu -20oC semalam. Campuran disentifugasi pada 12000 rpm
selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 0,6 ml
etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali pada 12000 rpm selama 10 menit.
Pelet diambil kemudian dilarutkan ke dalam ddH2O. Kadar larutan DNA dapat
diukur dengan Spektrofotometer nano-drop pada panjang gelombang A260/A280
nm.
3.3.4 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,4 gr agarosa dalam 40 ml buffer
TAE, kemudian dididihkan. Setelah larut sempurna, larutan gel dicetak pada
wadah elektroforesis yang telah diberi pencetak sumur, kemudian ditunggu
sampai mengeras. Analisis DNA menggunakan elektroforesis gel agarosa
dilakukan dengan mengambil buffer loading sebanyak 3 µL, lalu
menghomogenkannya dengan 4 µL DNA yang akan dielektroforesis. Sebelumnya
telah dilakukan persiapan pada perangkat elektroforesis yaitu dengan
menambahkan buffer TAE pada wadah elektroforesis sampai gel agarosa benar-
benar tercelup. Campuran DNA dan buffer loading yang telah homogen
kemudian dimasukkan dalam sumur pada gel agarosa. Gel agarosa yang sudah
26
dielektroforesis dicelupkan dalam larutan EtBr untuk pewarnaan. Pita DNA dapat
dilihat di atas UV transluminator.
3.3.5 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode PCR
Untuk melakukan PCR dibutuhkan sepasang oligonukleotida primer.
Primer didesain dengan menggunakan program computer yang bernama clone
manager. Untuk mendesain primer dibutuhkan urutan basa nukleotida penyandi
gen endo-1,4-β-xilanase yang didapat dari Genbank, www.ncbi.nlm.nih.gov.
Setelah didapatkan urutan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase kemudian dicari
homologinya. Daerah yang konserv diambil bagian ujung depan sebagai primer
forward ujung belakang sebagai primer reverse.
Komposisi PCR terdiri DNA kromosom 10 μl, primer forward 2 μl, primer
reverse 2 μl, MgSO4 1 μl, Taq polimerase 2 μl, buffer Taq 2 μl dan dNTP 1 μl
sehingga menghasilkan komposisi campuran total sebanyak 20 μl. Proses
amplifikasi gen endo-1,4-β-xilanase dari bakteri xilanolitik sistem abdominal
rayap tanah isolat 7 dilakukan pada kondisi PCR sebagai berikut: denaturasi pada
suhu 94 oC selama1 menit, annealing pada variasi suhu 52 oC; 55 oC; 58 oC; 62 oC
dan 64 oC selama 1 menit dan elongasi pada suhu 72 oC selama 1 menit dengan
jumlah siklus 30 kali. Proses amplifikasi diawali dengan pra-denaturasi pada suhu
94 oC selama 5 menit dan diakhiri dengan pasca elongasi yang dilakukan pada
suhu 72 oC selama 10 menit. Produk PCR kemudian dianalisis menggunakan
elektroforesis gel agarosa.
27
3.3.6 Purifikasi Produk PCR
Produk PCR yang dihasilkan dielektroforesis menggunakan gel agarosa
1% (0.6 gr agarosa dalam 60 mL buffer TAE). Elektroforesis dilakukan dengan
mencampur produk PCR dengan buffer loading dan dilakukan pada 50V selama
±1 jam. Gel yang mengandung pita DNA kemudian dipotong dengan cutter steril
dan dimasukkan ke dalam tabung eppendrof untuk dilakukan purifikasi dengan
menggunakan QI Aquick Gel Extraction KIT 50. Gel yang berada dalam tabung
eppendorf ditambahkan dengan larutan capture buffer (asam asetat dan chaotropic
agent) dengan perbandingan berat gel : buffer adalah 0.3 gram : 0,9 ml. campuran
diinkubasi pada 50˚C selama 10 menit. Tiap 5 menit dikocok agar gel tercampur
rata dengan buffer. Setelah itu larutan dimasukkan ke dalam tabung KIT dengan
menggunakan mikro pipet. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12.000
rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang dan residu yang tertinggal dalam kolom
ditambahkan dengan buffer washing (buffer Tris HCl pH 8, EDTA 1 mM dan
etanol absolut). Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit.
Campuran disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit.
Residu yang tertinggal dalam kolom dielusi menggunakan 25 μl ddH2O steril dan
ditampung dalam tabung eppendorf steril. Larutan diinkubasi pada suhu kamar
selama 1-5 menit dan disentrifugasi kembali 12.000 rpm selama 2 menit. Produk
purfikasi yang dihasilkan disimpan dalam -20˚C.
3.3.7 Sekuensing Amplikon dengan Metode Sanger
Sekuensing dilakukan dengan alat Applied Biosystem 3730XL di
Laboratorium Macrogen Singapore.
28
3.4 Skema Kerja
Isolasi DNA kromosom dari

