METODE DALAM MIKROBIOLOGI

HARY WIDJAJANTI
LAB MIKROBIOLOGI JURUSAN BIOLOGI FMIPA
UNSRI
A. Satuan Pengukuran yang digunakan
dalam Mikrobiologi :

Meter : unit standart

- Mikrometer (μm) = 10-6 m
- Nanometer (nm) = 10-9 m
- Angstrom (Å ) = 10-10 m

Perbandingan ukuran diantara spesimen

dan kemampuan mata manusia,
mikroskop dan mikroskop elektron
B. JENIS – JENIS MIKROSKOP

a. Mikroskop Cahaya (Light Microscope)

Mikroskop cahaya menggunakan dua sistem lensa untuk menggambarkan

obyek → lensa majemuk

- Lensa objektif menutup objek dan menghasilkan perbesaran gambar

- Lensa okuler dekat dengan mata dan memperbesar gambaran

MIKROSKOP CAHAYA
a.1. Mikroskop Medan Terang (Brightfield Microscope)
Digunakan :
- untuk memperbesar gambaran objek yang diuji
- untuk menentukan ukuran, susunan, karakteristik dan motilitas bakteri dan
mikroba lain di lingkungan alami

a.2. Mikroskop Medan Gelap (Darkfield Microscope)

Digunakan untuk pengamatan bakteri yang sangat kecil untuk dipisahkan
dengan menggunakan mikroskop medan terang.

Mikroskop ini sering digunakan untuk melihat Spirochaeta yang sangat tipis
seperti Treponema dan Leptospira yang tidak dapat dipisahkan secara jelas
oleh mikroskop medan terang.
a.3. Mikroskop fase kontras (Phase Contrast
Microscope)

➢ Digunakan untuk menambah kontras antara sel dengan latar belakangnya,

antara struktur dalam sel dengan sitoplasma

➢ Mikroskop fase kontras digunakan untuk melihat objek dengan indeks

refraksi sinar yang berbeda

➢ Fase perubahan bagian dalam sistem lensa objektif mengubah sinar

sehingga ada perbedaan dalam fase antara sinar yang terdefraksi dengan
sinar yang tidak mengalami defraksi
MIKROSKOP MEDAN TERANG
(BRIGHTFIELD),
MEDAN GELAP (DARKFIELD),
DAN FASE KONTRAS (PHASE-CONTRAST)
a.4. Mikroskop Differential Interference
Contrast

▪ Mikroskop ini menggunakan sinar yang

membelah menjadi dua sinar untuk mendeteksi
objek yang mempunyai indeks refraksi yang
sama

▪ Jika berkas sinar menembus materi yang

berbeda, sinar akan mengalam perubahan fase
yang berbeda, akibatnya bila berkas sinar dapat
digabungkan lagi, penyusunnya terjadi
percampuran atau mengalami pemecahan dan
perubahan intensitas sinar yang mencapai mata
yang mengamati

▪ Mikroskop ini menghasilkan gambar tiga dimensi

a.5. Mikroskop fluoresens (Fluorescens
Microscope)

Digunakan untuk mendeteksi mikroba tertentu yang

terlalu kecil dilihat dengan mikroskop biasa atau
sukar didapatkan sebab jumlahnya yang banyak atau
dalam kultur campuran

Mikroskop fluoresens menggunakan sinar ultraviolet

yang tidak terlihat. Organisme dicat dengan cat yang Treponema pallidum yang
sinarnya terlihat berfluoresen jika dikenai sinar diamati dengan mikroskop
ultraviolet fluoresens

Pengecatan dapat dibuat sangat spesifik jika cat

melekat pada antibodi yang hanya mengikat pada
satu tipe organisme
a.6. Mikroskop Konfokal (Confocal
Microscope)

Digunakan untuk mendapatkan

gambaran dua dan tiga dimensi dari sel
untuk keperluan aplikasi biomedik

Mikroskop ini menggunakan sinar laser

b. MIKROSKOP ELEKTRON (ELECTRON MICROSCOPE)

Digunakan untuk melihat secara rinci struktur mikroba

Menggunakan elektron untuk membentuk gambar

Lensa magnetic digunakan oleh elektron yang langsung berlawanan dengan

objek dan memfokuskan elektron yang dihasilkan pada layar atau papan
fotografi
Ada dua macam mikroskop elektron, yaitu :

b.1. Transmission Electron Microscope (TEM)

TEM digunakan untuk mempelajari struktur subseluler dan hubungan satu

dengan lainnya

Di dalam TEM elektron yang menembus spesimen digunakan untuk

membentuk gambar objek

Pengecatan atau pelapisan dengan logam berat menambah kontras antar

bagian-bagian objek yang berbeda oleh refleksi elektron
b.2. Scanning Electron Microscope (SEM)

