Subscribe to DeepL Pro to translate larger documents.

Visit www.DeepL.com/pro for more information.

Jurnal Toksikologi Analitik, 2017;41:431-440

doi: 10.1093/jat/bkx025
Akses Akses Lanjutan Tanggal Publikasi: 6
April 2017
Artikel

Artikel

Metode LC-MS-MS yang divalidasi untuk

Analisis Simultan 17 Barbiturat dalam Plasma
Kuda untuk Kontrol Doping
Ying Liu1,2, *, Cornelius E. Uboh3 , Xiaoqing Li1 , Fuyu Guan1 , Youwen
You1 , George A. Maylin4 , Fengchang Zhu5 , dan Lawrence R. Soma1
1Departemen Studi Klinis, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Pennsylvania, Kampus New Bolton Center, 382
West Street Road, Kennett Square, PA 19348, AS,2 Institut Nasional untuk Pengawasan Obat dan Makanan, No. 2
Tiantanxili, Beijing 100050, Cina,3 Federasi Berkuda Amerika Serikat, Pusat Pengujian & Penelitian Obat Kuda,
1509 Bull Lea Rd, Lexington, KY 45011, AS,4 Program Pengujian & Penelitian Obat New York, Universitas Negeri
New York di Morrisville, 777 Warren Rd, Ithaca, NY 14850, AS, dan5 Asosiasi Farmasi Cina, No. 9 SOHO Building,
Beijing 100022, Cina

*Penulis yang dapat dihubungi untuk korespondensi. Email: liuyingly77@hotmail.com

Abstrak
Metode yang cepat dan sensitif untuk penyaringan, kuantifikasi, dan konfirmasi 17 barbiturat
secara simultan dalam plasma kuda menggunakan spektrometri massa kromatografi cair-tandem
dijelaskan. Analit diperoleh dari plasma dengan ekstraksi cair-cair menggunakan metil tert-butil
eter, dipisahkan pada kolom C18 , dan dianalisis dalam mode ionisasi elektrospray negatif.
Pemantauan beberapa reaksi digunakan untuk penyaringan dan kuantifikasi. Konfirmasi
keberadaan analit dilakukan dengan membandingkan rasio intensitas ion. Kisaran untuk batas
deteksi, kuantifikasi, dan konfirmasi masing-masing adalah 0,003-1 ng / mL (S / N ≥ 3), 0,01-2,5 ng
/ mL dan 0,02-5 ng / mL. Rentang dinamis linier dari metode ini adalah 0,1-100 ng/mL. Presisi dan
akurasi pada 0,5, 5 dan 50 ng / mL dari semua 17 barbiturat selama pengujian intra-hari adalah
masing-masing 1,6-8,6% dan 96-106%. Untuk pengujian antar-hari, presisi dan akurasi pada tiga
konsentrasi yang sama masing-masing adalah 2,6-8,9% dan 96-106%. Analisis semua 17 analit
diselesaikan dalam waktu 7 menit. Dengan demikian, metode ini cepat, sederhana, sensitif, dan
dapat direproduksi.

pengobatan manusia (3). Namun, agen-agen ini saat ini digunakan

Pendahuluan terutama dalam praktik kedokteran hewan. Mereka adalah zat yang
Barbiturat adalah turunan asam barbiturat 5,5-disubstitusi. Struktur dilarang (Kelas 2) pada kuda pacu oleh Asosiasi
kimia inti barbiturat (asam barbiturat) sendiri tidak memiliki aktivitas
sistem saraf pusat (SSP), tetapi pengenalan gugus alkil, alkil dan /
atau aril, turunan 5,5-disubstitusi menghasilkan senyawa yang
menunjukkan aktivitas SSP (1). Mereka sebagian besar digunakan
sebagai obat penenang dan hipnotik, dan sebagai agen anestesi
(thiopental) dan obat antiepilepsi (2) (misalnya, fenobarbital dan
mephobarbital). Sebagai hasil dari rentang terapi yang sempit yang
terkait dengan agen-agen ini, benzodiazepin dan produk serupa
lainnya terutama digunakan sebagai pengganti barbiturat dalam

Racing Commissioners International (ARCI) karena tidak ada nilai
terapeutik yang diketahui untuk obat-obatan ini pada kuda pacu
tetapi mereka dapat mempengaruhi kinerja kuda selama kompetisi.
Karena alasan ini, barbiturat dilarang pada kuda pacu selama
kompetisi di Negara Bagian Pennsylvania (PA).
Prosedur pengujian yang berbeda telah dikembangkan untuk
mendeteksi barbiturat dalam darah manusia, urin, dan sampel
© Penulis 2017. Diterbitkan oleh Oxford University Press. Semua hak cipta dilindungi undang-undang. Untuk mendapatkan izin, silakan kirim email ke:
journals.permissions@oup.com
biologis lainnya menggunakan HPLC-UV (4-7), kromatografi gas-
spektrometri massa (GC-MS) (8-12), immunoassay (13),
elektroforesis kapiler (14-16), dan kromatografi cair misel (17, 18),
atau spektrometri massa kromatografi cair tandem (LC-MS-MS) (19-
22). GC-MS secara rutin digunakan untuk analisis barbiturat karena
dapat mencapai batas deteksi yang lebih rendah untuk beberapa obat
jika dibandingkan
431
November 2023
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/41/5/431/3106127 oleh tamu pada tanggal 22
432 Liu et al.