bakteri xilanolitik sistem
abdominal rayap tanah
isolat 7
Desain Primer PCR

(sepasang primer endoF dan
endoR)
Amplifikasi gen penyandi

endo-1,4-β-xylanase dengan
teknologi PCR
Purifikasi produk PCR
Sekuensing produk PCR
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi DNA Kromosom Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap

Tanah Isolat 7
Isolasi DNA kromosom dilakukan menggunakan metode Sambrook et
al(1989). Koloni isolat 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah
ditumbuhkan dalam media LB cair selama semalam. Suspensi sel yang dihasilkan
disentrifugasi dan diambil pelet selnya untuk diresuspensi dengan buffer TE dan
kemudian ditambahkan dengan lisozim untuk merusak dinding sel bakteri.
Larutan STEP yang terdiri dari SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8 dan proteinase K
ditambahkan ke dalam suspensi sel untuk menyempurnakan kerusakan dinding
dan membran sel bakteri. EDTA mampu menghambat kerja-kerja enzim yang
merusak DNA serta membentuk ion kompleks dengan magnesium sehingga ion
magnesium yang penting untuk mempertahankan struktur dinding sel
hilang.Proteinase K mampu memecah polipeptida menjadi unit yang lebih kecil
dan lebih mudah didenaturasi oleh fenol (Brown, 2001). Untuk itu, fenol
ditambahkan guna mempresipitasi protein, larutan DNA akanterlarut pada fasa
cair. Sebagian RNA akan tetap bersama DNA dalam fasa cair. Fasa cair yang ada
pada bagian atas ini diambil dengan menggunakan mikropipet secara hati-hati dan
ditambahkan dengan Natrium Asetat dan etanol absolut. Kedua larutan ini
berfungsi untuk mempresipitasi DNA. Dengan adanya garam (kation monovalen
Na+) pada temperatur -20ᵒC etanol absolut akan mempresipitasiasam nukleat
29
30
polimerik. Larutan DNA kemudian diambil pelet selnya untuk dilarutkan ke
dalam ddH2O. Absorbansi ultraviolet dapat digunakan untuk mengetahui
kemurnianDNAdengan menggunakan Spektrofotometri nanodrop yang langsung
bisa mengukur absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.Panjang
gelombang maksimum yang diserap oleh DNA dan RNA adalah 260 nm.
Sedangkan protein menyerap panjang gelombang maksimum 280 nm (Tearae et
al, 1997). Pengukuran absorbansi pada panjnag gelombang A260/A280 nmini
berfungsi untuk mengetahui rasio kemurnian DNAterhadap protein. Pada isolasi
DNA ini didapatkan rasio absorbansilarutan DNA isolat 7 pada adalah sebesar
1,89. Larutan DNA ini bisa dikatakan murni karena rasio absorbasi DNA lebih
besar dari 1,8 (Brown, 2001).
Gambar 4.1 Hasil elektroforesis DNA kromosom
31
4.2 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode PCR
Amplifikasi gen dengan teknik PCR membutuhkan sepasang primer yang
sesuai. Pada penelitian ini didesain sepasang primer forward(endo F) dan primer
reverse (endoR) dengan menggunakan software clone manager.Primer didesain
berdasarkan pada urutan basa nukleotidagen penyandi endo-1,4-β-xilanase yang
diambil dari Genbank.Urutan basa nukleotida gen penyandiendo-1,4-β-xilanase
yang diambil berasal dari kelompok hidrolase famili 11 Bacillus subtillis
disebabkan karena bakteri xilanolitik dari sistem abdominal rayap isolat 7 telah
diidentifikasi secara mikrobiologis memiliki homologi dengan Bacillus subtilis.
Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal
isoalt 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah didesain berdasarkan gen
penyandi endo-1,4-β-xilanase dari beberapa GH famili 11 yaituBacillus
subtilisgalur BD403 endo1,4beta-xyl (DQ100306.1), Bacillus subtilisgalur G1
xylanase gene (EU848308.1), Bacillus subtilisgalur MW10 endo-1,4-beta-xyl
(DQ100307.1), dan Bacillus subtilisgalur R5 xyl (AB457186.1). Keempat jenis
bakteri tersebut mengandung gen penyandi enzim endo-xilanase dengan ukuran
rata-rata ± 600 bp dilakukan aligmentsehingga dihasilkan suatu daerah lestari
seperti yang dapat dilihat pada Gambar 4.2
32
Gambar 4.2 Hasil aligmentBacillus subtilisgalur BD403 endo1,4beta-xyl

