LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

Disusun oleh:
Danita Mardwika Wulandari 202023043
Gabriela Ayu Sekar Melati 202023073
Genduk Ita Ariyani 202023046
Patricia Dya Adrika 202023058

PRODI SARJANA KEPERAWATAN

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN PANTI RAPIH
YOGYAKARTA
2021
ACARA : 1. Pengenalan Alat
TANGGAL PRAKTIKUM : 19 Mei 2021
TUJUAN PRAKTIKUM :

DASAR TEORI :

Pengenalan alat-alat laboratorium penting dilakukan untuk keselamatan kerja saat

melakukan penelitian. Alat-alat laboratorium biasanya dapat rusak atau bahkan
berbahaya jika penggunaannya tidak sesuai dengan prosedur. Pentingnya dilakukan
pengenalan alat-alat laboratorium adalah agar dapat diketahui cara penggunaan alat
tersebut dengan baik dan benar, sehingga kesalahan prosedur pemakaian alat dapat
diminimalisasi sedikit mungkin.

Alat-alat laboratorium mikrobiologi seperti lemari pengeram (inkubator), autoklav, rak

dan tabung reaksi, beker glass, pipet hisap, pipet ukur, pinset, cawan petri, lidi kapas
steril, lampu spritus, ose (Selian, dkk., 2013)

ALAT DAN BAHAN :

1. Mikroskop

CARA KERJA :

Cara menggunakan mikroskop :

1. Miroskop dibawa dengan tangan pertama menumpu bagian kaki mikroskop

sedang yang kedua memegang basgaian pegangan mikroskop
2. Dalam keadaan tersimpan posisi lensa objektif dengan pembesaran lemah dan
mikorskop berdiri tegak
3. Saat melihat objek benda pertama kali dengan pembesaran lemah
4. Jika bayangn tidak jelas jangan menggunakan pembesaran kuat, gunkan
pembesaran secara bertahap
5. Saat mengganti lensa objektif harus melihat jangan sampai terjadi benturan
antara lensa objektif dengan specimen
 6. Jangan menggunakan cermin kearah matahari secara langsung sehingga
menggangu penglihatan
7. Sebelum digunakan untuk melihat objek, sebaiknya lensa dibersihkan dengan
kertas lensa

HASIL PENGAMATAN :

a. Mikroskop

Mikroskop adalah alat yang digunakan untuk menghasilkan bayangan benda dengan
kelipatan ukuran yang sangat besar. Ukuran bayangan yang dihasilkan oleh mikroskop
dapat mencapai jutaan kali ukuran benda aslinya. Mikroskop berfungsi untukmelihat
benda-benda atau organisme yang berukuran sangat kecil.Dua jenis mikroskop yang
sering digunakan ialah mikroskop optik dan mikroskop elektron. Manfaat lain dari
penggunaan mikroskop yaitu mampu mengukur benda-benda yang tidak dapat terukur
dengan ketelitian tinggi oleh alat ukur konvensional, seperti bakteri, virus, sel darah dan
sel-sel tubuh makhluk hidup. Mikroskop memiliki skala ukur yang dapat berimpit
dengan bayangan benda sehingga ukuran benda dapat diketahui dengan pasti.
Seiring dengan kemajuan teknologi ilmu dan teknologi, jenis mikroskop dan
kemampuan memperbesar benda juga semakin maju. Ada beberapa jenis mikroskop,
yaitu : Mikroskop Monokuler, mikroskop binokuler, mikroskop sederhana dan
mikroskop elektron. Bagian mikroskop dan fungsinya :
1. Lensa okuler: Fungsi Memperbesar dan membalikkan objek. Dengan ukuran
perbesaran 5x, 10 x atau 15 x. memiliki pengatur jarak antar mata.
2. Lensa Objektif: Lensa objektif letaknya dekat dengan objek. Fungsi dari lensa
ini adalah memperbesar bayangan objek pengamatan dari 10 kali hingga 100
kali.
3. Reflektor: Reflektor adalah cermin pengatur yang berguna untuk memantulkan
cahaya ke dalam diafragma.
4. Kondensor: Kondensor berguna untuk mengumpulkan cahaya yang dipantulkan
cermin pengatur. Cahaya tersebut dipusatkan ke objek.
5. Tabung Mikroskop: Tabung mikroskop berguna untuk mengatur fokus.
Kemudian fungsi lainnya adalah penghubung antara lensa objektif dengan lensa
okuler.
6. Revolver : Fungsi mengatur pergantian lensa objektif. Biasanya memiliki 4
lubang untuk menempatkan 4 ukuran lensa objektif yang berbeda.
7. Penjepit Objek : Penjepit objek berguna untuk menahan kaca objek agar mudah
digerakkan di dalam proses pengamatan.
8. Diafragma : Diafragma adalah komponen yang berada di bagian meja preparat.
Tugasnya untuk menentukan berapa banyak jumlah cahaya masuk dan
difokuskan ke dalam objek pengamatan.
9. Meja Objek : meja objek berguna sebagai wadah untuk meletakkan objek
pengamatan. Biasanya terdapat penjepit objek juga agar dapat memegang benda
tersebut supaya tak mudah bergeser di dalam proses pengamatan.
 10. Lengan dan kaki mikroskop : Lengan mikroskop menjadi pegangan ketika mau
memindahkan mikroskop. Sebaliknya, kaki mikroskop berguna untuk
meletakkan alat laboratorium ini pada bidang yang memang tidak datar.
11. Sendi Inklinasi : Sendi inklinasi berguna untuk mengatur derajat kemiringan dari
mikroskop. Komponen ini tentunya diperlukan agar semakin memudahkan
pengamatan.
12. Sekrup Kasar : Fungsi untuk memfokuskan objek dengan perbubahan yang
kasar. Memiliki pengunci agar sekrup tidak bergeser
13. Sekrup Halus : Fungsi untuk memfokuskan objek dengan perubahan yang halus.