Larutan stok buffer amonium asetat (2 M, pH 6,0) dibuat dengan

dengan LC-MS-MS. Ada beberapa publikasi ilmiah tentang
penambahan 15,4 g amonium asetat ke dalam 100 mL
barbiturat dalam darah dan urin yang dikumpulkan dari sukarelawan
atau pasien manusia (15-22). Metode-metode ini terbatas pada
analisis kadar barbituat dalam sampel klinis dan, dengan demikian,
hasilnya tidak dapat diekstrapolasikan ke sampel kuda pacu dengan
implikasi forensik. Semua temuan positif memiliki kepentingan
forensik yang alasannya mereka memerlukan konfirmasi keberadaan
tersangka narkoba dalam sampel uji agar hasilnya dapat dianggap
dapat diterima dan dilaporkan hanya j i k a dapat bertahan dari
tantangan hukum.
Fakta bahwa barbiturat saat ini tidak tersedia dengan mudah
seharusnya tidak memberikan harapan palsu kepada para analis
pacuan kuda bahwa obat-obatan ini tidak digunakan dalam industri
pacuan kuda saat ini. Penggunaan agen-agen ini pada kuda pacuan

November 2023
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/41/5/431/3106127 oleh tamu pada tanggal 22
sangat menarik karena murah dan tersedia dari internet dan sumber
ilegal lainnya dan dapat dengan mudah digunakan dalam dosis yang
sangat rendah untuk menghindari deteksi dengan metode yang tidak
sensitif. Kekhawatiran yang sangat besar adalah bahwa banyak
laboratorium forensik kuda mungkin tidak menguji obat-obatan ini
hari ini secara teratur sebagaimana mestinya, terutama karena mereka
kurang populer dibandingkan dengan obat-obatan lain dan dengan
demikian, kurang perhatian diberikan kepada mereka dalam latihan
pengujian obat harian oleh laboratorium forensik kuda. Oleh karena
itu, penelitian ini dilakukan untuk mengembangkan metode LC-MS-
MS yang cepat dan sensitif untuk deteksi, kuantifikasi, dan
konfirmasi 17 barbiturat secara simultan pada kuda pacu (Gambar 1).
Dengan tersedianya metode yang cepat, sederhana dan sensitif ini,
kami berharap dapat menarik perhatian para analis pacuan kuda
untuk menyadari bahwa dalam industri pacuan kuda, obat-obatan
tidak ditinggalkan tetapi didaur ulang dalam jangka waktu yang tidak
ditentukan. Metode ini cepat, sensitif, dan dapat direproduksi.

EKSPERIMENTAL
Bahan kimia dan reagen
Larutan stok standar referensi (1 mg/m L) dari butabarbital, pento-
barbital, butalbital, amobarbital, secobarbital, fenobarbital,
heksobarbital dan pentobarbital-d5 , sebagai standar internal (IS),
dibeli dari Cerilliant (Round Rock, Texas, AS), sedangkan aprobar-
bital, allobarbital, barbital, methohexital, thiopental, metharbital,
cyclopentobarbital, p-hydroxyphenobartial, dan butethal dibeli dari
Grace (Deerfield, IL, AS). Standar referensi tiamin ( bubuk kering)
diperoleh dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Amonium asetat
dibeli dari Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, AS). Semua pelarut yang
digunakan memiliki kualitas HPLC (Thermo Fisher Scientific, Fair
Lawn, NJ, USA). Air HPLC (Optima® ) diperoleh secara murni dari
Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA).

Stok dan solusi standar kerja

Setiap larutan stok (1 mg/mL) dari 16 barbiturat dan pentobarbital- d5
(IS) diperoleh langsung dari perusahaan induk, dan disimpan pada
suhu 4°C. Larutan stok tiamin (1 mg/mL) dilarutkan dalam metanol
dan disimpan pada suhu 4°C. Campuran 15 barbiturat (kecuali
pentobarbital dan butethal) pada 10 μg / mL dibuat dengan
menambahkan 50 μL dari setiap larutan stok (1 mg / mL) ke dalam
4250 μL campuran amonium asetat-metanol 2 mM (50: 50, v / v),
untuk mendapatkan 5 mL. Campuran dua larutan barbiturat
(pentobarbital dan butethal) pada 10 μg / mL dibuat dengan
menambahkan 50 μL masing-masing larutan stok (1 mg / mL) ke
4900 μL campuran amonium asetat-metanol 2 mM (50: 50, v / v),
untuk mendapatkan 5 mL. Larutan kerja 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05 dan
0,01 μg / mL dibuat dari setiap larutan campuran 10 μg / mL dengan
pengenceran dengan campuran amonium asetat-metanol 2 mM (50:
50, v / v), dan disimpan pada suhu 4 ° C.
Metode LC-MS-MS yang divalidasi untuk Analisis Simultan 17 Barbiturat 433
Air dengan kualitas HPLC. pH disesuaikan menjadi 6,0
menggunakan asam asetat atau amonium hidroksida. Buffer
amonium asetat (2 mM) dibuat dengan mengencerkan larutan stok
buffer amonium asetat dalam air dengan tingkat kemurnian tinggi.

Persiapan sampel kalibrasi

Plasma kuda yang digunakan dalam penelitian ini sebagai sampel
kontrol negatif sebelumnya telah diperiksa dan ditemukan bebas
dari salah satu atau semua 17 barbiturat dan pentobarbital-d5 (IS)
dengan menggunakan metode LC-MS-MS yang dijelaskan dalam
penelitian ini. Alikuot 1,0 mL plasma kuda dipindahkan ke dalam
tabung kaca sekali pakai yang baru (16 mm × 125 mm). Satu
alikuot (10 μL) dari setiap larutan standar kerja dan 10 μL IS (1 μg /
mL) ditambahkan ke 1,0 mL plasma kosong untuk menyiapkan
kalibrator 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, dan 100 ng / mL. Semua sampel
disiapkan sebelum digunakan.

Persiapan sampel
Analit target diambil dari plasma menggunakan ekstraksi cair-cair
(LLE). Untuk setiap 1 mL sampel plasma, 5 mL metil tert-butil eter
(MTBE) ditambahkan, dan dicampur pada perangkat rotorack
(Thermolyne, Dubuque, IA, USA) selama 10 menit diikuti dengan
sentrifugasi (1600 × g) selama 10 menit. Lapisan organik (atas)
dipindahkan ke dalam tabung kaca sekali pakai yang bersih (16 mm
× 100 mm). Ekstrak dikeringkan pada suhu 50°C (Techne Dri-
Block DB-3, Duxford, Cambridge, UK) di bawah aliran nitrogen
yang stabil. Ekstrak kering dilarutkan dalam 100 μL campuran
amonium asetat-metanol 2 mM (90:10, v/v) dan dianalisis
menggunakan LC-MS-MS.