SEM lebih sering digunakan untuk

menerangkan tentang permukaan struktur
mikroba yang diinginkan

Dalam SEM elektron yang mengenai spesimen

menyebabkan pembebasan elektron sekunder
dari spesimen. Elektron sekunder dan elektron
refleksi digunakan untuk membentuk gambar
objek

Mikroskop elektron digunakan untuk memberikan

gambar virus yang terlalu kecil untuk dilihat
dengan mikroskop cahaya
SCANNING ELECTRON MICROSCOPE (SEM) TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE (TEM)
TRANSMISSION SCANNING
Teknik Mikroskop electron

Spesimen untuk TEM biasanya difiksasi untuk mencegah dekomposisi, dicetak

dalam plastik untuk menjaga bentuk specimen dan diiris tipis dengan ultra
mikrotom.

Teknik metal shadowing (teknik pembayangan logam) digunakan untuk

memperlihatkan gambaran tiga dimensi.

Umumnya digunakan untuk mempelajari bentuk virus dan bakteri yang utuh.

Spesimen dilapisi dengan logam berat seperti emas atau paladium yang umumnya
mengendap di sudut specimen, sehingga menciptakan bayangan specimen.
Teknik freeze fracture ( teknik pemecahan beku) untuk menggamabarkan
permukaan organel dan membran.

Spesimen secepatnya dibekukan dalam Freon atau refrigerator sampai -100oC

kemudiaan diiris dalam vakum untuk memecah sel dan organelnya. Pecahan
specimen dilapisi dengan platinum dan karbon untuk membuat replika logam
spesimennya. Replikanya terlihat tiga dimensi.

Spesimen untuk SEM dikeringbekukan dan kemudian dilapisi dengan lapisan

logam berat seperti emas dan palladium yang melengkapi electron sekunder
untuk menghasilkan gambar.
RANGKUMAN BEBERAPA JENIS MIKROSKOP
RANGKUMAN BEBERAPA JENIS MIKROSKOP
PERSIAPAN SPESIMEN UNTUK 1
PENGAMATAN MIKROSKOP
CAHAYA :

A. Pembuatan preparat :

1. Wet Mount : setetes medium yang

berisi organisme diletakkan pada 2
gelas benda
Teknik ini dapat digunakan untuk
mengamati organisme hidup yang
diamati

2. Hanging drop : setetes diletakkan

pada gelas benda yang cekung dan
ditutup dengan gelas penutup
3. Smear (apusan) :
Digunakan untuk mengamati organisme mati

Mikroorganisme dari setetes medium diusapkan

pada permukaan gelas benda.

Preparat apusan ini → dikeringudarakan dan

kemudian difiksasi dengan panas (dilalukan pada
api)

Fiksasi dengan panas menyebabkan tiga hal :

- Mematikan organisme
- Menyebabkan organisme melekat pada gelas
benda
- Menyebabkan organisme lebih siap untuk
diberi pengecatan
Persiapan Spesimen untuk Mikroskop Cahaya
B. Pengecatan :

a. Pengecatan Sederhana (Simple Stains)

Pengecatan sederhana → pengecatan spesimen dengan cat basa yang
memberikan kontras yang baik antara specimen dengan latar belakangnya

Contoh cat sederhana : methylene blue, carbolfuchsin, crystal violet,

safranin

b. Pengecatan Diferensial (Differential Stains)

Pengecatan diferensial → pengecatan specimen dengan dua atau lebih cat
basa untuk membedakan struktur seluler
Contoh pewarnaan Prosedur Pewarnaan Gram
diferensial:
a. Pewarnaan Gram
(Gram Stains)

Bahan kimia yang

digunakan adalah :
1. Cat crystal violet
2. Iodine
3. Alkohol
4. Cat safranin

Fotomikrograf bakteri dengan pewarnaan Gram.

Staphylococcus aureus dan Bacillus (ungu) adalah
gram positif dan Escherichia coli (merah) gram
negatif
 Pengecatan Acid-Fast

• Cat acid-fast melekat kuat hanya pada bakteri

yang mempunyai material wax pada dinding
selnya

• Digunakan pada bakteri genus

Mycobacterium, misalnya Mycobacterium
tuberculosis, Mycobacterium leprae, dan
Nocardia.

• Bahan kimia yang digunakan adalah : cat

Bakteri acid-fast. Mycobacterium leprae berwarna
carbolfuchsin, acid-alcohol, cat methylene merah dengan pewarnaan acid-fast
blue
3. Pengecatan Khusus :

a. Pengecatan negatif
Pengecatan negatif adalah pengecatan latar belakang dengan cat asam sehingga
spesimen dapat dibedakan dari latar belakangnya.