(DQ100306.1), Bacillus subtilisgalur G1 xylanase gene
(EU848308.1), Bacillus subtilisgalur MW10 endo-1,4-beta-xyl
(DQ100307.1), dan Bacillus subtilisgalur R5 xyl (AB457186.1)
33
Sambrook and Russel(2001), menyebutkan beberapa hal yang perlu
diperhatikan untuk mendesain primer yaitu panjang nukleotida antara 18-25,
memiliki 40-60% basa GC, tidak terjadi hairpin maupun dimer serta pada ujung
3’ tidak boleh lebih dari 3 nukleotida dari primer forward komplemen dengan
primer reverse ataupun sebaliknya. Pada penelitian ini diambil basa nukleotida
dengan urutan tertentudan ditambah urutan sisi pengenal enzim restriksi yang
terdapat pada multiple cloning side(MCS) pada vektor plasmid pYES2 sehingga
dapat diinsersikan pada plasmid pYES2.Dari hasil analisis, urutan sisi pengenal
enzim restriksi yang sesuai pada MCS pYES2dan tidak terdapat padahasil
aligmentdi atas adalah SacI dan XhoI. Maka selanjutnya primer forward didesain
dengan penambahan sisi restriksi SacI (GAGCTC)dengan kodon start ATG pada
ujung 5’ dan primer reverse dengan penambahan sisi restriksi XhoI
(CTCGAG)pada ujung 3’ dengan stop kodon TAA.Untuk melengkapi %GC
primer ditambahkan basa GC sebagai pijakan. Primer forward endoF didesain
dengan panjang basa nukleotida sebesar 39bp dengan urutan basa 5’
GGGGAGCTCTCCATGTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT 3’. Primer
forward endoF memiliki Tm sebesar 67°C, 30% GC, tidak terjadi dimers dan
harpains serta serta pada ujung 3’ tidak lebih dari 3 nukleotida dari primer
forward komplemen dengan primer reverse ataupun sebaliknya. Sedangkan
primer reverse endoR memiliki 23 panjang basa nukleotida dengan urutan basa 5’
GCCTCGAGTTACCACACTGTTAC 3’. Primer reverse endoR memiliki Tm
sebesar 64°C, 52% GC, tidak terjadi dimers dan harpains serta serta pada ujung 3’
tidak lebih dari 3 nukleotida dari primer forward komplemen dengan primer
34
reverse ataupun sebaliknya. Gambar 4.3 dan 4.4 menunujukkan hasil analisis
desain primer forward endoF dan reverseendoR.
Gambar 4.3 Analisis Primer Forward (endoF)
35
Gambar 4.4 Analisis Primer Reverse (endoR)
Analisis primer oleh program Clone manager pada Gambar 4.3 dan 4.5
menunjukkan primer reverse memenuhi kriteria primer PCR yang disarankan oleh
program Clone manager. Sedangkan primer forwardmemiliki beberapa kriteria
yang disarankan oleh program Clone manageryang tidak terpenuhi. Primer
forward memiliki panjang primer sepanjang 39 dan 30% GC. Dalam teorinya,
jika suatu primer terlalu panjang maka dapat menyebabkan kegagalan replikasi
(Irawan, 2008 ; Yuwono, 2006). Namun, dalam penelitian(Paice, et al., 1986) dan
(Huang et al., 2005) pernah melakukan amplifikasi gen penyandi xilanase dengan
panjang basa 39 basa nukleotida. Urutan primer forward yang digunakan yaitu
5’CGAATTCCATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT 3’. Primer
tersebut sama seperti primer forwardendoF yang digunakan pada penelitian ini
dengan penambahan GC dan penambahan sisi restriksi yang berbeda. Primer
36
forward Primer forward endoF dan primer reverse endoR kemudian di-alignment
dengan gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus subtillis(Gambar 4.5).
Gambar 4.5 Hasil alignment gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus

subtillis dengan primer forward endoF (F3 ENDO ORI) dan
primer reverse endoR (R ENDO INVERS)
37
Reaksi PCR dilakukan dengan mencampurkan primer, DNA cetakan,
MgSO4,enzim Taq DNA polimerase, dNTP serta larutan buffer. Enzim Taq DNA
polimerase memiliki aktivitas untuk memperpanjang rantai DNA yang mampu
mempertahankan aktivitasnya pada suhu tinggi (sampai 95°C) walaupun
dilakukan pemanasan beberapa kali (Bintang, 2010). Ion Mg2+ dari MgSO4
berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim Taq polimerase. PCR kemudian dijalankan
dengan kondisi sebagai berikut : denaturasi awal 94ᵒC 1menit; annealing 58ᵒC
selama 1menit; dan elongasi 72ᵒC selama 1 menit. Pada suhu 94ᵒC yaitu pada
proses denaturasi, DNA untai ganda akan terbelah menjadi untai tunggal akibat
pemanasan yang merusak ikatan hidrogen yang menghubungkan untai DNA.
Suhu kemudian diturunkan pada proses annealing. Pada suhu ini primer akan
melekat pada segmen yang komplemen pada DNA untai tunggal. Pada awal
penelitian ini annealing dilakukan pada variasi suhu55˚C, 58˚C, 60˚C, 62˚C.
Variasi suhu dilakukan adalah untuk mencari suhu optimum yang bisa
mengamplifikasi DNA target dengan baik. Dari hasil variasi suhu tersebut, DNA
penyandi endoxilanase dari sistem abdominal rayap tanah dapat diamplifikasi
pada suhu annealing 58ᵒC. Amplikon PCR kemudian dianalisis menggunakan
elektroforesis gel agarosa. Agarosa biasa digunakan untuk memisahkan fragmen
DNA dengan rentang ukuran beberapa ratus hingga sekitar 20.000 kb. DNA yang
bermuatan negatif akan menuju ke kutub positif dengan adanya arus listrik yang
diberikan. DNA dengan ukuran molekul lebih kecil akan lebih cepat bermigrasi
melewati gel dibandingkan dengan DNA yang ukuran molekulnya lebih besar.
Visualisasi pita DNA dalam gel agarosa ini dapat dilihat melalui UV
38
transluminator dimana sebelumnya dilakukan pewarnaan dengan Etidium
Bromide (EtBr). Amplikon PCR yang berhasil diamplifikasi pada penelitian ini
yaitu sebesar ±500 bp (Gambar 4.4)

A B
3000bp
p
1500bp
p
1000bp
p
500bp ± 0,5bp
250bp
Gambar 4.6. Hasil elektroforesis PCR menggunakan primer endoF dan endoR
A. GeneRulerTM 1 kb DNA ladder
B. Amplikon gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri
xilanolitik sistem abdominal rayap tanah hasil PCR
Primer forward endoF dan reverse endoR didesain dengan primer forward
menempel dari sisi ujung dengan start kodon ATG dan primer reverse endoR
menempel dari sisi ujung dengan stop kodon TAA. Kedua primer bergerak dari
ujung ke ujung pada urutan template sepanjang ±600bp sehingga pada amplifikasi
dengan primer endoF dan endoR ini dapat diperoleh PCR sebanyak sekitar 0,5bp.
Sebelumnya telah didesain pula primer forward dan reversedengan urutan primer
forward 5’- GCGAGCTCATGGCAATGGATA -3’ dan primer reverse 5’-
GCCTCGAGTTACCACACTGTTAC -3’ kedua primer ini memenuhi kriteria
39
analisis primer dari software Clone Manager (Gambar 4.6). Jika dilakukan
homologi, primer forwardbergerak dari posisi tengah sedamgkan primer reverse
di sisi ujung (Gambar 4.7). Kedua primer ini berhasil mengamplifikasi fragmen
DNA pada ±200bp (Gambar 4.8). Bila dibandinngkan desain primer 2
mengamplifikasi DNA dengan ukuran yang lebih sedikit dan fragmen yang
dihasilkan lebih tipis. Oleh karena itu data yang digunakan adalah data hasil
amplifikasi dari primer endoF dan endoR dengan ukuran ±0,5bp.
Gambar 4.7 Analisis primer forward dan primer reverse desain 2
40
Gambar 4.7 Hasil aligment desain primer 2
Gambar 4.8 Desain Primer 2
41
A B
3000bp
p
1500bp
p
1000bp
p
500bp
250bp ± 200bp
Gambar 4.9 Hasil elektroforesis PCR menggunakan desain primer 2