Kromatografi cair
Kromatografi cair terdiri dari LC 20 A dengan autosampler SIL-
HTc (Shimadzu, Columbia, MD, USA). Pemisahan analit dilakukan
pada kolom ACE C18 fase terbalik (5 cm × 2,1 mm ID, ukuran
partikel 5 µm,) dengan kolom pelindung yang sesuai (1 cm × 2,1
mm ID, ukuran partikel 5 µm; Mac-Mod Analytical, Chadds Ford,
PA, USA). Gradien fase gerak terdiri dari dua komponen: pelarut A
dan B. Pelarut A adalah 2 mM amonium asetat, pH 6,0 dan pelarut
B adalah metanol. Gradien fase gerak yang digunakan diprogram
untuk pemisahan analit: 90% pelarut A dan 10% pelarut B untuk 0,1
menit pertama, pelarut B ditingkatkan menjadi 90% dari 0,1 hingga
1,5 menit, dan ditahan selama 2,5 menit sebelum dikembalikan ke
kondisi awal selama 3 menit. Aliran berada pada 300 μL/menit.
Volume injeksi adalah 10 μL, dan suhu oven dijaga pada 30 ° C.

Spektrometri massa
Analisis massa dilakukan pada spektrometer massa 4000 Q-Trap
(AB Sciex, Foster City, CA, USA) dengan sumber ionisasi
elektrospray (ESI) yang dioperasikan dalam mode ion negatif.
Parameter yang bergantung pada sumber dioptimalkan dengan
menggunakan analisis injeksi aliran. Tegangan IonSpray ditetapkan
pada -3000 V, dan suhu sumber adalah 500°C. Gas tirai, gas 1 dan
gas 2 masing-masing adalah 10, 50 dan 50 psi. Dalam mode
pemindaian Multiple-reaction monitoring (MRM), deteksi 17 analit
dicapai dengan memantau ion produk (PI) yang paling kuat dari
setiap analit. Potensi penguraian (DP), energi tumbukan (CE) dan
potensi keluar sel tumbukan (CXP) yang digunakan untuk setiap
analit tercantum dalam Tabel I. Potensial masuk untuk semua analit
adalah -10 eV. Waktu tinggal untuk setiap transisi ion adalah 50 ms
dengan waktu jeda 5 ms. Optimasi parameter yang bergantung pada
analit dilakukan dengan penyetelan secara manual untuk setiap
analit. Pemilihan deprotonasi
434
Gambar 1. Struktur kimia dari 17 barbiturat dan berat molekulnya.
molekul, [M - H]− , dan optimasi DP dilakukan dengan memasukkan
1 μg / mL setiap larutan standar obat referensi dalam mode
pemindaian penuh. Akuisisi dan analisis data dilakukan dengan
perangkat lunak Analyst 1.5 (AB Sciex). Waktu analisis untuk semua
17 tingkat barbitu adalah 7 menit.
Liu et al.
November 2023
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/41/5/431/3106127 oleh tamu pada tanggal 22
Validasi metode
Ketepatan dan akurasi dalam satu hari dan antar hari
Untuk evaluasi presisi dan akurasi dalam satu hari, tiga set dari enam
sampel plasma ulangan yang mengandung analit pada 0,5 ng / mL
(rendah), 5 ng / mL (sedang) dan 50 ng / mL (tinggi) dianalisis pada
saat yang sama.
Metode LC-MS-MS yang divalidasi untuk Analisis Simultan 17 Barbiturat 435

Tabel I. Parameter MRM dan Waktu Retensi untuk Masing-masing dari 17 Barbiturat dan IS

Obat Ion prekursor (m/z) Ion produk yang dipilih (m/z) Waktu retensi (menit) DP (V) CE (eV) CXP (V)

Allobarbital 207 164a 85 42 3.24 -55 -15 -13

Amobarbital 225 42a 182 85 3.50 -69 -36 -4
Aprobarbital 209 166a 122 42 3.32 -60 -16 -11
Barbital 183 42a 140 85 3.02 -53 -35 -5
Butabarbital 211 168a 42 85 3.38 -57 -18 -2
Butalbital 223 42a 180 85 3.42 -60 -45 -4
Butethal 211 168a 42 85 3.40 -69 -17 -7
Cyclopentylbarbital 233 190a 85 197 3.42 -64 -17 -3
Hexobarbital 235 42a 99 217 3.49 -63 -45 -4
Metharbital 197 42a 151 107 3.30 -56 -35 -5
Methoheksital 261 42a 180 119 3.63 -68 -36 -4
Pentobarbital 225 182a 138 42 3.51 -60 -18 -13

November 2023
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/41/5/431/3106127 oleh tamu pada tanggal 22
Pentobarbital-d5 230 187a 143 85 3.50 -69 -19 -9
Fenobarbital 231 42a 188 85 3.30 -55 -33 -4
p-Hidroksilfeno-barbital 247 204a 42 133 3.04 -61 -16 -4
Secobarbital 237 42a 194 85 3.55 -59 -35 -5
Thiamylal 253 58a 101 41 3.62 -69 -45 -2
Thiopental 241 58a 101 138 3.59 -57 -49 -2

aIon produk paling kuat yang digunakan dalam pemindaian MRM untuk penyaringan dan kuantifikasi. CE dan CXP adalah untuk ion produk yang paling kuat.

Tabel II. LOD, LOQ, LOC, Efisiensi Pemulihan Ekstraksi dan Efek Matriks Plasma pada Analisis 17 Barbiturat

Obat LOD (ng/mL) LOQ (ng/mL) LOC (ng/mL) Efisiensi ekstraksi (%) 5 Efek matriks (%)
ng / mL 5 ng/mL