Cara menyimpan mikroskop :

1. Aman Alat yang mudah dibawa, harganya mahal, peka dan mudah rusak, hendaknya
disimpan  tersendiri dalam laci atau lemari yang terkunci supaya aman dari pencuri
dan kerusakan.
2. Mudah dicari Untuk memudahkan mencari letak masing–masin alat, maka alat
tersebut perlu diberi tanda yaitu denganmenggunakan label pada setiap tempat
penyimpanan  alat (lemari, rak atau laci).
3. Mudah dicapai/diambil Alat yang sering digunakan hendaknya disimpan sedemikian
sehingga mudah  diambil dan dikembalikan. Mikroskop merupakan alat yang peka
terhadap lingkungan, misalnya terhadap kelembaban harus selulu terjaga dengan baik

b. Alat-alat Sterilisasi

Berkefeld, Chamberland filter

Stolz filter dari asbes
Cellulose membrane filter
HEPA (High Efficiency Particulate Air)
Depirogenasi
Autoklav

c. Alat-alat Isolasi Bakteri

PEMBAHASAN :

KESIMPULAN :
ACARA : 2. Morfologi & Sifat-Sifat Bakteri dg Pengecatan
TANGGAL PRAKTIKUM : Rabu, 19 Mei 2021
TUJUAN PRAKTIKUM : Melengkapi tugas pratikum IDK 2

PENECATAN SEDERHANA
DASAR TEORI :
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-
sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna
dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara
untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan
metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pengecatan (Jimmo, 2008).
Salah satu cara pengecatan yang dilakukan adalah pengecatan sederhana.
Pengecatan ini dilakukan dengan memberikan satu zat warna saja dalam penelitiannya.
Zat yang digunakan dilarutkan dalam bahan pelarut Namun dalam penelitian kali ini
digunakan 2 zat warna yaitu safranin dan kristal violet untuk melakukan perbandingan
kepada keduanya. Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah bacteri
Staphyllococus Aurius dan Eschericia Colli.
Pengecatan sederhana adalah teknik pengecatan yang bertujuan untuk melihat
bentuk bakteri. Pengecatan sederhana adalah teknik yang sangat umun digunakan untuk
melihat bentuk bakteri. Bakteri mempunyai bermacam morfologi. Morfologi inilah yang
nantinya dapat dibedakan dengan pewarnaan sederhana. Zat warna yang digunakan
dalam pewarnaan bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri
secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen
(30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

ALAT DAN BAHAN :