xilanolitik sistem abdominal rayap tanah hasil PCR
4.3 Purifikasi atau pemurnian DNA Produk PCR
Purifikasi produk PCR dilakukan melalui purifikasi gel menggunakan
reagen KIT (QI Aquick Gel Extraction KIT 50). Tahap awal yang dilakukan
dalam proses purifikasi ini yaitu memasukkan produk PCR ke dalam gel agarosa
1% (0,6 gram dalam 60 ml TAE). Produk PCR dielektroforesis kemudian gel
yang mengandung pita DNA dipotong menggunakan cutter steril. Gel yang
mengandung pita DNA kemudian ditambahkan dengan buffer QC (mengandung
asam asetat dan caorotropic agent) dengan pemanasan 50ᵒC selama 10menit
untuk mendenaturasi protein yang tersisa selama proses PCR. Sampel kemudian
dipindahkan ke dalam kolom KIT sehingga DNA akan terperangkap ke dalam
matrix kolom. Setelah itu dilakukan penambahan buffer PE yang mengandung
42
etanol untuk menghilangkan garam dan kontaminan. DNA produk PCR dalam
matrix kolom kemudian dielusikan dengan ddH2O steril. Hasil purifikasi dapat
dilihat pada Gambar 4.8
A B
3000bp
p
1500bp
p
1000bp
p
500bp ± 0,5bp
250bp
Gambar 4.10 Hasil elektroforesis amplikon PCR yang telah dimurnikan dengan
reagen KIT (QI Aquick Gel Extraction KIT 50
xilanolitik sistem abdominal rayap tanah
4.4 Analisis Urutan Basa Nukleotida Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal

Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah
Urutan basa nukleotida gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7
bakteri xilanolitik sitem abdominal rayap tanah dibaca dengan teknik
sequencing menggunakan primer forward endoF dan primer reverse endoR.
Sekuensing dilakukan dengan alat Applied Biosystems 3730XL squenser.
Data hasil sekuensing adalah sebagai berikut :
43
a) Sekuensing dengan primer forward endoF dengan Applied Biosystems
3730XL squenser:
TCTCCCTGTACTAGGAGATCGTCAGCTTCCCACCTCTCAACTAG
ATGT
b) Sekuensing dengan primer reverse endoR dengan Applied Biosystems
3730XL squenser:
TACATCAGCCTACGTCTGTATCTTTCCGGGGCCCCACAACCAGA
GA
Kedua hasil sekuensing tidak berhasil membaca urutan basa nukleotida
gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sitem abdominal
rayap tanah secara keseluruhan. Hal ini diindikasikan karena faktor kemurnian
DNA produk PCR yang dihasilkan kurang baik.
47
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa gen penyandi endo-1,4-β-
xilanase dengan ukuran 0,5 bp asal isolat 7 bakteri xilanolitik sistem
abdonminal rayap tanah dapat diamplifikasi dengan metode PCR
menggunakan desain primer endoFdanendoR.
5.2 Saran
Berdasarkan penelitian yang dilakukan dapat disarankan :
1. Dilakukan pemurnian dan sekuensing ulang terhadap DNA gen
penyandi endo-1,4-β-xilanaseasalisolat7 bakteri xilanolitik sistem
abdonminal rayap tanah
2. Dilakukan amplifikasi ulang dengan primer yang berbeda atau
melakukan desain primer baru untuk urutangen penyandi endo-1,4-β-
xilanase.
44
45
45
DAFTAR PUSTAKA
Bainbridge B. W., Berna P., 1987, Genetics of Microbes, 2nd edition, Chapman &
Hall, New York.
Beg Q. K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G. S., 2001, Microbial Xylanases
and their Industrial Applications : a Review, Applied
Microbiology and Biotechnology, Vol. 56, p. 326-338.
Bock Ralph, 1997, Biolistic Transformation of Plants with anion-exchange-

purified Plasmid DNA, Qiagen News, Issue No. 5.
Borror, Triplehorn, Johnson, 1992, Pengenalan Pelajaran Serangga, Edisi