Allobarbital 0.03 0.1 0.2 92.9 -2.0

Amobarbital 0.03 0.1 0.2 98.0 1.3
Aprobarbital 0.03 0.1 0.2 95.7 3.6
Barbital 0.2 0.5 2.5 93.9 -2.4
Butabarbital 0.03 0.1 0.2 98.4 2.0
Butalbital 0.03 0.1 0.2 98.9 -4.1
Butethal 0.03 0.1 0.2 97.8 -1.5
Cyclopentylbarbital 0.03 0.1 0.2 99.5 -1.3
Hexobarbital 0.03 0.1 0.2 94.2 9.2
Metharbital 1 2.5 5 44.3 41.3
Methoheksital 0.03 0.1 0.2 92.9 14.3
Pentobarbital 0.03 0.1 0.2 90.0 1.2
Fenobarbital 0.03 0.1 0.2 93.1 -0.5
p-Hidroksilfeno-barbital 0.03 0.1 0.2 91.5 -13.6
Secobarbital 0.01 0.05 0.1 97.3 7.5
Thiamylal 0.003 0.01 0.02 92.0 5.2
Thiopental 0.003 0.01 0.02 98.0 7.1

hari. Untuk presisi dan akurasi antar hari, tiga set dari dua sampel analit yang ditambahkan ke ekstrak plasma kosong. Efek matriks
plasma duplo yang mengandung analit dengan konsentrasi rendah, dihitung dari persamaan berikut:
sedang, dan tinggi yang sama dianalisis selama tiga hari berturut-
turut. Akurasi ditentukan sebagai kesesuaian antara konsentrasi analit Efek matriks (%) = (Ekstrak plasma - Ekstrak air) / Ekstrak air × 100
yang dikuantifikasi dan yang ditambahkan k e d a l a m
plasma kosong. Presisi pengujian dinyatakan sebagai deviasi standar
di mana Awater ekstrak adalah area puncak dari standar analit dalam
relatif yang dihitung sebagai persen dari deviasi standar dibagi
ekstrak air, dan ekstrak plasma adalah standar analit yang
dengan rata-rata konsentrasi yang diamati.
ditambahkan ke ekstrak plasma kosong.

Efek matriks plasma pada metode
Air digunakan untuk membandingkan efek matriks yang
dikontribusikan oleh plasma dengan air. Efek matriks dievaluasi
dalam tiga ulangan pada 5 ng / mL dan dihitung dengan
membandingkan puncak kromatografi dari masing-masing standar
analit yang ditambahkan ke ekstrak air dengan
Stabilitas 17 barbiturat dalam plasma kuda
Stabilitas barbiturat pada 0,5, 5,0 dan 50 ng / mL yang disiapkan
dalam plasma kuda dan disimpan pada berbagai kondisi suhu (25,
4, -20 dan -70 ° C) dievaluasi. Pada suhu kamar (~ 25 ° C),
stabilitas 24 jam (pada 0, 2, 4, 6, 8, 10 dan 24) untuk plasma yang
dibubuhi analit
436
sampel dinilai. Untuk penyimpanan jangka pendek (4°C), stabilitas
selama 10 hari penyimpanan diperiksa, dan untuk penyimpanan
jangka panjang (-20 dan
-70°C) stabilitas selama 5 minggu telah dievaluasi. Konsentrasi rata-
rata
dari setiap analit dari sampel rangkap tiga pada setiap kondisi suhu
dan lama waktu penyimpanan ditentukan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Efisiensi ekstraksi barbiturat dari plasma kuda MTBE
adalah "pelarut ekstraksi universal" dan secara luas digunakan di
laboratorium kami untuk persiapan sampel untuk memulihkan analit
dari plasma dan urin. Semua 17 barbiturat menjadi sasaran efisiensi
ekstraksi pelarut ekstraksi, MTBE. Efisiensi ekstraksi ditentukan
dengan menganalisis enam sampel plasma yang berbeda pada 5
ng/mL. Sampel yang diproses diperlakukan dengan cara yang sama
persis seperti yang dijelaskan di atas tetapi sampel standar disiapkan
dengan menambahkan ekstrak plasma kosong dengan analit untuk
menghindari efek matriks. Efisiensi ekstraksi dihitung dengan
membandingkan area puncak parut untuk sampel yang diproses
dengan sampel standar obat. Efisiensi ekstraksi 17 barbiturat masing-
masing pada 5 ng / mL dari plasma kuda adalah> 90% dengan
variasi koefisien <10% untuk sebagian besar analit kecuali
metarbital (Tabel II).
Kromatografi
Kromatogram LC-MS / MRM dari 17 barbiturat dan IS pada 5 ng
/ mL yang ditambahkan dalam plasma kuda kosong, diekstraksi
dan dianalisis menggunakan metode ini ditunjukkan pada Gambar
2. Waktu retensi (tR ) adalah antara 3,0 dan 3,7 menit untuk semua
analit
Gambar 2. Kromatogram LC-MS-MS dari 17 barbiturat pada 5 ng / mL yang diekstraksi dari plasma kuda menggunakan MTBE.
Liu et al.
(Tabel I). Beberapa analit seperti amobarbital dan pentobarbital,
butabarbital dan butethal, merupakan isomer struktural.
Amobarbital dan pentobarbital memiliki ion molekul terdeprotonasi
yang sama, [M - H]− , pada m/z 225, dan dengan demikian, tidak
dapat sepenuhnya diselesaikan dengan waktu retensi saja, karena
alasan itulah kedua obat ini tidak dapat dengan mudah dibedakan
satu sama lain. Butabarbital dan butethal juga memiliki ion
molekul terdeprotonasi yang sama, [M - H]− , pada m / z 211, dan
keduanya juga tidak dapat sepenuhnya diselesaikan dengan waktu
retensi. Dengan demikian, kedua obat tidak dapat dengan mudah
dibedakan satu sama lain. Metode untuk memisahkan keempat
analit ini dari satu sama lain dikembangkan dalam studi terpisah,
dan akan siap diterapkan jika keberadaan keempat isomer ini
diprediksi oleh metode ini. Secara singkat, metode ini melibatkan
November 2023
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/41/5/431/3106127 oleh tamu pada tanggal 22
pemisahan sampel pada kolom Hypersi-Keystonel Betasil C18
dengan campuran amonium hidroksida- asetonitril 0,1% (96:4,
v/v) sebagai fase gerak. Dengan menggunakan kolom pemisahan,
kondisi dan fase gerak yang dijelaskan, isomer dapat dipisahkan
dengan jelas satu sama lain.
Spektrometri massa
Identifikasi tiga PI yang paling melimpah (setiap PI yang dihasilkan
dari hilangnya molekul air dikeluarkan karena kurangnya
spesifisitas) dan pemilihan CE dan CXP yang optimal untuk setiap
analit dicapai dalam mode pemindaian PI dan MRM. Tiga transisi
ion dari [M - H]− dipilih untuk setiap analit (Tabel I), PI (diagnostik)
yang paling kuat dipilih untuk digunakan dalam skrining untuk analit
spesifik, sedangkan dua ion yang tersisa dari ion prekursor yang
sama digunakan untuk konfirmasi analit dengan perbandingan rasio
intensitas ion. Transisi MRM, DP, CE dan CXP dari setiap analit
target tercantum dalam Tabel I.
Metode LC-MS-MS yang divalidasi untuk Analisis Simultan 17 Barbiturat 437

Penyaringan, kuantifikasi, dan konfirmasi barbiturat
dalam plasma kuda
Berdasarkan spektrum MS/MS, transisi MRM untuk setiap analit
dipilih untuk penyaringan, kuantifikasi dan konfirmasi dari 17 analit.
Satu transisi MRM yang paling melimpah digunakan untuk
penyaringan dan kuantifikasi sedangkan tiga transisi MRM
digunakan untuk konfirmasi (Tabel I). Konfirmasi keberadaan analit
dalam sampel uji ditunjukkan ketika ada kecocokan data spektrum
massa antara yang tidak diketahui dan yang dari standar obat otentik
(23, 24). Untuk konfirmasi dengan instrumen triple quadrupole,
secara umum dapat diterima untuk puncak kromatografi yang
terdeteksi oleh MRM pada tiga atau empat transisi ion pada waktu
retensi yang sama menjadi kriteria yang cukup untuk
mengkonfirmasi keberadaan senyawa target dalam sampel uji. Dalam
plasma didefinisikan sebagai: (i) kesamaan rasio intensitas ion antara
sampel yang tidak diketahui dan sampel standar referensi yang sesuai
harus berada dalam rentang 90-110% dan (ii) waktu retensi salah
satu barbiturat dalam sampel yang tidak diketahui harus berada
dalam rentang ± 0,1 menit dari standar obat referensi (Tabel I).
Validasi metode
Metode ini divalidasi sesuai dengan "Pedoman untuk Industri:
Validasi Metode Bioanalitik" (25). Gambar 2 menunjukkan puncak
kromatografi dari ekstrak plasma kosong di bawah kondisi analitik.
Tidak adanya gangguan dicatat pada waktu retensi di mana kedua
analit target dan puncak IS terjadi. Metode ini dievaluasi untuk batas
deteksi (LOD), batas kuantifikasi (LOQ), batas konfirmasi (LOC),

penelitian ini, perbandingan rasio intensitas ion digunakan untuk
konfirmasi (Gambar 3). Tiga ion produk yang digunakan dalam
menghitung rasio intensitas ion tercantum dalam Tabel I. Dalam
menghitung rasio intensitas ion, ketinggian puncak kromatografi
MRM adalah pembilang sedangkan ion produk yang paling
melimpah adalah penyebut. Kesamaan dalam rasio intensitas ion
dihitung menurut persamaan berikut:
Kemiripan rasio intensitas ion (%) = Tidak diketahui / × 100
Rstandard
di mana Runknown mewakili rasio intensitas ion dari sampel yang
tidak diketahui dan Rstandard mewakili rasio intensitas ion untuk
standar obat. Dengan demikian, kriteria untuk konfirmasi
keberadaan barbiturat dalam kuda
November 2023
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/41/5/431/3106127 oleh tamu pada tanggal 22
linearitas, presisi dan akurasi. Kisaran untuk LOD dari analit target
adalah 0,003-1 ng / mL (S / N ≥3). LOQ didefinisikan sebagai
konsentrasi terendah dalam kurva kalibrasi yang diukur dengan
akurasi dan presisi yang dapat diterima. Kisaran untuk LOQ analit
target adalah 0,01-2,5 ng/mL. LOC adalah konsentrasi terendah di
mana ion produk cukup untuk menghasilkan rasio intensitas ion
produk yang stabil untuk konfirmasi
keberadaan masing-masing analit. Kisaran untuk batas konfirmasi
adalah 0,02-5 ng / mL (Tabel II). Rentang dinamis linier adalah 0,1-
100 ng / mL untuk 17 analit dalam plasma kuda dengan r2 > 0,995.
Intra-hari
Akurasi kuantifikasi adalah 96-106% sedangkan akurasi antar-hari
juga 96-106%. Presisi intra-hari (% CV) dan presisi antar-hari
adalah <10% (Tabel III).

Gambar 3. Perbandingan rasio intensitas ion antara sampel plasma dari pasca-balapan (panel kanan) dan standar referensi fenobarbital (panel kiri, 25 ng/mL)
yang d i t a m b a h k a n k e d a l a m plasma kuda kosong, yang diekstraksi dan dianalisis dengan cara yang sama. Panel kiri menunjukkan tiga transisi
MRM fenobarbital (m/z 231 → 42, 231 → 188, 231 → 85). Panel kanan juga menunjukkan tiga transisi MRM fenobarbital yang identik yang terkandung dalam
sampel plasma pasca-balapan. Kesamaan rasio intensitas ion (dalam tanda kurung) mengindikasikan bahwa senyawa yang terdeteksi dalam sampel plasma
kuda pasca pacuan kuda adalah fenobarbital.
438 Liu et al.

Metode LC-MS-MS yang divalidasi untuk Analisis Simultan 17 Barbiturat

November 2023
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/41/5/431/3106127 oleh tamu pada tanggal 22
Tabel III. Presisi dan Akurasi Intra dan Antar-Hari untuk Kuantifikasi 17 Barbiturat dalam Plasma Kuda

Obat-obatan Intra-hari Antar hari

0,5 ng / mL 5 ng / mL 50 ng / mL 0,5 ng / mL 5 ng / mL 50 ng/ml

Akurasi Presisi Akurasi Presisi Akurasi Presisi Akurasi Presisi Akurasi Presisi Akurasi Presisi
(%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)

Allobarbital 103.1 2.6 99.8 3.9 98.6 2.9 101.7 6.8 102.1 5.4 100.6 3.8
Amobarbital 99.5 1.6 97.4 3.2 98.2 3.1 100.8 2.6 100.2 4.2 100.6 2.7
Aprobarbital 96.0 2.8 100.6 2.7 99.8 2.2 99.8 4.8 99.5 3.2 100.9 3.3
Barbital 98.6 5.6 97.0 3.2 100.6 4.2 102.3 7.6 98.6 4.9 99.8 3.8
Butabarbital 100.5 3.6 98.2 3.4 98.5 3.4 103.6 4.6 100.4 3.7 99.6 3.1
Butalbital 101.9 5.2 99.6 5.1 98.6 2.6 101.0 5.7 99.1 4.2 99.8 3.6
Butethal 100.5 5.1 99.4 4.8 98.9 2.4 103.6 6.4 102.1 5.8 99.9 3.4
Cyclopentylbarbital 99.8 6.2 99.2 5.6 99.4 3.5 101.7 7.3 99.4 6.9 99.0 3.6
Hexobarbital 101.3 3.8 99.9 7.2 99.8 3.4 99.8 4.3 102.6 6.1 99.2 4.2
Metharbital - - 97.1 5.6 95.6 8.6 - - 101.8 6.8 96.4 8.9
Methoheksital 100.4 4.6 98.3 4.8 100.4 3.6 99.4 5.8 98.4 6.7 100.6 3.5
Pentobarbital 98.0 7.1 98.8 5.3 98.9 3.2 98.2 7.4 99.8 4.3 99.8 3.4
Fenobarbital 100.1 4.8 98.4 4.8 99.6 2.8 104.5 5.6 98.6 5.8 99.4 3.8
P-Hydroxylphenobarbital 103.0 3.3 99.8 2.9 102.7 4.5 103.0 7.3 98.1 4.1 100.2 6.1
Secobarbital 97.2 5.5 97.4 5.9 99.9 4.3 105.7 6.6 100.1 5.3 100.1 4.2
Thiamylal 105.3 2.7 104.1 4.7 104.5 2.8 103.7 6.2 104.7 5.4 101.6 3.6
Thiopental 106.0 3.6 101.8 3.4 98.5 3.4 102.6 6.8 104.1 6.6 101.8 3.9

437
438 Liu et al.

Tabel IV. Stabilitas 17 Barbiturat dalam Plasma Kuda pada Kondisi Penyimpanan yang Berbeda

Obat Konsentrasi (ng/mL) Kondisi penyimpanan dan konsentrasi rata-rata yang diukur (n = 3)

25°C, 24 jam 4°C, 10 hari -20°C, 35 hari -70°C, 35 hari

Allobarbital 0.5 0.53 0.52 0.53 0.51

5 4.78 4.45 4.25 4.92
50 50.24 51.88 51.44 50.08
Amobarbital 0.5 0.48 0.52 0.50 0.46
5 4.91 4.82 4.96 4.84
50 49.23 50.41 49.64 49.28
Aprobarbital 0.5 0.49 0.48 0.51 0.50
5 4.98 4.93 5.03 4.86
50 49.25 50.84 48.56 51.03
Barbital 0.5 0.46 0.49 0.48 0.50
5 4.93 5.07 4.99 4.82

November 2023
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/41/5/431/3106127 oleh tamu pada tanggal 22
50 50.26 51.52 51.22 50.14
Butabarbital 0.5 0.48 0.52 0.49 0.48
5 4.78 5.10 4.76 5.13
50 49.54 48.96 51.40 50.74
Butalbital 0.5 0.47 0.50 0.48 0.49
5 4.72 4.81 5.01 5.15
50 48.86 49.98 50.36 51.48
Butethal 0.5 0.48 0.50 0.48 0.49
5 5.06 4.99 4.82 4.92
50 52.28 50.88 49.46 50.62
Cyclopentylbarbital 0.5 0.49 0.48 0.48 0.49
5 4.87 5.06 5.13 4.94
50 49.68 50.45 51.33 50.18
Hexobarbital 0.5 0.50 0.47 0.48 0.46
5 4.79 4.87 4.89 5.08
50 51.93 50.78 50.08 48.96
Metharbital 0.5 - - - -
5 4.58 5.03 5.26 4.94
50 49.12 49.62 50.72 47.48
Methoheksital 0.5 0.52 0.49 0.48 0.48
5 4.54 4.78 4.94 4.82
50 51.32 50.62 49.26 48.89
Pentopbarbital 0.5 0.49 0.51 0.52 0.48
5 4.85 4.67 4.92 4.99
50 51.96 50.87 46.66 48.79
Fenobarbital 0.5 0.48 0.52 0.51 0.48
5 4.85 4.83 5.12 4.96
50 49.04 51.48 50.36 49.19
p-Hydroxyphenobarbital 0.5 0.45 0.47 0.49 0.50
5 4.53 4.68 4.86 4.95
50 48.74 50.80 48.76 48.04
Secobarbital 0.5 0.46 0.49 0.48 0.49
5 4.85 4.62 5.03 5.05
50 52.28 50.03 49.54 50.57
Thiamyla 0.5 0.44 0.48 0.47 0.46
5 4.50 4.80 4.64 4.89
50 46.21 50.11 47.14 49.60
Thiopental 0.5 0.42 0.49 0.49 0.50
5 4.52 4.84 4.91 4.88
50 49.80 51.45 48.26 50.91

Efek matriks yang dikontribusikan oleh plasma
Efek matriks adalah fenomena khusus yang terkait dengan analisis
LC-MS-MS obat dalam cairan biologis. Senyawa endogen yang
diekstraksi dari matriks sampel dapat menekan atau meningkatkan
ionisasi analit yang diperoleh kembali dari matriks yang
mengakibatkan perubahan intensitas sinyal analit, terutama ketika
mode ionisasi ESI diterapkan. Dalam
metode ini, efek matriks pada analit yang diminati dinilai. Seperti yang
ditunjukkan pada Tabel II, penekanan atau peningkatan ion yang
disumbangkan oleh plasma kurang dari 20% untuk sebagian besar
senyawa target kecuali metarbital (41,3%). Hasilnya menunjukkan
bahwa efek matriks tidak separah mengubah hasil kuantifikasi untuk
sebagian besar senyawa target dalam kondisi eksperimental yang
digunakan.
Metode LC-MS-MS yang Telah Divalidasi untuk Analisis Simultan 17 Barbiturat
Gambar 4. Hasil representatif untuk kuantifikasi fenobarbital dalam plasma kuda. Dua panel atas menunjukkan tidak adanya kromatogram LC-MS fenobarbital
yang diharapkan dalam pelarut blanko dan ekstrak plasma kosong. Dua kromatogram LC-MS bagian bawah menunjukkan sampel plasma kuda pasca-pacu
yang mengandung fenobarbital dengan waktu retensi 3,30 menit dan standar referensi fenobarbital pada 10 ng / mL yang ditambahkan ke dalam plasma
kosong, diekstraksi dan dianalisis dan menunjukkan waktu retensi 3,31 menit. Kesamaan waktu retensi kromatografi antara kedua kromatogram menunjukkan
adanya fenobarbital dalam sampel plasma pasca-balapan.
Stabilitas analit
Hasil stabilitas yang diperoleh (Tabel IV) menunjukkan bahwa
plasma kuda yang disuplementasi dengan barbiturat stabil selama 24
jam pada suhu ruang, selama 10 hari pada suhu 4°C, dan selama 5
minggu pada suhu -20 dan -70°C. Di PA, sampel pasca-pacu (darah
dan urin) tidak dapat dikirim ke laboratorium untuk analisis obat
pada hari yang sama saat pacuan dilakukan karena laboratorium tidak
berada di setiap lintasan pacuan kuda. Karena alasan ini, sampel
pasca balapan biasanya disimpan pada suhu -20°C selama beberapa
waktu setelah pengumpulan sambil menunggu pengiriman ke
laboratorium melalui kurir. Dengan demikian, efek suhu pada
stabilitas senyawa target dalam plasma sangat penting dalam
memperoleh informasi yang akurat tentang obat yang ada dalam
sampel uji. M e m p e r t i m b a n g k a n fakta bahwa sampel mungkin
mengalami k o n d i s i suhu yang berbeda selama transit dan dapat
memakan waktu hingga 24 jam untuk pengiriman sampel ke
laboratorium, stabilitas analit di bawah perubahan potensial dalam
kondisi suhu sepenuhnya dicakup ketika percobaan ini dirancang
(Tabel IV).
Analisis sampel plasma pasca-balapan untuk
mengetahui keberadaan fenobarbital
Metode yang dijelaskan di atas secara rutin diterapkan pada
penyaringan, kuantifikasi, dan konfirmasi 17 barbiturat dalam sampel
plasma kuda pasca pacuan kuda yang dikumpulkan di PA. D a l a m
salah satu analisis rutin yang dilakukan pada sampel plasma pasca
pacuan kuda yang dikirim ke laboratorium, keberadaan fenobarbital
dicurigai pada salah satu sampel plasma selama penyaringan awal.
Konsentrasi
439
November 2023
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/41/5/431/3106127 oleh tamu pada tanggal 22
fenobarbital dalam sampel plasma diperkirakan mencapai 14,08 ±
0,58 ng/mL (Gambar 4). Setelah analisis lebih lanjut, keberadaan
fenobarbital dalam sampel dikonfirmasi dengan menggunakan
perbandingan rasio intensitas ion (Gambar 3). Dengan memilih tiga
ion produk dari fenobarbital dan membandingkannya dengan rasio
tinggi puncak i o n produk, serta waktu retensi kromatografinya,
sampel y a n g t i d a k diketahui memiliki sidik jari kimia yang
sama dengan standar referensi fenobarbital otentik (Gambar 3; panel
kiri dan kanan). Ion produk fenobarbital y a n g paling umum (m/z 42)
digunakan sebagai ion kuantifikasi. Sejak metode ini dikembangkan
hingga saat ini, metode ini telah berhasil diaplikasikan pada sejumlah
besar sampel plasma dan jaringan postmortem yang diperoleh dari
kuda pacu pasca kompetisi di PA. Hasil yang diperoleh menunjukkan
bahwa metode ini cepat, sederhana, dapat diandalkan, dan sensitif
secara andal untuk analisis simultan 17 barbiturat dalam plasma kuda.
Kesimpulan
Metode penyaringan, kuantifikasi dan konfirmasi yang cepat dan
sensitif untuk 17 barbiturat dalam plasma kuda menggunakan LC-
MS/MRM telah dikembangkan dan divalidasi. Metode ini mencakup
hampir semua barbiturat utama yang dapat digunakan untuk
mengatur penggunaan obat-obatan yang dilarang pada kuda pacu
selama kompetisi di PA. Metode ini secara rutin dan berhasil
digunakan dalam analisis sampel pasca kompetisi yang diperoleh dari
kuda pacu di PA untuk penggunaan yang dilarang dari salah satu dari
17 barbiturat yang tercakup dalam penelitian ini. Metode i n i cepat,
sensitif, dan dapat direproduksi dengan andal.
440
Ucapan terima kasih
Penelitian ini didanai oleh Komisi Balap Pennsylvania, dan kontribusi finansial
diberikan oleh Asosiasi Penunggang Kuda Pennsylvania di Pocono Downs dan
Chester Downs, Asosiasi Pemilik Kuda Standar Meadows, Asosiasi
Penunggang Kuda yang Baik Hati dan Protektif di Penn National dan Presque
Isles Downs. Penelitian ini dilakukan ketika penulis utama berada di Fakultas
Kedokteran Hewan Universitas Pennsylvania di bawah bimbingan Drs Uboh
dan Soma.
Referensi
1. Kraemer, T., Maurer, H.H. Buku Pegangan Pemisahan Analitik, Vol. 2.
Elsevier: Oxford, 2000; hal. 197-203.
2. Cozanitis, DA (2004) Seratus tahun barbiturat dan orang suci mereka.
Journal of the Royal Society of Medicine, 97, 594-598.
3. Peschka, M., Eubeler, JP, Knepper, TP (2006) Keberadaan dan nasib
barbiturat di lingkungan perairan. Ilmu Lingkungan & Teknologi , 40,
7200-7206.
4. Kuroda, N., Inoue, K., Mayahara, K. (1996) Aplikasi 3-(18- naftalimido)
silil silika gel yang dimodifikasi dengan propil sebagai fasa diam pada
kromatografi cair berkinerja tinggi untuk senyawa barbiturat dan diastero-
merik. Jurnal Kromatografi Cair & Teknologi Terkait, 19, 2867-2881.
5. Nandi, V., Soine, W.H. (1997) Analisis HPLC untuk amobarbital N-
glikosida dalam urin. Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis, 15, 1187-
1195.
6. Tanaka, E., Terada, M., Tanno, K. (1997) Analisis forensik dari 10
b a r a b a t i p a d a sampel biologis manusia menggunakan kolom
kroma-trografi fase terbalik yang dikemas dengan silika mikro berpori
berpori 2 mikrometer- gel. Ilmu Pengetahuan Forensik Internasional, 85,
73-82.
7. Shabir, GA, Bradshaw, TK, Arain, SA (2010) Metode baru yang telah
divalidasi untuk penentuan simultan serangkaian delapan barbiturat dengan
RP-HPLC. Jurnal Kromatografi Cair & Teknologi Terkait, 33, 61-71.
8. Marshall, D., Robinson, M., Hincks, P. (2000) Penerapan model in vitro
untuk produksi metabolit: isolasi dan karakterisasi hidroksisekobarbital.
Chromatographia, 52, S35-S38.
9. Namera, A., Yashiki, M., Okada, K., Iwasaki, Y., Ohtani, M., Kojima, T.
(1998) Persiapan otomatis dan analisis barbiturat dalam urin manusia
menggunakan sistem gabungan PrepStation dan kromatografi gas-
spektrometri massa. Jurnal Kromatografi B, Aplikasi Biomedis, 706, 253-
259.
10. Meatherall, R. (1997) Konfirmasi GC/MS dari barbiturat dalam darah dan
urin. Jurnal Ilmu Forensik, 42, 1160-1170.
11. Hall, BJ, Brodbelt, JS (1997) Penentuan barbiturat dengan ekstraksi mikro
fasa padat (SPME) dan kromatografi gas perangkap ion - spektrometri
massa. Jurnal Kromatografi. A, 777, 275-282.
12. Iwai, M., Hattori, H., Arinobu, T., Ishii, A., Kumazawa, T., Noguchi,
H. (2004) Penentuan barbiturat secara simultan dalam cairan biologis
manusia dengan perendaman langsung mikroekstraksi fase padat dan gas
Liu et al.
kromatografi-spektrometri massa. Jurnal Kromatografi B, 806, 65-73.
13. Collison, I.B., Spieher, V.R., Guluzian, S. (1998) Menetapkan konsentrasi
batas untuk skrining immunoassay pada darah postmortem. Jurnal Ilmu
Forensik, 43, 390-394.
14. Srinivasan, K., Zhang, W., Bartlett, M.G. (1998) Penentuan elektroforesis
kapiler simultan yang cepat dari (R) dan (S) sekobarbital dari serum dan
prediksi interaksi stereoselektif hidroksipropil-gamma-siklodekstrin-
sekobarbital dengan menggunakan simulasi mekanika molekuler. The
Journal of Chromatographic Science, 36, 85-90.
15. Wang, Q., Fan, L., Zhang, W. (2006) Analisis sensitif dari dua tingkat
barbituin dalam urin manusia dengan elektroforesis kapiler dengan
penumpukan sampel yang diinduksi oleh batas reaksi yang bergerak.
Analytica Chimica Acta, 580, 200-205.
16. Zaugg, S., Caslavska, J., Theurillat, R. (1999) Karakterisasi metabolisme
stereoselektif thiopental dan metabolitnya pentobarbital melalui analisis
enansiomernya dalam plasma manusia dengan fesis elektro kapiler. Jurnal
November 2023
Diunduh dari https://academic.oup.com/jat/article/41/5/431/3106127 oleh tamu pada tanggal 22
Kromatografi A, 838, 237-249.
17. Martín-Biosca, Y., Sagrado, S., Villanueva-Camañas, R.M. (1999)
Penentuan barbiturat dalam urin dengan kromatografi cair misel dan injeksi
langsung sampel. Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis , 21, 331-338.
18. Capella-Peiró, M.E., Gil-Agustí, M., Martinavarro-Domínguez, A. (2002)
Penentuan dalam serum beberapa barbiturat menggunakan mikroskopi
cairan misel dengan injeksi langsung. Biokimia Analitik, 309, 261-268.
19. Kanazawa, H., Konishi, Y., Matsushima, Y. (1998) Penentuan obat
penenang dan anestesi dalam plasma dengan kromatografi cair-
spektrometri massa dengan sistem desalting. Jurnal Kromatografi A, 797,
227-236.
20. Feng, J., Wang, L., Dai, I. (2007) Penentuan beberapa obat
penyalahgunaan dan metabolit yang relevan dalam urin secara bersamaan
dengan LC-MS-MS. Jurnal Toksikologi Analitik, 31, 359-368.
21. Miyaguchi, H., Kuwayama, K., Tsujikawa, K., Kanamori, T., Iwata, Y. T.,
Inoue, H., dkk. (2006) Metode untuk menyaring berbagai obat penenang-
hipnotik dalam serum dengan kromatografi cair / spektrometri massa
kuadrupol tunggal. spektrometri. Forensic Science International, 157, 57-
70.
22. Zhu, P., Liu, W., Zhou, R. (2012) Penentuan simultan barbi- tal,
fenobarbital, amobarbital, dan sekobarbital dalam urin manusia
menggunakan kromatografi cair-tandem spektrometri massa berkinerja
tinggi. Zhongguo Weisheng Jianyan Zazhi, 22, 2003-2006.
23. Liu, Y., Uboh, C.E., Soma, L.R., Li, X., Guan, F., You, Y., dkk. (2011)
Analisis gabapentin dalam plasma kuda dengan estimasi ketidakpastian
pengukuran dengan kromatografi cair-spektrometri massa tandem. Jurnal
Toksikologi Analitik, 35, 75-84.
24. Liu, Y., Uboh, C.E., Soma, L.R., Li, X., Guan, F., You, Y., dkk. (2011)
Deteksi dan konfirmasi 60 steroid anabolik dan androgenik dalam plasma
kuda dengan kromatografi cair-spektrometri massa tandem dengan
pencarian pustaka instan . Pengujian dan Analisis Obat, 3, 54-67.
25. Badan Pengawas Obat dan Makanan Amerika Serikat. Panduan untuk
validasi metode bioanalitik industri. Tersedia: www.
fda.gov/downloads/drugs/
guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm070107.pdf