1. Kaca Benda
2. Jarum inakulasi (ose)
3. Busen dan spirtus
4. Suspensi Bacteri Staphyllococuc aurius
5. Suspensi bacteri Eschericia Coli
6. Pewarna sufranin
7. Perwarna kristal violet

CARA KERJA :
1. Siapkan alat dan bahan
1. Panaskan osebulat sampai membara. Pastikan benar benar steril
2. Ambil object glass yang telah di viksasi dengan alkohol
3. Beri tanda kotak untuk bakteri Stabiillo cocuc aurius
4. Panaskan ose sampai membara, kemudian ambil 3-5 ose bakteri stabillo cocu aurius
dan ratakan pada object glass.
5. Panaskan ose sampai membara, ambil bakteri Esterisia Colli, 3-5 ose dan ratakan
pada kotak yang disediakan
6. Tutup biakan tabung bacteri secara aseptis dan panaskan ose sampai membara.
7. Viksasi object glass diatas nyala api yang sudah terdapat baktei diatasnya sampai
benar benar kering dan ditandai dengan adanya bercak, jangan sampai gosong
8. Siapkan jembatan pengecatan di atas wastafel.
9. Warnai bakteri dengan cat kristal violet dengan cara menggenangi preparat dengan
cat sampai penuh selama 3 menit.
10. Buang cat lalu cuci dengan air mengalir sampai bersih
11. Kering anginkan preparat pada suhu kamar.
12. Amati dibawah microskop dengan lensa objectif 1000x dan ditambah minyak
omersi
13. Lakukan hal yang sama dengan pewarna sufranin.

HASIL PENGAMATAN :

Tanggal Pengamatan :
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Keterangan Gambar : bacteri Staphylococus
POLTEKES YOGYAKARTA 1. Pengecatan : Pengecatan Sederhana
2. Warna koloni : violet

3. Keterangan gambar :
a. Bentuk bakteri : Bulat
b. Cat yang digunakan kristal violet
c. Susunan bakteri: bergerombol
d. Perbesaran 1000x

PREPARAT : 1 (Staphyllococus)
PERBESARAN : 1000x

4. Kesimpulan
Bakteri berbentuk bulat dengan susunan bergerombol. Dalam pewarnaan dengan kristal
violet terligat warna bakteri violet dan dapat dilihat dengan perbesaran microskop
1000x.

Tanggal Pengamatan : 19 Mei 2021

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Keterangan Gambar : Bacteri Staphyllococus
POLTEKES YOGYAKARTA 1. Pengecatan : sederhana dengan safranin
2. Warna koloni : merah

3. Keterangan gambar :
a. Bentuk bacteri :bulat
b. cat yang digunakan safranin
c. susunan : bergerombol
d. perbesaran: 1000x

PREPARAT : 2 (Staphyllococus)
PERBESARAN :1000x
4. Kesimpulan :
Bacteri berbentuk bulat dengan suusnan bergerombol, dengan pewarnaan
safranin berwarna merah dan dapat terlihta dengan perbesaran 1000x pada microskop.

Tanggal Pengamatan : 19 Mei 2021

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Keterangan Gambar : bacteri Eschericia Coli
POLTEKES YOGYAKARTA 1. Pengecatan : sederhana dengan Safranin
2. Warna koloni :merah

3. Keterangan gambar :
a. bacteri berbentuk batang
b. menggunakan car safranin
c. susunan menyebar atau terpisah
d. perbesaran 1000x

PREPARAT : 2 (eschericia colli)

PERBESARAN : 1000x

5. Kesimpulan :
Bacteri Eschericia Coli berbentuk batang dengan sususan terpisah, dan saat
dilakukan pegecatan dengan safranin berwarna merah dan dilihat dengan perbesaran
1000x di mikroskop.