Keenam, Alih Bahasa : Soetiyono P., Gadjah Mada University
press, Yogyakarta.
Brown T.A., 2010, Gene Cloning an Introduction, 3rd edition, Chapman & Hall,
United Kingdoom.
Cheng H. L., Whang P. M., Chen Y. C., Yang S., Chen Y. C., 2008, Cloning,
Characterization and Phylogenetic Relationships of stxI, a
endoxylanase-encoding Gene from Streptomyces
thermonitriWcans NTU-88, Bioresource Technology, Vol. 99, p.
227-231.
Corral, O.L., Ortega, F.V., 2006, Xylanases, Advances in Agricultural and Food
Biotechnology 305-322
Coughlan, M.P. and Hazlewood, G.P., 1992, Hemicellulose and Hemicellulase,

Portland Press, London and Chapel Hill.
Debeche, T., Bliard, C., Debire, P., and O’Donohue, M.J., 2002, Probing The
Catalytically Essential Residues of the α-L-arabinofuranosidase
from Thermobacilus xylanilyticus, Protein Enginering 15: 21-28.
Erlich H. A., 1992, PCR Technology : Principles and Application for DNA
Amplification, W. H. Freeman and company, USA.
Faulet B. M., Niamke S., Gonnety J. T., Kouame, L. P., 2006. Purification and
Biochemical Properties of a New Thermostable Xylanase from
Symbiotic Fungus, Termitomyces sp., African Journal of
Biotechnology, Vol. 5, p. 273-282.
Freifelder David, 1987, Molecular Biology, Jones and Barltlett Publisher Inc,
USA.
46
Girio F. M., Fonseca C., Carvalheiro F., Duarte L.C., Marques S., Lukasik L. B.,
2010, Hemicelluloses for fuel ethanol: A review, Bioresource
Technology, Vol. 101, p. 4775–4800.
Goodenough, U., 1984, Genetika, Edisi Ketiga, Alih Bahasa : Adisoemarto S.,
Erlangga, Jakarta.
Henrissat B., Coutinho P., Deleury E., http://www.CAZy-GH_tables.htm, 8 April

2005
Huang J., Whang G., Xiao L., 2006, Cloning, sequencing and expression of the
xylanase gene from a Bacillus subtilis strain B10 in Escherichia
coli, Bioresource Technology, Vol. 97, p. 802-808.
Innis M. A., Gelfan D. H., John S., PCR Protocols : A Guide to Methode
Application, 1990, Academic Press, New York.
Irawan B., 2008, Genetika Molekuler, Airlangga University Press, Surabaya.
Mishra M., Thakur I. S., 2011, Purification, Characterization and Mass

Spectroscopic Analysis of Thermo-alkalotolerant β-1,4-
endoxylanase from Bacillus sp. and Its Potential for Dye
Decolorization, International Biodeterioration & Biodegradation,
Vol. 65, p. 301-308.
Old R.W., Primrose S.B., Prinsip-prinsip Manipulasi Gen,Edisi ke-4 Alih bahasa
:1995,
Poorna C. Asha., Prema P., 2006, Production and partial characterization of

endoxylanase by Bacillus pumilus using agro industrial
residues, Biochemical Engineering, Vol. 36, p. 106-112.
Purwadaria T., Ardiningsih P., Ketaren P. P., dan Sinurat A. P., 2004. Isolasi dan
Penapisan Bakteri Xilanolitik Mesofil dari Rayap. Jurnal
Mikrobiologi Indonesia 9.
Puspaningsih N. N. T., 2004, Pencirian Enzim Xilanolitik dan Kloning Gen

Penyandi Xilosidase dari Bacillus thermoleovorans IT-08,
Disertasi Program Studi Biologi Sekolah Pascasarjana Institut
Pertanian Bogor, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Radek R., 1999, Flagellates, Bacteria, and Fungi Associated with Termites :
Diversity and Function in Nutrition-A Review, Ecotropica, Vol.
5 (2), p. 183-196.
47
Ratnadewi A. A. I., Handayani W., Hadi A. F., Sa’diyah H., Budi L., 2007,
Isolasi,Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Xilanolitik Asal
Mikrob Dalam Sistem Intestin Rayap Untuk Memproduksi
Xilooligosakarida Sebagai Pereduksi Resiko Kanker,
Uneversitas Jember, Jember.
Ratnadewi A. A. I., Puspaningsih N. N. T., Handayani W., 2011, Kloning dan

Overekspresi Gen Beta-endoxylanase Asal Bakteri Xilanolitik
Sistem Abdominal Rayap Tanah dan Produksi
Xilooligosakarida Sebagai Produsen Probiotik, Universitas
Jember, Jember.
Russel J. Petter., 1999, Fundamentals Of Genetics, 2nd edition, Addison Wesley
Longman, San Francisco.
Richana, N., 2002, Produksi dan Prospek Enzim Xilanase dalam Pengembangan
Bioindustri di Indonesia, Buletin AgroBio 5 (1) : 29-36.
Saha, B. C., 2003, Hemicellulose Bioconversion. Review Paper, Journal of