Contoh : pengecatan kapsula

Bahan yang digunakan : tinta India atau nigrosin dan cat safranin

b. Pengecatan Endospora
- Metode yang umum digunakan adalah pewarnaan endospora Schaeffer-Fulton
- Bahan yang digunakan adalah cat malachite green dan cat safranin

c. Pewarnaan Flagela
Bahan yang digunakan adalah cat carbolfuchsin
Pengecatan kapsula pada Klebsiella Pengecatan endospora pada Bacillus cereus
pneumoniae

Pengecatan flagela pada

Spirillum volutans
RANGKUMAN
BEBRAPA
PEWARNAAN DAN
PENGGUNAANNYA
TEKNIK BIAKAN MURNI
- Populasi mikroba di alam sekitar kita besar lagi kompleks
- Beratus-ratus spesies berbagai mikroba menghuni bermacam-macam bagian
tubuh kita : mulut, saluran pencernaan, dan kulit
- Mereka terdapat dalam jumlah yang luar biasa banyaknya
Contoh :
- Sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme
- Satu gram feses dapat mengandung jutaan bakteri
- Alam sekitar : air, tanah, udara juga dihuni kumpulan mikroorganisme

- Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme memerlukan teknik untuk

memisahkan populasi campuran yang rumit ini atau biakan campuran menjadi spesies-
spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni

- Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk
Pembiakan dan isolasi kultur murni

Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrien yang disebut

medium.

Banyak sekali medium yang tersedia, macamnya yang dipakai tergantung kepada
banyak faktor, salah satu diantaranya ialah macam mikroorganisme yang akan
ditumbuhkan

Contoh :
Jika kita ingin mengisolasi biakan murni bakteri dari mulut kita, maka air liur
diinokulasikan sedikit saja pada medium yang cocok sedemikian rupa hingga sel-sel
mikroba tumbuh terpisah-pisah pada medium tadi.

Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum.

TEKNIK ISOLASI MIKROBA UNTUK MENDAPATKAN BIAKAN MURNI

METODE POUR PLATE (CAWAN TUANG)

METODE STREAK PLATE (CAWAN GORES)

https://www.youtube.com/watch?app=desktop&v=HaqgCtA-ioI

METODE SPREAD PLATE (CAWAN SEBAR)

MIKROMETRI
MIKROMETRI → TEKNIK YANG DIGUNAKAN UNTUK MENGUKUR UKURAN
MIKROORGANISME

MENGUKUR PANJANG/LEBAR/DIAMETER SUATU MIKROORGANISME BISA

DILAKUKAN DENGAN MENGGUNAKAN MIKROMETER OKULER DAN MIKROMETER
OBJEKTIF

MICROMETRY → It is a technique used to measure the size of microscopic objects

Principle:
Calibration of the ocular micrometer using thes ta g e micrometer
Ocular Micrometer
The ocular micrometer is a glass disc with 100 equal divisions or lines
on it but with no absolute value and it is placed in the ocular of the microscope

So we have to calibrate the ocular micrometer but how??

STAGE MICROMETER

It is used to calibrate the ocular

micrometer

Stage micrometer looks like a microscope

slide but has a standard scale etched into it

The smallest divisions are 0.01 mm in

length.

It is just like a tiny ruler!

0.01 mm= 10 micro meter

Materials:

1- Light microscope ( LM) .

2- Ocular micrometer

3- Stage micrometer
Procedure
1-We place the ocular micrometer in the right ocular lens of the LM

2-We place the stage micrometer on the stage of the LM .

3- We look into the ocular and focus on the stage micrometer at low power. We move the
stage micrometer so that both the ocular and stage micrometer parallel to each other.

.
- HIMPITKAN SKALA DARI OKULER MIKROMETER DENGAN SKALA DARI MIKROMETER OBJEKTIF
- CARI SKALA YANG BERHIMPIT YANG MEMBENTUK GARIS LURUS
- HITUNG BERAPA SKALA PADA MIKROMETER OKULER DAN BERAPA SKALA PADA MIKROMETER OBJEKTIF
BAGAIMANA MENGKALIBRASINYA ?
PADA PERBESARAN x 10 objective

MISALNYA :
Stage micrometer Division Ocular micrometer Division

20 20
40 40
60 60

120 120
120 ocular divisions = 120 stage division

(1 stage division= 10 micrometer) Therefore

120 stage divisions= 1200 µm
120 ocular divisions= 1200 µm
1 ocular division (at x 10) = 1200 I 120 =10 µm

Similar calibration can be performed with the x 40 and x 100

Result should be as follows :
1 ocular division at x 40 = 2.5 µm

1 ocular division at x 100= 1 µm

SEKARANG ANDA DAPAT GUNAKAN UNTUK MENGUKUR
MIKROORGANISME