PEMBAHASAN:
Setiap pewarnaan akan melihatkan warna yang berbeda saat dilihat melalui
mikroskop. Dalam pewarnaan sederhan ain untuk dapat melihat bentuk dari bacteri itu
sendiri, menggunakan pembesaran 1000x. jika keduanya dibandingkan dapat terlihat
jelas warna bakteri setelah dilihat melalui microskop. Dalam pewarnaan krital violet
latar dari bakteri lebih terlihat putih dibandingkan yang menggunakan peewarnaan
safranin yang latar belakangnya lebih kecoklatan terang. Seeprti pada bakteri
Staphyllococus yang mana dilakukan pengecaran dengan safranin dan kristal violet
terlihat jelasperbedaan warna namun tidak ada perbedaan pada bagaimana bentuk dan
sususan dari bakteri tersebut. Pewarnaan dengan kristal violet akan membuat bakteri
berwarna violet dan dengan safranin akan membuat bacteri berwarna merah, warna ini
terbentuk dari zat warna yang menempel pada bakteri yang transparan atau tidak
mempunyai warna.
Sedangkan dalam bakteri Eschericia Colli pada vidio penelitian yang diberikan
tidak ada hasil dari pengecatan kristal violet. Namun setelah mencari beberapa gambar
diinternet dapat ditemukan hasil pengecatan bacteri Eschericia Colli dengan krital violet
sebagai berikut.
 Untuk bentuk dan susunan dari bakteri dapat terlihat dalam pewarnaan
sederhana ini. Pewarnaan menggunakan kristal violet maupun safranin dapat membantu
melihat bentuk dan susunan dari bacteri tersebut. Seperti yang terlihat pada microskop
bacteri Staphyllococus yang diberi cat kristal violet maupun safranin menunjukkan hasil
yang sama yaitu berbentuk bulat dan secara bergerombol. Ini juga sesuai dengan
landasan teori yang ada dimana “cocus” mempunyai arti berbentuk bulat. Sedangkan
bacteri Eschericia Colli sendiri terlihat pada pengecatan safranin yang dilakukan di
pengamatan dan hasil dari pengecatan kristal violet yang ditemukan diinternet juga
mengambarkan hal yang sama dimana bacteri berbentuk batang dengan susunan
bacterinya menyebar.

KESIMPULAN:
Pengecatan sederhana yang dilakukan pada bacteri Staphylococus dan bacteri
EsChericia Colly dengan menggunakan 2 macam zat warna yaitu kristal violet dan
safranin menunjukkan hasil yang sama dari bentuk dan susunan dari bacteri tersebut.
Namun dalam pengamatan tidak terdapat hasil dari Eschericia colli yang menjadikan
harus mencari di internet untuk membandingkan hasilnya. Namun keduanaya
menghasilkan yangsama dimana menunjukkan Bacteri Staphyllococus berbentuk bulat
dan bergerombol sedangkan Eschericia Colli berbentuk batang dan menyebar.
PENGECATAN NEGATIF

DASAR TEORI :

Pengecatan Negatif
Pewarnaan negatif menggunakan zat pewarna asam yang memiliki kromogen
bermuatan negatif. Karena permukaan sel cenderung bermuatan negatif, maka zat
pewarna asam tidak melekat atau masuk ke dinding sel, melainkan membentuk
lingkungan latar belakang sel yang terwarnai. Sel-sel bakteri sendiri akan terlihat terang
pada bidang yang terwarnai. Karena pewarnaan ini tidak membutuhkan fiksasi panas,
maka bentuk dan susunan sel bakteri tidak rusak dan tampak dalam ukuran alami.
Bentuk-bentuk bakteri yang sukar teramati, misalnya bentuk spiral, dapat ditampilkan
dengan pewarnaan ini.
Tujuan : untuk mengetahui bentuk bakteri dengan cara mewarnai objek glass
Prinsip : cat (nigrosin) dan bakteri sama sama bermuatan negatif sehingga bakteri
berwarna transparan objek glass berwarna hitam.
Objek glass diwarnai dengan cat nigrosin

ALAT DAN BAHAN :

ALAT:
2 objek glass
Pipet tetes
Jarum oase
Pinset
Mikroskop
Korek api

BAHAN:
Nigrosin 10%
Strain bakteri BHIB
Oil imersi

CARA KERJA :
1. Teteskan cat nigrosin 1 tetes diujung objek glass
2. Ambil strain dengan oase yang sudah di sterilkan, ambil beberapa oase cukup.
3. Campurkan dengan cat nigrosinnya
4. Panaskan oase kembali sampai merah membara, setelah itu tutup kembali
strainnya
5. Setelah dicampurkan strain bakteri dan catnya, selanjutnya mulai membuat
apusan dengan cara ambil objek glass yang satunya. Kita tempelkan salah satu
ujung objek glass pada catnya, ditempelkan sampai merata kanan kirinya.
Setelah itu dicoba untuk ditarik samapi ujung objek glass
6. Setelah membuat apusan, ditunggu hingga kering kemudian kita amati dengan
menggunakan mikroskop dengan perbesaran kuat, diberikan imersi oil 1 tetes
sebelum diamati dengan mikroskop.
7. Setelah itu kita letakan dimeja mikroskop untuk kita amati
HASIL PENGAMATAN :

Tanggal Pengamatan :
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI KeteranganGambar:
Keterangan Gambar :
POLTEKES YOGYAKARTA 1. Pengecatan
1. Pengecatan: : negatif
2. Warna koloni
2. Warna : kuning
Koloni : kuning
3. Bentuk
3. Bentuk : coccus
: coccus
4. Keterangan gambar
4. Keterangan gambar: :
a. a. Berbentuk : coccus dan strepcoccus
b. b. Berwarna : kuning
c.
5. Kesimpulan :
5. KESIMPULAN
Pada pewarnaan negatif, tidak ditemukan
terlalu banyak bakteri, ditemukan bakteri
dengan bentuk coccus dan pewarnaan
negatif mewarnai belakangnya berwarna
biru gelap dan bakteri berwarna kuning
PREPARAT :2
PERBESARAN : 40x 400x

PERBESARAN 40X

PEMBAHASAN :
Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau
negrosin.pewarna asam memiliki muatan negatif kromogen,tidak akan menembus atau
berpenetrasi ke dalam sel karena muatan negative pada permukaan bakteri. oleh
karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.
Pada pewarnaan negative dilakukan pengolesan suspense bakteri pada ujung
kanan kaca preparat dimana teknik pengolesan sampel harus diperhatikan karena
jika olesan terlalu tebal, Maka sel-sel bakteri akan bertumpuk-tumpuk sehingga sulit
untuk menentukan bentuk sel individu dan jika. Olesan terlalu tipis dapat
menylulitkan pengamatan secara mikroskopis. Lalu dioleskan tinta cina di
samping olesan suspense bakteri sebagai pewarna, kemudian dicampurkan
dengan ujung objek glass yang lain,dan seret kearah kiri hingga kaca preparat
berwarna hitam merata, pada proses ini akan terjadi gaya tolak menolak dari
dinding sel yang bermuatan negative dengan nigrosin.
 Kemudian diteteskan dengan minyak emersi pada kaca preparat Hal ini
dikarenakan, cahaya yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda, yaitu
udara dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu membiaskan
cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati
garis normal. Bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan
medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal adalah minyak
emersi. Selain itu, minyak imersi juga mempunyai indeks bias yang mendekati
atau identik dengan kaca. berdasarkan hasil praktikum kebanyakan sampel yang
dapat terlihat
pada perbesaran 40x dan 400x, hal ini dikarenakan oleh banyak factor seperti
ketidak mampuan praktikan dalam menggunakan mikroskop,
adanya pembutan olesan sampel yang terlalu tipis sehingga bakteri
yang terkandung dalam sampel tidak dapat terlihat secara jelas dalm
perbesaran 10 x 10.

KESIMPULAN :

Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecatan. Zat warna asam yang bermuatan negatif
lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya
dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Hal ini dilakukan agar
bakteri yang terlihat kontras dapat kita lihat dengan jelas pada mikrskop, kita juga dapat
melihat bentuk dari mikroba tersebut.

Berdasarkan hasil pengamatan dengan menggunakan teknik pengecatan negatif,

kita dapat menemukan bakteri berbentuk coccus yang berjumlah banyak.

PENGECATAN GRAM

DASAR TEORI

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris

untukmembedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positifdan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.Metode tersebut
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan DenmarkHans Christian Gram (1853-
1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan
antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella Pneumonia
(Karmana,2008).
Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gramnegatif,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristalviolet. Contoh dari
bakteri gram positif ialah
Clostridium perfringens,Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negatif
misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan
gram,misalnya Mycobacterium sp, karena dinding selnya mengandung banyaklipid,
sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya.Pada
pewarnaantersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringanakan berwarna
hijau (James, 2002).Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan
asam.Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna
disebutdisebut kromofor dan memiliki muatan positif.
Sebaliknya, pada zat warnaasam bagian yang berperan memberikan zat warna
mempunyai muatannegatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan
negatif banyakditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma, sewaktu proses
pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatannegatif
dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat(Dwidjoseputro, 2005).Zat
warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakanuntuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untukmewarnai latar belakang sediaan
pewarnaan.

ALAT DAN BAHAN :

1. Kaca objek
2. Bunsen
3. Jarum ose
4. Penjepit Kayu
5. Koreek api
6. Rak warna
7. Larutan iodin/lugol
8. Larutan kristal
9. Larutan alkohol 95%
10. Safranin
11. Pipet tetes
12. Aquades

CARA KERJA:

1. Nyalakan bunsen
2. Ambil dan bersihkan kaca preparat
3. Ambil penjepit kayu dan jepitkan pada kaca objek
4. Lakukan pembersihan pada kaca objek dengan cara dilalui api
5. Ambil dan bakar jarum ose pada api bunsen hingga terlihat membara agar
siap digunakan
6. Pastikan bahwa jarum ose membara agar siap digunakan
7. Teteskan aquades pada jarum ose
8. Letakkan tetesan tersebut ditengah kaca objek
9. Panaskan kembali jarum ose hingga membara
10. Siapkan isolat pada media kultur Nutrien , sebelumnya lalui tepian cawan petri
pada api sebelum membuka cawan.
11. Bakar kembali jarum ose hingga membara.
12. Lakukan tahap fiksasi secara berhati- hati dengan cara kaca objek dilalui oleh
api.

Pewarnaan primer ( larutan Kristal violet)

 Lakukan pewarnaan primer menggunakan kristal violet,larutan diambil
menggunakan pipet tetes dan ditunggu selama 30-60 detik.
 Lalu teteskan disebaran bakteri pada kaca objek ,biarkan 60 detik.
 Bersihkan menggunakan aquades.

Pewarnaan mordant (iodin/lugol)

 Lakukan pewarnaan mordant meenggunakan larutan iodin,tunggu selama 60
detik
 Lalu teteskan di sebaran bakteri pada kaca objek
 Bersihkan menggunakan aquades

Pewarnaan Dekolurisasi (alkohol 95%)

 Lakukan pewarnaan dekolurisasi menggunakan larutan alkohol 95%
 Lalu teteskan di sebaran bakteri pada kaca objek
 Setelah 5 detik, bersihkan menggunakan aquades

Pewarnaan Tandingan (safranin)

 Lakukan pewarnaan tandingan menggunakan safranin
 Teteskan kembali pada sebaran bakteri di kaca objek
 Biarkan selama 5 menit lalu bersihkan menggunakan aquades.

HASIL PENGAMATAN:

Tabel pengamatan

Keterangan :
Basil berkoloni, terdapat warna merah yang mendominasi ( bakteri gram negatif ) dan
sedikit biru keunguan ( bakteri gram positif) , isolat tidak murni karenaterdapat bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif.

Pembahasan

Praktikum ini memiliki tujuan agar praktikan terampil dalam melakukan pewarnaan
gram untuk bakteri gram positif dan negatif, mempelajari teknik pewarnaan gram untuk
pengamatan mikroba, mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dari hasil
pengamatan dengan pewarnaan gram, serta membedakan kelompok bakteri berdasarkan
reaksinya terhadap warna dan sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.
1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama
5 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang.
Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan
pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal
violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat
asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan
warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi
dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 5 menit
bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Kesimpulan

Kesimpulan yang didapat dari praktikum kali ini adalah praktikan mampu melakukan
metode pewarnaan gram bakteri dan praktikan juga mampu membedakan bakteri gram
positif dan gram negatif. Selanjutnya praktikan juga dapat mengetahui bahwa bakteri
E.coli adalah bakteri gram negatif. Bakteri gram negatif merupakan bakteri dengan
bagian dinding selnya yang dapat menyerap zat warna merah. Bakteri ini mempunyai
lapisan peptidoglikan tipis yang terdapat pada ruang periplasmik, yaitu antara membran
luar dengan membran plasma. Adapun contoh dari bakteri ini adalah E.coli. Sebenarnya
bakteri gram negatif memiliki sifat patogen sehingga lebih berbahaya jika dibandingkan
dengan gram bakteri positif. Berdasarkan ciri – ciri bakteri gram negatif mempunyai
sistem membran plasma bakteri dilindungi membran luar dan membran dalam.
Sementara bakteri gram positif hanya memiliki membran plasma yang tunggal dengan
dikelilingi oleh dinding sel, yang tebal dari peptidoglikan. Hampir 90% dinding sel
bakteri gram positif ini tersusun dari peptidoglikan.
PENGECATAN TAHAN ASAM

DASAR TEORI :

Pewarnaan (pengecatan) Ziehl-Neelsen (ZN), disebut juga dikenali sebagai

pewarna bakteri tahan asam atau sering disebut pengecatan BTA. Dalam cat ini
mengandung zat warna karbol-fuchsin yang merupakan asam. Pengecatan ini pertama
sekali dicetuskan oleh dua orang doktor Jerman, Franz Ziehl (1859-1926), seorang
pakar bakteria dan Friedrich Neelsen (1854-1894), ahli patologi. Pengecatan ZN
merupakan pewarna bakteri khas yang digunakan untuk organisme/bakteri tahan asam,
terutamanya Mycobacteria.

Bakteri adalah mikroba dengan ukuran yang sangat kecil. Parameter yang
dipakai untuk mengukur mikroba tersebut adalah mikrometer (0.001mm). Sehingga
praktis bakteri tidak dapat dilihat dengan mata tanpa bantuan alat. Sejak ditemukannya
mikroskop, maka bakteri sudah dapat dilihat. Hanya saja oleh karena bakteri
mempunyai index bias cahaya yang relatif sama dengan kaca object,di bawah
mikroskop bayangannya tidak begitu jelas,sehingga diperlukanteknik pewarnaan
tertentu untuk memperjelas bentuk serta ukuran bakteri itu.

ALAT DAN BAHAN :

1. Spesimen dahak
2. Kaca obyek
3. Desinfektan ( lisol 5%, Alkohol 70% Hipoclorid 0,5% )
4. Lidi
5. Pensil 2B
6. Plastik berisi disinfektan
7. Bunsen dan korek
8. Cat ZN A (Carbol fuchsin 1%) , ZN B (Asam alkohol 3%), dan ZN C
(Methylen blue 0,1%)
9. Pinset
10. Rak pengecatan
11. Kertas tissue

CARA KERJA :

1. Cara pembuatan preparat dari sputum (dahak)

a) Membersihkan kaca obyek dari kotoran dan lemak
 b) Menuliskan identitas pada bagian frosted dengan menggunakan pensil
2B
c) Membuat apusan dengan cara mengambil sputum (dahak) yang purulent
d) Meratakan apusan dahak dengan menggunakan lidi kecil dengan gerakan
spiral (coil type) dan merata
e) Lidi yang telah digunakan dibuang ke dalam tempat dilapisi plastik yang
berisi disinfektan
2. Pengeringan
a) Dibiarkan di suhu ruangan
3. Fiksasi
a) Setelah dibuat apusan spesimen dan fiksasi
b) Jepit dengan menggunakan pinset
c) Lewatkan sediaan di atas api bunsen biru sebanyak 2-3 kali selama 1-2
detik. Jika dipanaskan terlalu lama dapat menyebabkan sediaan rusak.
4. Pewarnaan
a) Genangi sediaan dengan cat ZN A, panaskan di atas rak pengecatan
dengan menggunakan api bunsen. Pemanasan sampai muncul uap dan
tidak diperbolehkan sampai mendidih karena akan menimbulkan endapan
kristal
b) Dinginkan 5 menit
c) Buang sisa Carbol fuchsin,  bilas dengan air mengalir. Usahakan tidak
tepat di atas spesimen
d) Genangi dengan ZN B (asam alkohol) selama 10-20 detik sampai warna
merah hilang (pucat)
e) Bilas dengan air mengalir
f) Genangi dengan cat ZN C, biarkan selama 1 menit
g) Buang sisa cat ZN C, bilas dengan air mengalir.
h) Keringkan sediaan pada rak pengering
5. Pembacaan
a. Lihat di bawah mikroskop dari dengan menggunakan lensa obyektif
perbesaran 10x untuk menentukan fokus dan lapang pandang, kemudian
perbesaran lendsa obyektif 100x dengan menambahkan minyak imersi.
b. Pembacaan dilakukan di sepanjang garis horizontal terpanjang dari ujung
kiri ke kanan atau sebaliknya. minimal 100 lapang pandang.
 c. BTA akan tampak sebagai bakteri berbentuk batang berwarna merah
baik soliter maupun berkelompok

HASIL PENGAMATAN :

Tanggal Pengamatan : 19 Mei 2021

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Keterangan Gambar
1. Pengecatan : Tahan Asam
2. Warna koloni : Merah
3. Bentuk : Batang
4. Keterangan gambar :

a. a. Bakteri berbentuk batang

b. Berwarna merah
c. soliter/berkelompok

5. Kesimpulan :

Bakteri berbentuk batang bewarna merah baik

PREPARAT
soliter :2
maupun berkelompok.
PERBESARAN : 10X

PEMBAHASAN :

Untuk menetukan sifat bakteri yang termasuk bakteri tahan asam dan bakteri
tidak tahan asam harus diwarnai dengan pewarnaan khusus. Pada umumnya, bakteri
tahan asam merupakan bakteri yang lapisan paling luar selnya terdiri dari lapisan lilin,
sehingga menyebabkan zat warna sukar masuk ke dalam sel bakteri. Pewarnaan Ziehl
Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan
Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam
karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci
dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah,
sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam)
akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak
berwarna

Melihat ketebalan sediaan dengan cara meletakkan kertas bertulis di belakang

glass obyek dengan jarak ± 4 cm. Penilaian ketebalan sediaan dikatakan baik jika kertas
tulis masih nampak namun tidak bisa terbaca jelas.Sediaan dikatakan ketebalannya
kurang baik jika terlalu tebal atau terlalu tipis. Terlalu tebaljika kertas di belakang glass
obyek tidak dapat dibaca. Dikatakan terlalu tipis jika kertas di belakang glass obyek
masih dapat terbaca dengan jelas. Ketebalan dapat juga dinilai setelah dilakukan
pewarnaan. Baik jika leukosit tampak tidak saling tumang tindih.
 Sediaan yang baik dari hasil pengecatan ZN akan ditunjukkan dengan adanya
kontras antara BTA dengan warna latar. Jika warna latar yang mengandung Methylene
blue pemberiannya terlalu lama, maka sediaan akan tampak bewarna dominan biru.
Sediaan dikatakan bersih jika tidak emngandung cat warna siswa atau tidak
mengandung endapan kristal dari cat. Sediaan yang bersih akan memudahkan
pembacaan secara mikroskopis.

KESIMPULAN :

Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok

Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut
bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin)
sewaktu dicuci dengan larutan alkohol asam. Larutan asam terlihat berwarna merah,
sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat akan melakukan
fuksin karbol dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna.
DAFTAR PUSTAKA :

TUGAS, I., & ARRACHMAN, K. MIKROBIOLOGI PEWARNAAN.

Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi.

Jakarta: UI Press.

Ali, S., Giri, V. C., Rajenderen, S. M., & Vanaja, S. G. (2014). Module for Skin Smear
Lay, B. W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga
Grafindo Persada.

Mendri, K (2021) Macam Pengecatan Bakteri.

Fitri, L., Yekki Y., 2011, Isolasi Dan Pengamatan Morfologi Koloni BakteriKitinolitik,
Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, Vol. 3 , No. 2.

Jayanti, Mirna W., Bernadetta O., Moch Y., 2010, Karakterisasi Bakteri

ToleranSyahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi

Revisi. Jakarta: UI Press

Andriani, R. (2016). Pengenalan Alat-Alat Laboratorium Mikrobiologi Untuk

Mengatasi Keselamatan Kerja dan Keberhasilan Praktikum. Jurnal Mikrobiologi
Vol, 1(1).

Yogyakarta, ………..……………20…
Asisten Mahasiswa

(……………………) (………………..………….)