Industrial Microbiology and Biotechnology 30 (5, May) : 279 -
291.
Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., 1989, Molecular Cloning, 2nd Edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Shallom, D., Belakhov, V., Solomon, G., Bassov, T., Shoham, Y., 2002, Detailed
Kinetic Analysis and Identification of The Nukleophile in α-L-
Arabinofuranosidase From Geobacillus stearothermophillus T6,
a Family 51 Glycoside Hydrolase, J Biol Chem, 227: 436667-
43673.
Smith C. A., Wood E. J., 1991, Molecular and Cell Biochemistry : Molecular
Biology and Biotechnology, Chapman and Hall, USA
Spangler B. D., 2002, Methods in Molecular Biology and Protein Chemistry :

Cloning and Characterization of an Enteroxin Subunit, John
Wiley & Sons, Ltd., United Kingdoom.
Sriyapai T., Somyoonsap P., Matsui K., Kawai F., ChansiriK., 2011, Cloning of
thermostable xylanase from Actinomadura sp. S14 and its
expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, Journal of
Bioscience and Bioengineering, Vol. 111 No. 5, 528–536.
48
Subramaniyan S., Prema P., 2002, Biotecnology of Microbial Xylanases :

Enzymology, Molecular Biology, and Application, Critical Rev
Biotechnol, Vol. 22, p. 33-64.
Tarumingkeng R. C., 1971, Biologi dan Pengenalan Rayap Perusak Kayu di

Indonesia. Laporan L. P. H. No. 138, Departemen Pertanian
Direktorat Jenderal Kehutanan Lembaga Penelitian Hasil Hutan,
Bogor.
Tarumingkeng R. C., 2001, Biologi dan Perilaku Rayap, Program Studi Ilmu
Hayati Institut Pertanian Bogor, Bogor (diakses online dari
www.rudyct.com/biologi_perilaku_rayap.htm).
Teare JM et al. 1997. Measurement of nucleic acid concentrations using the DNA
quant and the genequant. Bio Techniques 22:1170-1174
Walker J. M., Rapley R., 2009, Molecular Biology and Biotechnology, 5th
edition, Royal Society of Chemistry United Kingdoom.
Wirajana I. N., 2010, Ekspressi dan Sekresi α-L-arabinofuranosidase dari

E.coli DH5α/pTP510 di Saccharomyces cerevisiae, Disertasi
Program Pascasarjana Universitas Airlangga Surabaya, Universitas
Airlangga, Surabaya.
White B. A., 1997, PCR Cloning Protocols, Humana Press, New Jersey.
Yuwono T., 2006, Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction : Panduan
Eksperimen PCR untuk memecahkan masalah Biologi
Terkini, Penerbit Adi, Yogyakarta.
Zhang Min., Jiang Z., Yang S., Hua C., Li L., 2010, Cloning and expression of a
Paecilomyces thermophila xylanase gene in E. coli and
characterization of the recombinant xylanase, Bioresource
Technology, Vol. 101, p. 688–695.
Zhou C., Bai J., Deng S., Whang J., Zhu J., Wu M., Wang W., 2008, Cloning of a
xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in
Escherichia coli, Bioresource Technology, Vol. 99, p. 831-838.
Sciencebiotech.net, tanggal akses 23 November 2011
www.wikipedia.com, tanggal akses 23 November 2011.
Lampiran 1. Pembuatan Larutan TE
Untuk membuat 50 mL larutan TE (50 mM Tris Cl dan 50 mM EDTA)
Pembuatan stok 500 mM Tris Cl 50 mL

0,5 M = gr Tris Clx 1000
121,14 50 mL
Tris Cl = 3,0285 gram dilarutkan dalam aquades hingga 50 mL
Pembuatan stok 500 mM EDTA 25 mL
0,5 M = gr EDTA x 1000
372,24 25 mL
EDTA = 4,653 gram dilarutkan dalam aquades hingga 25 mL
Pembuatan Larutan TE 50 mL =
50 mM Tris Cl dari stok 500 mM
V x 500 = 50 x 50
V = 5 mL
50 mM EDTA dari stok 500 mM
V x 500 = 50 x 50
V = 5 mL
50 TE = 5 mL Tris Cl 50 mM ditambah 5 mL EDTA 50 mM

dilarutkan dalam aquades hingga volume 50 mL
Lampiran 2. Pembuatan Larutan Lisosim
Stok Lisosim 10 mg/ mL

Pembuatan 1 mL lisosim = 10 mg/mL x 1 mL = 0,01 gram dilarutkan
dalam aquades hingga 1 mL
Lampiran 3. Pembuatan Larutan STEP
Untuk mebuat Larutan STEP 500 μLterdiri dari SDS 0,5%; Tris Cl 50 mM pH
7,5; EDTA 0,4 M; Proteinase K
SDS 0,5% dari stok 25% = 500 μLx 0,5 = 0,0025 gram
100. 1000 μL
Tris Cl 50 mM dari stok 500 mM
V x 500 = 500 x 50
V = 50μL
EDTA 0,4 M dari stok 500 mM
V x 0,5 = 500 x 0,4
V = 400μL
Protinase K 1 mg/mL dari stok 20 mg/mL
500 μL x 1 mg/mL = V x 20 mg/mL
V = 25 μL
Lampiran 4. Pembuatan Na-Asetat 3 M
3 M = gr Na-Asetatx 1000
82,03 10 mL
= 2,4609 gram Na-Asetat dilarutkan dalam akuades hingga 10 mL
Lampiran 5. Electropherogram hasil sekuensing
Sekuensing menggunakan primer forward endoF :
Sekuensing menggunakan primer reverse endoR :

Labiqah, A

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Labiqah, A

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT

AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

Judul : Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7

Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah

Penyusun : Amaliah Labiqah

Pembimbing I : Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si

Pembimbing II : Dr. Sri Sumarsih, M.Si

Tanggal seminar : 16 Juli 2012

Pembimbing I, Pembimbing II,

Ketua Departemen Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA

PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam

lingkungan Universitas Airlangga. Diperkenankan untuk dipakai sebagai referensi

kepustakaan, tetapi pengutipan seijin penulis dan harus menyebutkan sumbernya

sesuai kebiasaan ilmiah.

Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga

judul “Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri

Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap” dengan tepat waktu.

1. Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen pembimbing I

sabar meluangkan waktu dan pikiran untuk memberikan bimbingan

kepada penulis hingga skripsi ini dapat terselesaikan.

penguji skripsi dan Drs. Handoko Darmokoesoemo, DEA selaku dosen

pengarahan kepada penulis.

3. A. A. Istri Ratnadewi S.Si, M.Si yang telah memberikan projek penelitian.

4. Seluruh staf pengajar program studi S1 Departemen Kimia Fakultas Sains

dan Teknologi yang telah memberikan bekal ilmu yang semoga

memberikan manfaat di kemudian hari.

do’a sehingga penulis mampu sampai pada tahap ini.

6. Kelompok peneliti Laboratorium Proteomik yang telah memberikan ilmu

dan bimbingan di Laboratorium.

7. Teman-teman kelompok penelitian Biokimia dan teman-teman S1, S2 dan

S3 Kimia Universitas Airlangga yang saling memberikan semangat,

dukungan dan saran dalam proses penyusunan skripsi.

bagi penulis dan pembaca.

Surabaya, 30 Juli 2012

Amaliah Labiqah, 2012, Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal

Enzim-enzim xilanolitik berperan penting dalam mengolah limbah-limbah

Kata kunci :bakteri xilanolitik, rayap tanah,endo-1,4-β-xilanase, amplifikasi,

Amaliah Labiqah, 2012, Amplification Gene Encoding Endo-1,4-β-xylanase

Xylanolytic enzymes play an important role in the processing of agricultural

Keywords : xilanolitic bacteria, soil termite, endo-1,4-β-xilanase, amplification,

HALAMAN JUDUL ....................................................................................... i

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ 1

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 5

BAB III METODE PENELITIAN ................................................................. 22

3.3.2 Peremajaan Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 45

Nomor Judul Gambar Halaman

2.1 Rayap .......................................................................................... 6

2.2 Sistem enzimatis dan aspek metabolisme rayap ......................... 7

2.4 Siklus PCR .................................................................................. 14

2.5 Peta plasmid pYES2 .................................................................... 18

4.1 Hasil elektroforesis DNA kromosom ........................................... 30

4.2 Hasil alignment Bacillus subtilis............................................... 32

4.3 Analisis primer forward (endoF) ................................................. 34

4.4 Analisis primer reverse (endoR) .................................................. 35

4.5 Hasil alignment gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus