Machine Translated by Google

Kimia Analitik dan Bioanalitik https://

doi.org/10.1007/s00216-024-05173-4

KERTAS PENELITIAN

Bahan-bahan yang sah dan terlarang dalam suplemen makanan:

optimalisasi ekstraksi kemometri dan analisis HILICÿMS/MS

Matteo Baglietto1 · Barbara Benedetti1 · Marina Di Carro1 · Emanuele Magi1

Diterima: 12 Desember 2023 / Direvisi: 16 Januari 2024 / Diterima: 24 Januari 2024

© Penulis 2024

Abstrak
Banyak suplemen makanan mengklaim kemampuan untuk meningkatkan kinerja olahraga dan meningkatkan kebugaran konsumen.
Kadang-kadang, bersama dengan bahan-bahan legal, senyawa terlarang dapat ditambahkan tanpa diberi label, sehingga menyebabkan
doping yang tidak diinginkan. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode analitik untuk menentukan
sekumpulan 12 senyawa polar (logDpH=7 dariÿ2,0 hingga+0,3) termasuk diuretik, stimulan, agonis ÿ2, metilxantin, dan pemanis. Kromatografi
cair interaksi hidrofilik dipilih sebagai strategi pemisahan, ditambah dengan spektrometri massa tandem. Metode instrumental dioptimalkan
menggunakan desain eksperimen dua langkah (DoE). Pertama, DoE Plackett-Burman (PB) dilakukan untuk mengidentifikasi variabel yang
lebih mempengaruhi yang mempengaruhi area puncak dan resolusi kromatografi antara suhu, persentase air dalam fase gerak, dan laju
aliran, serta jenis dan konsentrasi bufer. Kedua, DoE D-optimal ditetapkan, dengan hanya mempertimbangkan variabel paling signifikan dari
hasil PB-DoE, sehingga mencapai pemahaman yang lebih mendalam tentang mekanisme retensi.
Pemrosesan sampel dengan ekstraksi cair-cair berbantuan garam juga dipelajari melalui DoE, dan keseluruhan metode menunjukkan
perolehan dalam kisaran 40–107% dan presisi proseduralÿ11% untuk semua analit. Akhirnya, ini diterapkan pada sampel nyata, di mana
empat metilxantin dan dua pemanis buatan terdeteksi dan diukur dalam kisaran 0,02–192 mg gÿ1.
Nilai-nilai ini dibandingkan dengan jumlah yang dinyatakan pada label DS, jika memungkinkan. Selain itu, serangkaian pemindaian MS/MS
memungkinkan deteksi sinyal di salah satu sampel, yang secara struktural mirip dengan clenbuterol ÿ2-agonis.

Kata Kunci Rancangan percobaan · Ekstraksi cair-cair dengan bantuan garam · Zat doping · LC–MS/MS

Perkenalan mendefinisikan secara rinci apakah temuan laboratorium harus

diubah menjadi sanksi atau tidak, ketika pengecualian terapeutik
Setiap tahun, Badan Anti-Doping Dunia (WADA) menerbitkan dan diberikan atau terjadi doping yang tidak diinginkan [2].
memperbarui daftar larangannya sendiri, yang mencakup zat dan Doping yang tidak disengaja terkait dengan adanya zat terlarang
metode yang dilarang bagi atlet baik di dalam maupun di luar yang tidak diumumkan dalam obat-obatan yang diizinkan [3],
kompetisi [1]. Selain itu, WADA memiliki Kode Anti-Doping Dunia suplemen makanan (DS) [4-8], dan bahkan makanan [5, 9].
(WADC) yang menyelaraskan prosedur laboratorium dan birokrasi Fenomena ini dapat disebabkan oleh kontaminasi silang selama
anti-doping, dan proses produksi atau karena adanya peracikan ilegal yang dilakukan
oleh produsen untuk menjual DS yang “lebih efektif”. Terlepas dari
alasan adanya zat terlarang, atlet yang adil akan menghindari
* Barbara Benedetti
produk yang mencurigakan, dan mereka dibantu oleh beberapa alat
barbara.benedetti@unige.it
yang baru-baru ini diperkenalkan. Misalnya, daftar suplemen
Matteo Baglietto makanan yang mengklaim atau terungkap mengandung zat yang
matteo.baglietto@edu.unige.it
dilarang oleh WADA [10], atau, sebaliknya, database dengan
Marina Di Carro
produk yang disertifikasi aman, setelah menyaring lebih dari 1200
marina.dicarro@unige.it
zat terlarang [11–13]. Namun demikian, jika doping yang tidak
Emanuele Magi diinginkan diklaim oleh atlet, analisis balasan terhadap produk yang
emanuele.magi@unige.it
dicurigai (seringkali DS) diperlukan [5, 14].
1
Departemen Kimia dan Kimia Industri, Daftar WADA mencakup berbagai macam senyawa, dengan
Universitas Genoa, melalui Dodecaneso 31, 16146 Genoa, Italia fungsi dan fisika-kimia yang sangat berbeda

Jil.:(0123456789)
Machine Translated by Google
properti [1]. Oleh karena itu, optimasi yang cermat harus dilakukan
untuk ekstraksi analit secara kuantitatif.
Strategi umum yang digunakan dalam analisis DS adalah ekstraksi
cair-cair atau ekstraksi basa, sering kali diikuti dengan beberapa
langkah yang melelahkan seperti pembersihan dan derivatisasi
[8]. Pendekatan ini, biasanya diterapkan pada analisis anti-doping
pada urin, pakan, atau rambut [15], juga mencakup ekstraksi fase
padat dan hidrolisis enzimatik [15-17].
Namun, strategi yang ideal harus lebih ramah lingkungan, lebih
cepat, lebih mudah, dan ditandai dengan efisiensi proses yang
sama baiknya [18]. Diantaranya, ekstraksi dengan bantuan USG
[19, 20] dan ekstraksi cair-cair homogen (HLLE) adalah pilihan
yang valid. Strategi HLLE melibatkan persiapan larutan fase
tunggal, yang memungkinkan diperolehnya luas permukaan
kontak yang secara teoritis tak terbatas antara sampel dan pelarut
ekstraksi [21]. Kemudian, suatu peristiwa menyebabkan pemisahan
fase, dan sebagian kecil dari kepentingan tersebut bahkan dapat
dianalisis secara langsung. Di antara HLLE, penggunaan pelarut
hidrofilisitas yang dapat dialihkan (SHS) [22] berhasil digunakan
untuk mengekstraksi beberapa senyawa termasuk steroid dan
stimulan, terutama dari urin atau makanan manusia [22, 23],
bahkan jika tidak mempertimbangkannya secara langsung sebagai
“zat doping.” Pendekatan HLLE lainnya adalah ekstraksi asetonitril
melalui efek pengasinan (SOE), juga dikenal sebagai ekstraksi
cair-cair berbantuan garam (SALLE), yang telah diterapkan pada
berbagai matriks dan senyawa [24], termasuk kafein, pemanis,
dan diuretik. , serta ÿ-blocker dan metabolitnya [25]. BUMN adalah
fenomena yang juga dieksploitasi dalam prosedur QuEChERS
(cepat, mudah, murah, kasar, dan aman), yang berhasil diterapkan
pada banyak analit dan matriks, termasuk kelas zat doping
tertentu dalam makanan dan DS [ 26–28]. Ketika berhadapan
dengan berbagai jenis DS, termasuk suplemen berbahan dasar
gel lunak, prosedur penghilangan matriks yang kompleks mungkin
diperlukan, menggunakan strategi seperti mikroekstraksi cair-cair
dispersif atau ekstraksi fase padat dispersif lipid penghilangan
matriks yang ditingkatkan [29]. Namun, terlepas dari komposisi
sampel, efek matriks harus diperiksa bersama dengan kinerja
metode lainnya, terutama jika metode yang lebih sederhana dan
ramah lingkungan dikembangkan.
Mengenai analisis instrumental, secara historis, strategi analitik
yang paling banyak digunakan dalam pengendalian doping
bergantung pada kromatografi gas ditambah dengan metode
spektrometri massa (GC – MS). Saat ini, kecuali untuk beberapa
senyawa yang ditentukan melalui prosedur imunologi, sebagian
besar analit dievaluasi dengan GC atau kromatografi cair (LC)
yang digabungkan dengan teknik MS tandem atau teknik MS resolusi tinggi
online,
Di antara strategi LC, baik LC fase terbalik (RPLC) [9, 30] dan
kromatografi cair interaksi hidrofilik (HILIC) [31, 32] diterapkan
dalam kontrol anti-doping rutin. Sebuah studi baru-baru ini
membandingkan dua pendekatan untuk analisis obat-obatan
olahraga, mengevaluasi kinerjanya
Baglietto M. dkk.
fase diam yang berbeda untuk berbagai senyawa, dan menyoroti
sifat saling melengkapi dari teknik pemisahan ini [33]. Ketika analit
dicirikan oleh polaritas tinggi dan adanya gugus yang dapat
terionisasi, strategi pemisahan yang ideal adalah kromatografi
HILIC, yang diperkenalkan oleh Alpert pada tahun 1990 [34].
Pemisahan kromatografi, khususnya dalam mode HILIC,
bergantung pada banyak variabel eksperimental, baik yang
terkait dengan karakteristik kolom atau kondisi operasional, yang
perlu dikontrol dan dioptimalkan [35]. Dengan demikian,
pendekatan multivariat melalui desain eksperimen (DoE) sangat
disarankan [35, 36]. DoE dan alat kemometri lainnya telah
digunakan dalam studi HILIC, seperti yang baru-baru ini ditinjau
oleh Taraji et al. [37]. Dalam HILIC, parameter utama yang
mempengaruhi retensi suatu senyawa adalah jenis dan persentase
pelarut organik, kandungan garam, pH, dan suhu kolom, yang
pengaruhnya sangat terkait dengan fase diam spesifik yang
digunakan [37, 38].
Dalam penelitian ini, optimasi multivariat dilakukan untuk
pemisahan HILIC dari 12 senyawa polar dan ekstraksi SALLE
dari DS. Zat yang dilarang oleh daftar WADA antara lain diuretik
yang lebih sering terdeteksi (hidroklorotiazid dan furosemid),
stimulan (kokain), dan agonis ÿ2 (salbutamol dan clenbuterol)
[39], serta bahan legal seperti pemanis buatan dan metilxantin,
demikian dipelajari. Yang terakhir ini tidak dianggap sebagai
dopan bagi manusia, tetapi semuanya termasuk dalam daftar
larangan kuda dari Fédération Équestre International [40]. Selain
itu, tidak semua kompetisi berada di bawah kendali WADA, dan
beberapa di antaranya tunduk pada peraturan yang lebih ketat
(misalnya, NCAA [41]). Sebenarnya, kafein dianggap sebagai zat
terlarang oleh WADA antara tahun 1984 dan 2004, ketika kafein
dimasukkan ke dalam program pemantauan [42]. Mengukur
metilxantin dalam DS juga penting untuk menghindari risiko
kesehatan. Memang benar DS yang mengandung kafein banyak
dikonsumsi setiap hari, terkadang mengabaikan asupan harian
maksimal 400 mg (dengan maksimal 200 mg per dosis tunggal)
yang direkomendasikan oleh pihak berwenang. Jadi, ada baiknya
mengukur jumlahnya terkait dengan dosis DS yang disarankan,
untuk memantau bahwa dosis tersebut tidak melebihi batas
keamanan [6, 43].
Sepengetahuan penulis, ini adalah aplikasi pertama SALLE
untuk mengekstraksi bahan-bahan khas dan senyawa doping dari
DS. Analit yang ditargetkan menunjukkan sifat fisiko-kimia yang
berbeda, sehingga memerlukan metode kelas jamak yang
dioptimalkan. Setelah evaluasi kinerja metode, metode ini
digunakan untuk memproses beberapa DS yang dibeli secara
[15].
sehingga memungkinkan untuk mendeteksi dan mengukur
beberapa analit target. Selain itu, serangkaian pemindaian MS/
MS dilakukan untuk secara tentatif mengidentifikasi senyawa
yang secara struktural mirip dengan agonis ÿ2 clenbuterol, yang
kurang tersebar dan diketahui tetapi juga dilarang oleh WADA [1,
16, 17].
Machine Translated by Google
Bahan-bahan yang sah dan terlarang dalam suplemen makanan: optimalisasi kemometri…
Bahan dan metode
Bahan kimia dan reagen
Semua pelarut dan aditif yang digunakan adalah kelas HPLC atau LC-MS.
Asetonitril (ACN) dan metanol (MeOH) dibeli dari VWR (Fontenay-
sous-Bois, Perancis), sedangkan air ultra murni diperoleh di
laboratorium menggunakan sistem Milli-Q Millipore (Wat-ford,
UK). Asam asetat (AA), asam format (FA), dan garam amoniumnya
(ANH4 dan FNH4), yang dievaluasi sebagai aditif kromatografi,
juga dipasok oleh VWR. Tri-etilamina (TEA) yang diuji sebagai
pelarut hidrofilisitas yang dapat dialihkan dibeli dari Acros
Organics (Geel, Belgia). Garam yang digunakan untuk SALLE
adalah natrium klorida (kemurnianÿ99%) dari Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, USA) dan magnesium sulfat (99%) dari Carlo Erba
Reagenti (Rodano, MI, Italia).
NaOH dari Fluka Analytical (Saint Gallen, Swiss) digunakan
bersama dengan AA sebagai pengubah pH di SHS-HLLE dan
SALLE.
Standar analitik (semua kemurnian di atas 98%) dibeli dari
pemasok yang berbeda: acesulfame (ACS), paraxanthine (PRX),
theobromine (TBR), theophylline (TFL), sucralose (SCL),
hydrochlorothiazide (HCTZ), furosemide (FRSM) , kokain (COCA),
clenbuterol (CLBT), dan asam asetilsalisilat (ASA) dari Sigma-
Aldrich; kafein (CAFF) dari Fluka Analytical; salbuta-mol (SLBT)
dari Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA). Struktur molekul analit target
ini ditunjukkan pada Gambar. 1. Larutan stok standar tunggal
disiapkan pada konsentrasi berkisar antara 109 hingga 2720 mg
Gambar 1 Struktur molekul analit target
Lÿ1 dalam MeOH atau MeOH:mQ air (1:1 v/v), dan disimpan pada
suhu ÿ18 °C (kecuali TBR dan TFL pada suhu 4 °C dan PRX pada
suhu kamar). Campuran larutan standar pada 2 mg Lÿ1 diperoleh
dengan mengencerkan larutan tunggal dan digunakan untuk
menyiapkan larutan kerja sehari-hari dengan pengenceran lebih lanjut.
Desain eksperimen
Pendekatan multivariat DoE digunakan untuk mempelajari
pemisahan kromatografi dan pra-perlakuan sampel. Sebagai
langkah pertama, enam variabel kromatografi dipertimbangkan:
persentase fase air dalam eluen (A%: 0–10%), konsentrasi garam
(0,2–10 mM), persentase asam (0,01–0,1%) dan jenis bufer (format
atau asetat) dalam fase gerak, suhu kolom (25–50 °C), dan laju
aliran (0,1–0,3 mL minÿ1). Dengan demikian, desain penyaringan
diterapkan untuk menyelidiki mana yang lebih relevan dalam
mempengaruhi pemisahan, dengan mempertimbangkan retensi
analit yang dipilih, area puncaknya, dan resolusi kromatografi
sebagai respons. Resolusi kromatografi (R) antara puncak zat “a”
dan “b” dihitung sebagai berikut:
|RTa ÿ RTb|
Rab = 2 ÿ (1)
( Wa + Wb )
dimana RTa dan RTb adalah waktu retensi kedua puncak
sedangkan Wa dan Wb adalah lebarnya.
Desain penyaringan yang dipilih adalah Plackett-Burman [44]:
8 percobaan dilakukan, memungkinkan penentuan 7 koefisien
model linier (satu untuk setiap
Machine Translated by Google
faktor dan intersep). Nilai-nilai yang dikodekan dan rencana
percobaan dirangkum dalam Tabel S.1 (Informasi tambahan).
Eksperimen dilakukan secara acak untuk menghindari
penyimpangan sistematis yang mempengaruhi hasil.
Hasilnya dielaborasi dengan menggunakan perangkat lunak
gratis Chemometric Agile Tool (CAT) [45]. Melalui perhitungan
model, signifikansi koefisien variabel dinilai. Perangkat lunak
CAT juga digunakan untuk mengimplementasikan algoritma D-
optimal, untuk memilih eksperimen yang akan dilakukan untuk
desain permukaan respons dengan mempertimbangkan variabel
yang dipilih melalui penyaringan DoE. Berdasarkan pengetahuan
yang diperoleh, hanya 4 variabel yang diselidiki pada 3 tingkat
(lihat Tabel S.2): persentase fase air (A%: 0–10%) dan
konsentrasi garam (0,2–10 mM) dari fase gerak, suhu kolom
(20–45 °C), dan laju aliran (0,1–0,2 mL minÿ1). Di antara
kumpulan semua eksperimen yang mungkin, algoritma D-
optimal memberikan indikasi eksperimen terbaik untuk dilakukan
[46, 47]. Dengan demikian, 26 percobaan yang dilaporkan pada
Tabel S.2 dipilih dan dilakukan.
Setelah metode instrumental ditetapkan, strategi perlakuan
sampel mewakili langkah selanjutnya yang harus dioptimalkan.
Untuk memaksimalkan efisiensi SALLE, lima variabel
eksperimental dipilih berdasarkan pengetahuan sebelumnya
[24, 25]: rasio H2O:ACN, jumlah NaCl dan MgSO4 yang
digunakan untuk menginduksi SOE, pH, dan waktu sentrifugasi.
Dengan demikian, kompleksitas masalah sekali lagi menunjukkan
DoE yang D-optimal. Tingkat kode dan nilai riil masing-masing
variabel dilaporkan pada Tabel S.3.
Melalui algoritma D-optimal, satu set 31 percobaan dipilih, dan
5 di antaranya direplikasi seperti yang disarankan oleh algoritma
“D-optimal by-Addition” [46], seperti dilaporkan pada Tabel S.3.
Eksperimen ini dilakukan dengan mengatur volume fase air
menjadi 1,2 mL dan menggunakan NaOH atau AA sebagai
pengubah pH.
Analisis instrumental
HPLC seri 1200 yang digabungkan dengan spektrometer massa
triple quadrupole 6430 oleh Agilent Technologies (Santa Clara,
CA, USA) digunakan untuk mencapai pemisahan kromatografi
dan deteksi analit. Kromatografi dilengkapi dengan pompa biner,
degasser vakum online, sampler cairan otomatis, dan
kompartemen kolom termostat. Pemisahan dicapai pada kolom
YMC-Triart Diol-HILIC (100×2,1 mm; 3 ÿm) oleh YMC Co.
(Kyoto, Jepang).
Ionisasi elektrospray (ESI) dalam mode peralihan polaritas
digunakan sebagai sumber ion untuk sistem MS. Nilai-nilai
berikut ditetapkan untuk sumber ESI: gas pengering (N2) yang
diatur masing-masing pada suhu dan aliran 300 °C dan 11 L
minÿ1 , tekanan nebulizer 15 psi, dan tegangan kapiler 4000 V.
Pemantauan reaksi berganda (MRM ) mode digunakan selama
optimasi pemisahan kromatografi dan
Baglietto M. dkk.
analisis yang ditargetkan. Untuk sebagian besar analit, parameter
yang telah dioptimalkan sebelumnya digunakan [48, 49].
Deteksi massal dan perilaku fragmentasi COCA, CLBT, HCTZ,
dan FRSM dipelajari dengan menggunakan perangkat lunak
Mass Hunter Optimizer (versi B.04.01). Untuk tujuan ini, 10 ÿL
larutan standar tunggal, pada konsentrasi 500 ÿg Lÿ1 dalam
ACN:H2O (85:15, v/v), berulang kali disuntikkan ke dalam
sistem MS untuk menemukan prekursor dan ion produk. , dan
untuk memilih tegangan fragmentor dan energi tumbukan (CE)
yang memungkinkan sensitivitas lebih baik untuk setiap transisi
MRM yang teridentifikasi. Data yang berkaitan dengan transisi
MRM untuk setiap analit dirangkum dalam Tabel S.4 (bersama
dengan sifat fisiko-kimianya): transisi paling intens dari setiap
senyawa digunakan sebagai kuanfer, sedangkan rasio antara
luas puncak qualifer (transisi MRM karakteristik lainnya) dan
quantifer digunakan (bila tersedia) untuk mengkonfirmasi
identitas senyawa. Perangkat lunak stasiun kerja Agilent
MassHunter (versi B.04.01) digunakan untuk akuisisi data dan
analisis kualitatif dan kuantitatif.
Selanjutnya, dengan tujuan untuk menyaring analog CLBT
pada DS yang mencurigakan, dilakukan pemindaian ion
prekursor (PcIS) dan pemindaian ion produk (PdIS). Untuk
meningkatkan sensitivitas, analisis MRM lebih lanjut dilakukan,
memantau transisi yang paling menarik. Kondisi instrumental
dari pemindaian ini dirangkum dalam Tabel S.5.
Setelah optimalisasi kemometri pada kondisi awal, gradien
elusi berikut digunakan untuk pemisahan kromatografi: eluen
A adalah air ultra murni dengan 0,01% FA dan 0,2 mM FNH4,
sedangkan eluen B adalah ACN:H2O 95:5 dengan jumlah
pengubah yang sama sedangkan suhu kolom diatur pada 25
°C; gabungan eluen dan gradien aliran yang dilaporkan pada
Tabel 1 digunakan untuk menjaga resolusi yang baik dalam
jangka waktu yang wajar yaitu 25 menit, termasuk pemulihan
kondisi awal. Kromatogram eksperimental dengan standar rapi
dilaporkan pada Gambar S.1.
Sampel suplemen makanan
Delapan suplemen makanan berbeda dibeli di Internet dari
pemasok khusus. Tak satu pun dari mereka melaporkan
senyawa terlarang pada labelnya; di antara bahan-bahan yang
dinyatakan adalah pemanis, kafein, dan metilxantin lainnya.
Lima di antaranya dalam bentuk “kapsul” (yaitu C1, C2, C3,
C4, C5), dan seharusnya diberikan dengan menelan kapsulnya.
Tiga DS sisanya berbentuk bubuk (disebut P1, P2, dan P3),
yang seharusnya dilarutkan dalam air dan diminum. Tiga
suplemen pertama digunakan untuk menyiapkan kumpulan
sampel dengan bobot yang sama, menghilangkan lapisan luar
dan mencampur bubuk internal. Kumpulan ini disimpan pada
suhu kamar, begitu juga dengan sampelnya, dan digunakan
untuk mengevaluasi kinerja metode, memproses alikuot yang
dibubuhi dan tidak.
Machine Translated by Google

Bahan-bahan yang sah dan terlarang dalam suplemen makanan: optimalisasi kemometri…

Tabel 1 Gradien metode

%A %B t (menit) Aliran (mL Waktu retensi (menit)
yang dioptimalkan dan waktu retensi
mntÿ1)
dari 12 analit target
0 100 0 0,1 Analis RT Analis RT

0 100 5.5 0,1 ACS 1,99 SCL 4.52

0 100 7 0,3 FRSM 3.08 TBR 4.56
0 100 10 0,3 SEBAGAI 3.15 PRX 4.62
36.8 63.2 12 0,23 HCTZ 3.36 COCA 17.8
0 100 14 0,23 CAFF 4.00 CLBT 19.0
0 100 15 0,1 TFL 4.39 SLBT 20.0

Strategi pemrosesan sampel
Aliquot sekitar 120 mg sampel ditimbang dalam elang dan
ditambahkan dengan 1,2 mL air mili-Q tanpa pengubah pH yang
dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 40 °C. Kemudian divorteks
(menggunakan pusaran VM3 dari CAT—Staufen, Jerman) selama
1 menit pada 2000 rpm, sebelum ditambahkan 1,2 mL ACN dan
divorteks lebih lanjut selama 1 menit pada 2000 rpm. Setelah itu,
elang disentrifugasi selama 6 menit pada 3500 rpm (menggunakan
sentrifugal ALC 4206 dari Aiken Corporation – Aiken, SC, USA),
dan surnatan dipindahkan ke elang lain yang mengandung 264 mg
NaCl dan 1008 mg MgSO4 ( untuk memiliki konsentrasi keseluruhan
masing-masing 110 dan 420 mg mLÿ1). Hal ini menyebabkan
pemisahan fasa karena adanya BUMN. Setelah sentrifugasi lebih
lanjut selama 9 menit pada 3500 rpm, surnatan (fase organik)
matriksnya masing-masing melonjak, sedangkan CLOD/ LOQ dan
CMS adalah konsentrasi yang sesuai. Jika tidak, mereka juga
dievaluasi menggunakan persamaan:
S
CLODÿLOQ = n B (3)
dimana s mewakili deviasi standar area blanko matriks dan b adalah
koefisien sudut kurva kalibrasi [50]. Seperti yang sangat disarankan,
nilai yang paling konservatif dipertimbangkan [50].
Spesifisitas dinilai dengan memverifikasi waktu retensi sinyal
MRM dan, jika memungkinkan, dengan menghitung rasio antara
transisi kualifer dan kuantifer masing-masing senyawa, memantau
bahwa mereka mempertahankan deviasi dalam ±30% dari standar
referensi yang direkomendasikan. diperbaiki oleh beberapa

ditarik, disaring pada flter hidrofilik-PoliTetraFluoroEthylene 0,22 ÿm pedoman [51].

(Thermo Scientifc—San Jose, CA, USA), dan kemudian disimpan
beku diÿ 18 °C sampai analisis. Pengenceran yang tepat dilakukan
sebelum analisis LC-MS/MS, tergantung pada sampelnya.
Evaluasi kinerja metode
Kinerja instrumental dari metode yang dioptimalkan dievaluasi
dalam hal rentang dinamis linier, batas deteksi dan kuantifikasi
dalam matriks, spesifisitas, dan presisi intra-hari dan antar-hari,
sedangkan protokol pemrosesan sampel dievaluasi dalam hal
pemulihan, pengulangan, dan efek matriks.
Kurva kalibrasi dibuat dengan menganalisis matriks kosong yang
diencerkan dalam H2O:ACN, 5:95 (v/v) dan dibubuhi konsentrasi
analit yang berkisar antara 0,05 hingga 50 ÿg Lÿ1, untuk menyelidiki
rentang linearitas. Dalam matriks, batas deteksi (LOD) dan
kuantifikasi (LOQ) dinilai dengan dua cara dengan mempertimbangkan analit secara kuantitatif (SA), dan alikuot yang dibubuhi sebelum
pengenceran sampel. Pertama, gunakan proporsi berikut: pemrosesan (SB) .
N
ÿ SBK ÿ CLODÿLOQ = SMS ÿ CMS
dimana n adalah 3 untuk LOD dan 10 untuk LOQ, SBK dan SMS
adalah sinyal rata-rata (area puncak) dari matriks kosong dan dari
Presisi instrumen intra-hari dan antar-hari dinilai pada dua tingkat
konsentrasi, 0,5 dan 20 ÿg Lÿ1 (kecuali untuk COCA, pada 0,05 dan
2 ÿg Lÿ1), dipilih untuk memberikan nilai rendah dan tinggi dengan
sensitivitas yang cukup untuk sebagian besar analit serta tetap
berada dalam kisaran linearitas. Deviasi standar relatif (RSD%) dari
area puncak enam ulangan per level dan selama tiga hari tidak
berturut-turut dihitung.
Pengulangan perlakuan sampel (presisi prosedural) dinilai
sebagai RSD% pemulihan analit. Mereka dihitung dengan
memproses enam ulangan matriks berduri (sampel nyata yang tidak
menunjukkan sinyal dari senyawa apa pun yang diteliti [19]) dan
menganalisis alikuot yang diencerkan dengan benar.
Bersamaan dengan itu, alikuot “tidak berduri” diproses, untuk
mengevaluasi kemungkinan kontribusi analit yang ada dalam
matriks. Tiga jenis sampel kemudian dianalisis: alikuot encer yang
tidak dibubuhi (NS), alikuot yang sama, yang dibubuhi setelah
pemrosesan dengan jumlah yang sesuai dengan perolehan kembali
Dengan cara ini, perolehan kembali analit dapat dievaluasi
sebagai berikut [52]:
(2)
SSB - SNS
R(%) = ÿ 100% (4)
SSA- SNS _
Machine Translated by Google

Baglietto M. dkk.

dimana SSB, SSA, dan SNS merupakan sinyal analitik (area
puncak) dari ketiga jenis sampel yang dianalisis.
Setelah itu, efek matriks (ME) dinilai melalui perbandingan
(rasio) kemiringan kurva kalibrasi yang dibangun dengan
menganalisis dua rangkaian standar, dalam matriks dan dalam
pelarut murni [53].
Akhirnya, kehijauan metodologi akhir dinilai dengan
menggunakan perangkat lunak Analytical Greenness (AGREE)
[54], dan dibandingkan dengan penelitian lain mengenai DS dengan
setidaknya satu analit yang sama dengan penelitian ini.
Kedua, desain permukaan respons D-optimal diterapkan untuk
memahami secara mendalam pengaruh variabel yang dipilih dan
kemungkinan pengaruhnya (bagian “Desain D-optimal—memahami
mekanismenya”). Selama langkah-langkah ini, hanya elusi isokratik
yang dipertimbangkan, yang bertujuan untuk menjaga kinerja
eksperimen dan interpretasi hasil sesederhana mungkin. Akhirnya,
kondisi awal yang dioptimalkan ini digunakan, memanfaatkan
informasi yang diperoleh sebelumnya, ketika mengembangkan
pemisahan gradien akhir.
Desain Plackett – Burman—penyaringan variabel
eksperimental

hasil dan Diskusi

Pengembangan metode HILIC
Pemisahan kromatografi melibatkan sejumlah besar variabel
eksperimental, yang pengaruhnya bergantung pada senyawa
terpilih yang harus dipisahkan dan pendekatan instrumental [35].
Dampak-dampak ini seringkali saling terkait dan tidak ada “aturan
praktis” yang berlaku secara universal. Dengan demikian,
penyelidikan terhadap variabel-variabel ini sekali pada suatu waktu
tidak akan memungkinkan pemahaman yang mendalam tentang
mekanisme retensi, selain kesulitan dalam mencapai “optimal”
yang sebenarnya, yang dapat ditemukan dengan lebih mudah dan
rasional dengan pendekatan multivariat [47] .
Seperti teknik kromatografi lainnya, pemisahan HILIC
bergantung pada beberapa variabel [37, 38, 55], yang efeknya
bersifat spesifik analit dan bergantung pada kolom [37, 38].
Dalam studi ini, pemisahan analit terpilih dievaluasi pada kolom
diolik, yang mengandung fase diam dengan sifat ikatan hidrogen
yang tinggi dan sifat ikatan elektrostatik yang rendah, karena tidak
mengandung gugus yang dapat terionisasi selain sisa silanol yang
tidak bereaksi [ 56].
Pertama, desain penyaringan Plackett–Burman ditetapkan,
untuk menyoroti variabel-variabel utama yang mempengaruhi (lihat
“desain Plackett–Bur-man—penyaringan variabel eksperimental”).
Banyak respons telah dimodelkan untuk meminimalkan waktu
analisis (12 waktu retensi, RT), memaksimalkan sensitivitas (12
area puncak), dan resolusi kromatografi yang menguraikan data
yang diperoleh dengan melakukan PB-DoE. Dengan melakukan
analisis komponen utama (PCA) pada matriks data yang diperoleh,
lebih dari 80% varians dijelaskan oleh 3 PC pertama. Korelasi
variabel berubah seiring dengan disorotnya perilaku retensi analit,
karena tingginya fraksi varians yang dijelaskan. Dengan memberi
label eksperimen yang diproyeksikan di ruang PC bergantung pada
level kode dari variabel eksperimen, eksperimen tersebut dapat
dipisahkan secara visual, bila variabel yang dipilih menghasilkan
hasil yang signifikan (lihat Gambar S.2).
Informasi yang berguna dapat diekstrapolasi dengan model
yang dihitung. Tabel 2 menunjukkan signifikansi dan tanda koefisien
dari 12 model waktu retensi, sedangkan Tabel S.6 melaporkan
informasi mengenai model area puncak.
Di antara variabel-variabel yang diteliti,% asam seringkali tidak
signifikan dalam menentukan retensi analit, meskipun variabel
tersebut memberikan sensitivitas yang lebih baik untuk beberapa
variabel tersebut (Tabel S.6); jenis bufer tidak signifikan pada
separuh model retensi, namun jika signifikan, hal ini menimbulkan
efek yang berbeda. Selain itu, buffer asetat memungkinkan
sensitivitas yang lebih tinggi untuk sebagian besar senyawa pengion negatif (yaitu

Tabel 2 Signifikansi dan tanda A% %Asam T

Analis [Garam] Mengalir penyangga
koefisien masing-masing
variabel dalam menentukan ACS **<0 ***>0 ***<0 ***>0 ***<0 ***<0
waktu retensi masing-masing analit. HCTZ ***<0 **>0 NS NS ***<0 NS
Satu, dua, atau tiga tanda bintang
FRSM ***<0 ***>0 NS *>0 ***<0 ***>0
untuk nilai p <0,05,<0,01,<0,001,
masing-masing; NS tidak signifikan CAFF ***<0 ***<0 NS NS ***<0 NS
TBR ***<0 NS NS **<0 ***<0 NS
PRX ***<0 NS NS NS ***<0 NS
TFL ***<0 NS NS NS ***<0 NS
SCL ***<0 ***>0 *<0 ***<0 ***<0 ***>0
SEBAGAI ***<0 ***>0 NS ***>0 ***<0 ***>0
COCA ***<0 ***<0 **<0 ***<0 ***<0 ***<0
CLBT ***<0 ***<0 NS ***<0 ***<0 *<0
SLBT ***<0 **<0 NS **<0 ***<0 NS
Machine Translated by Google

Bahan-bahan yang sah dan terlarang dalam suplemen makanan: optimalisasi kemometri…

semakin kurang sensitif), seperti yang disimpulkan pada Tabel S.6. Gambar 2 mewakili determinan logaritmik yang dinormalisasi dari
Variabel yang tersisa menunjukkan efek heterogen dalam menentukan matriks informasi subset eksperimen versus jumlah eksperimen setiap
retensi (dan resolusi) analit. Konsentrasi garam memberikan efek yang subset [46]. Log(normD) harus dimaksimalkan, dan dalam kasus ini,
paling berbeda pada analit yang dipilih. Di sisi lain, sebagian besar 26 percobaan (Tabel S.2) mewakili kompromi yang baik, karena nilai
koefisien suhu yang signifikan adalah negatif, sementara beberapa ini ditempatkan di awal dataran tinggi dalam grafik log(normD). Selain
laju menunjukkan pengaruh yang kuat dan negatif terhadap retensi. itu, faktor inflasi varians, yang merupakan indikasi “kebaikan” desain
dalam hal kovarians minimal di antara koefisien yang akan dihitung,
Mengenai sensitivitas, aspek ESI yang terkenal telah dikonfirmasi: memuaskan (<2) untuk semua koefisien model.
baik A% dan fow menunjukkan efek negatif pada area puncak [57].
Ketika signifikan, dan dengan pengecualian ACS dan SCL, suhu dan
konsentrasi garam juga memberikan efek negatif [58]. Memang Karena kompleksitas kumpulan data, hasil RT dan resolusi
benar, karena SCL dipantau sebagai hasil aduk asetat atau format, dievaluasi melalui dua PCA terpisah.
peningkatan konsentrasi garam dalam fase gerak meningkatkan Hasil RT-PCA ditunjukkan pada Gambar 3, yang melaporkan plot
kemungkinan menghasilkan hasil tambahan dalam sumber ion. pemuatan dan skor. Dua PC pertama menjelaskan varians yang tinggi
dari data asli (89,4%): meskipun pemuatan pada PC1 selalu positif
Meskipun demikian, konsentrasi garam sangat penting dalam dan ditandai dengan distribusi yang terbatas, analit didistribusikan
menentukan resolusi, sehingga tetap berada dalam kisaran yang secara luas di sepanjang PC2. Dengan melihat plot skor, di mana
dipertimbangkan dalam desain berikut. eksperimen direpresentasikan, PC1 dikorelasikan dengan laju aliran
Semua pertimbangan ini hanya valid dalam domain eksperimen, (seperti yang disimpulkan dari label numerik dalam plot skor).
dan model matematika linier memerlukan validasi melalui kinerja Sebaliknya, nilai PC2 sangat terkait dengan konsentrasi garam, yang
eksperimen titik pusat. Hanya sedikit dari model-model ini yang ditunjukkan oleh skala warna pada Gambar 3. Oleh karena itu, hasil
divalidasi, menyoroti adanya interaksi signifikan dan istilah kuadrat, PCA dengan jelas menunjukkan variabel mana yang penting untuk
dan dengan demikian menyarankan penyelidikan lebih dalam terhadap pemisahan, sebagaimana telah disimpulkan dalam desain penyaringan.
variabel-variabel yang dipertimbangkan. Secara khusus, senyawa secara visual dapat dibagi menjadi 3
kelompok, berdasarkan pengaruh konsentrasi garam terhadap RT-
nya: pada konsentrasi garam yang lebih tinggi, ASA, FRSM, ACS, dan
Desain Dÿoptimal—memahami mekanismenya SCL lebih tertahan, sedangkan SLBT, CLBT, dan COCA lebih banyak
terelusi. dengan cepat dan senyawa lainnya tidak terlalu terpengaruh.
Perlu diperhatikan bahwa kondisi percobaan nomor 8 PB-DoE telah
memungkinkan pemisahan yang memuaskan. Informasi lebih menarik dapat diperoleh dengan melihat PCA
Namun, studi multivariat lebih lanjut dilakukan untuk mendapatkan mengenai resolusi gabungan: sekali lagi, yang terbanyak
pengetahuan yang lebih baik tentang mekanisme retensi, juga
mengevaluasi istilah kuadrat dan interaksi. Secara khusus, pengetahuan
yang diperoleh PB berguna untuk mempersempit domain eksperimen
dengan menghilangkan variabel-variabel yang tidak signifikan dan
dengan menyesuaikan rentang variabel lainnya. Faktanya, % asam
dan jenis bufer telah diubah (masing-masing menjadi 0,1% dan bufer
asetat, karena pertimbangan sensitivitas yang telah dilakukan
sebelumnya), juga karena menjaga bufer yang sama dalam sistem
kromatografi mempercepat waktu kesetimbangan, seringkali sangat
membosankan. di HILIC [58]. Empat variabel sisanya dipertahankan,
namun beberapa rentang disesuaikan: rentang suhu diturunkan
menjadi 20–45 °C (juga untuk memperpanjang masa pakai kolom),
sedangkan laju aliran dibatasi hingga 0,1–0,2 mL minÿ1, karena efek
yang kuat dan negatif dapat membuat efek yang lain kewalahan
(seperti yang terjadi pada A%). Memang benar, rentang konsentrasi
A% dan garam dipertahankan seperti sebelumnya.
Algoritma D-optimal digunakan untuk memilih sub-set eksperimen
terbaik di antara 34=81 kemungkinan kombinasi variabel eksperimen
[46]. Dengan menerapkan algoritma ini, dimungkinkan untuk memilih
istilah mana yang diperlukan dalam permukaan respons dan
Gambar 2 Tren log (Determinan yang dinormalisasi) berdasarkan jumlah
konsekuensinya adalah kompromi terbaik antara informasi yang eksperimen dalam himpunan bagian yang dipertimbangkan. Disorot dengan
dibutuhkan dan upaya eksperimental. lingkaran biru, titik yang dipilih (bagian yang mencakup 26 percobaan)
Machine Translated by Google
Gambar 3 Loading dan score plot terkait PCA dilakukan pada data waktu retensi. Labelÿ1, 0, dan+1 pada plot skor sesuai dengan tingkat kode
berikut, sedangkan skala warna (legenda di sisi kanan) mengacu pada tingkat kode konsentrasi garam
Variabel yang signifikan adalah konsentrasi garam. Faktanya,
sebagian besar tanggapan didistribusikan pada semacam busur
keliling yang mengikuti panah emas pada Gambar 4A. Mengingat
korelasi respons dan pengelompokannya dalam plot pemuatan,
hanya beberapa model respons tunggal yang dihitung, yaitu
model yang dianggap mewakili “klaster” yang teridentifikasi. Di
bagian ekor panah emas yang disebutkan di atas, model serupa
dengan yang dilaporkan pada Gambar. 5A (“grup A” termasuk
sebagian besar resolusi yang melibatkan COCA atau ACS), tetapi
seiring dengan itu, koefisien konsentrasi garam meningkat secara
bertahap hingga model menjadi Gambar 5B seperti pada bagian
depannya (“grup B,” sebagian besar resolusi SCL atau ASA
dengan senyawa lain). Beranjak dari lingkaran ini, terdapat
resolusi antara dimetilxantin dan HCTZ bersama mereka (“grup
C”). Yang berubah dalam model ini adalah koefisien A%, yang
secara bertahap meningkat dari nilai yang sangat negatif dalam
tanda panah ke nilai positif yang jauh darinya. Memang benar, plot
skor (Gambar 4B) menunjukkan bahwa eksperimen yang terletak
di sisi kanan kuadran terutama ditandai dengan A%. Ini berarti
bahwa dalam percobaan ini, nilai-nilai yang tinggi untuk variabel-
variabel yang ditempatkan di sepanjang “panah emas” diamati,
yaitu resolusi yang lebih tinggi pada A%. Model terjauh dari panah
dicirikan oleh plot koefisien seperti yang ditunjukkan pada Gambar.
5C, di mana koefisien untuk A% adalah positif. Atribusi lengkap
terhadap kelompok yang ditentukan dapat ditemukan di Informasi
tambahan (Tabel S.7).
Informasi ini berguna untuk memahami fenomena dan
mengoptimalkannya; tujuannya, seperti pada kebanyakan kromatografi menunjukkan pencapaian resolusi yang lebih tinggi
Baglietto M. dkk.
aplikasi, secara kontekstual memaksimalkan resolusi dan
meminimalkan waktu analisis (diwakili oleh RTSLBT, analit yang
paling banyak ditahan), dengan mengerjakan variabel yang paling
mempengaruhi, yaitu konsentrasi garam dan A%. Karena efek
yang diamati berbeda, kondisi optimal pun agak berbeda
tergantung pada “kelompok” di mana respons tersebut berasal.
Misalnya, meningkatkan persentase eluen A akan ideal untuk
resolusi grup C dan RTSLBT, namun sebagian besar resolusi
lainnya lebih tinggi pada levelÿ1 A%, yang berarti waktu analisis
lebih lama. Untuk menjaga resolusi kelompok C yang memuaskan,
konsentrasi garam ditetapkan pada tingkat ÿ1. Hal ini juga bagus
untuk resolusi grup A, namun tidak ideal untuk resolusi grup B.
Untungnya, sebagian besar nilai resolusi pada grup B memuaskan.
Perlu dicatat bahwa hanya dua tanggapan yang sangat penting
namun berbeda: RTSLBT dan RTFL-PRX, yang menunjukkan
perilaku berbeda sehubungan dengan variabel yang diteliti. Yang
pertama sangat penting karena mewakili waktu analisis, karena
SLBT merupakan senyawa terakhir yang dielusi dalam setiap
kondisi pengujian; sementara RTFL-PRX
(yang koefisien plot modelnya dilaporkan pada Gambar S.3)
sangat penting karena ketidakmungkinan membedakan PRX dari
TFL dengan menggunakan deteksi MS/MS [59], sehingga perlu
untuk memisahkannya secara kromatografi. Faktor suhu dan aliran
memberikan efek yang berbeda pada dua respons ini: Gambar 6
melaporkan kurva respons iso yang tumpang tindih untuk RTSLBT
dan RTFL-PRX, pada nilai konsentrasi garam dan A% tetap, yang
Machine Translated by Google

Bahan-bahan yang sah dan terlarang dalam suplemen makanan: optimalisasi kemometri…

Gambar 4 Biplot (A) dan score plot (B) terkait PCA yang dilakukan pada data resolusi. Bergerak sepanjang panah emas, koefisien konsentrasi garam dari
model yang dihitung secara bertahap meningkat. Label dan skala warna plot skor dilaporkan

Gambar 5 Contoh plot koefisien resolusi kromatografi. Model yang mirip dengan ASA-CLBT (A), CAFF-SCL (B), dan HCTZ-CAFF (C) masing-masing
ditemukan di dekat ekor, di samping kepala, atau jauh dari panah.

antara PRX dan TFL secara otomatis menyiratkan waktu
analisis yang lebih lama.
Pertimbangan akhir untuk metode kromatografi pasti
Kondisi awal yang tampaknya lebih baik untuk pemisahan
kromatografi lengkap dari 12 analit target (0% eluen A dengan
0,2 mM format pada laju aliran 0,1 mL minÿ1
dan suhu kolom 25 °C) memerlukan elusi isokratik yang agak
lama (RTSLBT>60 menit). Dengan demikian, pengembangan
elusi gradien diuji, juga karena perlunya kolom “pencucian”
selama analisis sampel nyata. Secara khusus, metode yang
melibatkan pelarut dan gradien aliran diterapkan, untuk
mencoba mempercepat analisis, tanpa mengurangi resolusi
kromatografi antara TFL dan PRX.
Pada bagian “Desain Plackett – Burman—penyaringan
variabel eksperimen”, dengan jelas dinyatakan bahwa asetat
Machine Translated by Google
Gambar 6 Plot kontur yang tumpang tindih dari pengaruh aliran dan suhu pada
RT SLBT (berwarna biru) dan resolusi TFL-PRX (berwarna merah) yang
diperoleh dengan memfxing tingkat A% dan konsentrasi garam (keduanya padaÿ1)
bufer dipilih untuk DoE berikut karena menjamin sensitivitas yang lebih
baik untuk senyawa pengion negatif. Namun demikian, ketika
menerapkan kombinasi aliran dan gradien pelarut, terjadi penekanan
sinyal SLBT secara ekstensif (area puncak lebih dari 100 kali lipat
lebih rendah daripada yang diamati dalam kondisi isokratik). Hal ini
sebagian diperkirakan dan dijelaskan oleh koefisien persentase dan
fluks air dalam menentukan luas puncak SLBT (Tabel S.6). Meskipun
demikian, dengan menerapkan kondisi awal dan gradien yang sama,
namun dengan bufer format dan bukan asetat, sensitivitas yang lebih
tinggi segera dipulihkan. Bahkan jika tidak dievaluasi melalui DoE, hal
ini dapat dianggap berasal dari interaksi antara variabel-variabel
tersebut. Lagi-
sebelumnya telah ditunjukkan bahwa autoklaf SLBT dalam bufer
asetat menyebabkan degradasinya [60].
Meskipun senyawa pengion negatif menunjukkan sensitivitas yang
lebih baik dengan bufer asetat, sehingga pertama kali dipilih untuk
penyelidikan D-optimal, penekanan sinyal SLBT yang diamati tidak
dapat diterima. Oleh karena itu, bufer format digunakan dalam metode
definitif yang dilaporkan dalam “Analisis instrumental.”
Pengembangan strategi perlakuan sampel—
pendekatan SALLE
Perlakuan sampel pertama yang diuji adalah SHS-HLLE dengan TEA
sebagai pelarut merdu. Pada suhu rendah (4 °C) dan pada pH netral/
asam, TEA dapat bercampur dengan air, menghasilkan larutan satu
fasa; melalui pH (dengan menambahkan NaOH)
Baglietto M. dkk.
dan perubahan suhu, pemisahan fase diinduksi [22].
Prosedurnya terbukti cukup mudah dan cepat, namun setelah
beberapa percobaan, rendahnya perolehan kembali analit yang dipilih
(<40%) dan ketidakcocokan TEA dengan sistem MS [61] memaksa
perubahan strategi.
Pendekatan kedua yang dipilih adalah SALLE, yang memanfaatkan
pemisahan fasa ACN dari cincin fasa berair pada kekuatan ionik
larutan yang tinggi. Prosedur umum melibatkan pembuatan larutan
fase tunggal yang dihomogenisasi, yang ditambahkan garam,
menyebabkan pemisahan fase. Untuk menjamin stratifikasi lapisan
organik, langkah sentrifugasi biasanya dilakukan sebelum penarikan
surnatan, yang kemudian disaring dan diencerkan dengan baik (atau
dipekatkan) sebelum dianalisis. 36 percobaan SALLE terkait dengan
DoE D-optimal yang dijelaskan dalam “Desain percobaan” dilakukan
pada matriks berair kosong yang dibubuhi analit yang dipertimbangkan.
Setiap percobaan dievaluasi berdasarkan perolehan kembali dan
efek matriks dari masing-masing analit, dan ini digunakan sebagai
respons model.
Karena lebih dari 68% tanggapan berada pada kisaran 50–150%,
keakuratan metode secara umum memuaskan untuk semua analit
yang dipilih, yang berarti bahwa perubahan yang diterapkan dengan
DoE sering kali tidak signifikan. Faktanya, model kemometri yang
dibangun berdasarkan data ini seringkali buruk, sehingga menjelaskan
varians yang rendah atau bahkan tidak ada sama sekali (informasi
lebih lanjut tentang model ini dirangkum dalam Tabel S.8). Model yang
dihitung tidak memberikan saran apa pun tentang cara mengoptimalkan
proses ekstraksi lebih lanjut, namun hasil keseluruhan menunjukkan
bahwa model tersebut kuat: saat memproses sampel dengan analisis
rutin, perubahan kecil yang tidak terkendali dapat terjadi, namun
mungkin berdampak kecil pada eksperimen. hasil [35, 50]. Bahkan
jika hal tersebut bukan merupakan tujuan dari DoE ini, DoE ad hoc
dapat digunakan juga untuk memvalidasi metode yang memeriksa
ketahanannya, dengan perubahan kecil namun disengaja (dan
terkendali) pada beberapa variabel eksperimental [35, 50].
Namun, lima kondisi eksperimental mengoptimalkan nilai pemulihan
dan efek matriks (jumlah respons tertinggi antara kisaran ideal, 70–
120% [50]). Diantaranya, yang paling dekat dengan pusat domain
eksperimental dipilih karena menjamin ketahanan yang lebih besar
[47].
Pertunjukan metode
Seperti disebutkan di bagian “Evaluasi kinerja metode,” baik kinerja
instrumental dari metode pemisahan yang dioptimalkan maupun
protokol pemrosesan sampel dinilai dan dirangkum dalam Tabel 3.
Singkatnya, rentang linier mencakup setidaknya dua kali lipat
kecuali CAFF, SCL, dan SLBT, karena LOQ-nya yang lebih tinggi.
Bagaimanapun, linearitas selalu lebih dari memuaskan dalam rentang
yang dipertimbangkan (R2ÿ0.9978). LOD dan LOQ dalam matriks
dievaluasi dengan dua metode; nilai-nilai
Machine Translated by Google
Bahan-bahan yang sah dan terlarang dalam suplemen makanan: optimalisasi kemometri…
diperoleh Persamaan. 2 (lihat Tabel S.9) adalah yang paling konservatif
(yang lebih tinggi) [50], berkisar antara 0,01 hingga 0,3 ÿg Lÿ1
dan dari 0,04 hingga 1 ÿg Lÿ1, masing-masing. Nilai-nilai tersebut secara
substansial sesuai dengan nilai-nilai instrumental karena, dalam matriks
yang diencerkan, ME umumnya sekitar 100%. Mempertimbangkan faktor
pengenceran karena pemrosesan (dari 120 mg DS menjadi 1,2 mL ACN)
dan faktor yang dilakukan karena konsentrasi tinggi dalam sampel
(diencerkan 1 hingga 50 ribu kali pasir), LOD yang dihitung dan LOQ
dalam matriks asli tidak dilaporkan, karena konsentrasi yang lebih rendah
dapat ditentukan dengan mudah, dengan mengencerkan lebih sedikit.
Namun, dalam kasus kami, ekstrak pada pengenceran yang lebih rendah
(hingga pengenceran 100 kali lipat) dianalisis tetapi terjadi efek matriks
yang lebih signifikan (Tabel S.10) dan tidak ada analit lebih lanjut yang
terdeteksi.
Mengenai spesifisitas, metode yang diusulkan menunjukkan titik
identifikasi yang cukup untuk semua senyawa, berdasarkan arahan EU
2021 808 [62], yang merekomendasikan 3–4 titik identifikasi untuk
menjamin kepercayaan yang tinggi dalam konfirmasi identitas analit target.
Memang benar, setiap transisi RT dan MRM masing-masing memberikan
1 dan 1,5 titik identifikasi, sehingga memberikan 5 poin untuk setiap
senyawa kecuali PRX, TBR, dan TFL, yang mana transisi MRM tunggal
dipantau (dan dengan demikian diperoleh 3,5 poin). Selain itu, rasio antara
transisi MRM quantifer dan qualifer diperiksa di semua sampel: nilai dalam
± 30% dari nilai yang diamati dalam standar yang rapi dianggap dapat
diterima untuk tujuan konfirmasi [51].
Ketepatan intra dan antar hari dinilai sebagai RSD% dari replika
standar yang rapi; Hasilnya dilaporkan pada Tabel 3. Presisi intra-hari
berada di bawah 10% untuk level yang lebih rendah dan 8% untuk level
yang lebih tinggi, sedangkan presisi antar-hari umumnya lebih rendah,
dengan RSD% hingga 28% dan 40% untuk level yang lebih rendah dan
lebih tinggi. tingkat yang lebih tinggi, masing-masing. Oleh karena itu,
standar kalibrasi selalu disertakan dalam kumpulan analisis.
Pendekatan SALLE memungkinkan pemulihan yang baik untuk analit
yang ditargetkan, dalam kisaran 50–110%, kecuali TBR.
Mengingat polaritas yang tinggi dari senyawa-senyawa ini, bahkan
perolehan kembali yang lebih rendah dari beberapa senyawa tersebut dari
fase air (TBR, ACS, PRX, dan SLBT) dianggap dapat diterima.
Namun, jumlah analit yang terdeteksi dalam sampel nyata yang
menunjukkan pemulihan secara signifikan di luar kisaran ideal 70-120%
dikoreksi untuk pemulihannya sendiri [50], seperti yang dilaporkan pada
Tabel 3. Selanjutnya, seperti yang disorot pada Tabel 3 , diperoleh
pengulangan prosedur yang baik, yang memungkinkan koreksi yang andal
untuk nilai pemulihan.
Keakuratan dan ketepatan seluruh metode analisis tidak dapat dinilai
untuk ASA, karena degradasinya yang sudah diketahui [63]. Karena
faktor pengenceran yang besar digunakan untuk analisis sampel nyata,
ME selalu dapat diterima dan hampir dapat diabaikan, berkisar antara 89
hingga 111%.
Metodologi SALLE ini kemudian dibandingkan dengan penelitian lain
mengenai ekstraksi senyawa dari DS (termasuk setidaknya satu analit
yang sama). Tentang
jumlah sampel yang digunakan untuk setiap ulangan, ada penelitian yang
memerlukan lebih sedikit [9], lebih banyak [64], atau bahkan jumlah DS
yang persis sama [14] . Semua karya ini mengevaluasi kandungan
senyawa dalam jumlah bervariasi di sekitar selusin DS. Namun, di antara
metode yang dipertimbangkan, prosedur SALLE yang kami usulkan adalah
yang tercepat dan paling sederhana, memerlukan waktu kurang dari
seperempat jam untuk memproses sampel, menggandakan [14, 64] atau
meningkatkan sekitar sepuluh kali lipat [9] produktivitas prosedur dan
menghindari ekstraksi ultrasonikasi dalam waktu lama [14, 64], atau
prosedur manual yang melelahkan seperti ekstraksi fase padat [9]. Dari
sudut pandang kromatografi, beberapa metode lebih cepat [9, 14] dan
yang lainnya lebih lambat [64], juga bergantung pada strategi pemisahan
spesifik dan spesifisitas detektor yang digunakan.
Faktanya, telah dibuktikan bahwa HILIC dan RPLC dapat dianggap
sebagai strategi pemisahan ortogonal ketika berhadapan dengan studi
terkait doping [33]. Terakhir, kehijauan keempat metodologi ini
diperkirakan melalui perangkat lunak AGREE, dan prosedur SALLE yang
dikembangkan dalam penelitian ini memperoleh skor yang sedikit lebih
tinggi dibandingkan penelitian lain: 0,74 [pekerjaan ini], 0,70 [9], 0,68 [14] ,
0,66 [64]. Penilaian rinci dilaporkan pada Gambar S.4 (A–D).
Sampel nyata
Analit sasaran
Pemrosesan delapan sampel nyata memungkinkan deteksi dan
kuantifikasi beberapa senyawa target, yang dirinci dalam Tabel 4. Satu-
satunya analit dengan jumlah yang dinyatakan pada label DS adalah
CAFF dalam C1 (61 mg gÿ1), C2 (220 mg gÿ1), C3 (tidak jelas), dan P1
(350 mg gÿ1); Kehadiran methylxanthines lainnya disimpulkan dari bahan
ekstrak tumbuhan yang diketahui mengandungnya, seperti Camellia
sinensis
(Teh Hijau), Paullinia cupana (Guaranà), dan Ilex para-guariensis (Yerba-
maté), sedangkan pemanis buatan hanya diberi label sebagai “bahan lain”.
Oleh karena itu, perbandingan kuantitatif dengan jumlah yang tertera pada
label hanya dapat dilakukan untuk CAFF.
Hasil kuantisasi seluruh sampel tidak dibandingkan secara langsung
karena perbedaan dosis, cara penyajian, dan indikasi penggunaan. C1,
C2, dan C3 adalah DS pra-latihan berbasis kafein, juga mengandung
beberapa ekstrak tumbuhan seperti guarana dan ekstrak teh hijau,
menjelaskan dan membenarkan keberadaan masing-masing dari 4
metilxantin [65]. Lebih jauh lagi, dosis kafein yang dinyatakan dalam C1
dan C2 diberi label dengan jelas dan sesuai dengan jumlah yang diukur.
Sebaliknya, C3 menyajikan label yang kurang jelas, sehingga sulit
dibandingkan dengan data eksperimen.
Namun demikian, mengingat jumlah kapsul yang disarankan pada label (4
tutup untuk C1, 1 tutup untuk C2, dan 1-2 tutup untuk C3), dosis kafeinnya
sangat dekat namun masih dalam batas asupan dosis tunggal maksimum
yang direkomendasikan yaitu 200 mg [ 43],
 Machine Translated by Google

Tabel
2R reiniL
silanA -Q
D
a]i1rg
O
ta
ÿn
ÿh
LI[ is-isaieb
rla
tvr)nP
h
2
l(i isrisaiertla
nvrP
a
h
l( isrisaieb
rtla
nvr)P
a
h
2
l( ).vedl.adrtus)dik±se0
%
,is6s1%
eE
=
olird
n
rM
R
P
p(

naragsÿik[ isiselvrp
l( iag,a6nb=oenis(

haubes)1 haubes)1 )%DSR

SCA %9 %1 %72 %3±15 %801 %6

062
59-Q
20
9
5 1
9
O,0
L

MSRF 4,0 %8 %8 %9±97 %301

IAGABES 2,0 %9 %3 %9 cDN cDN

ZTCH 40,0 %8 %6 %8±48 %011

08
259-Q
13
9 0
9
O,0
L

FFAC 8,0 kadit %6 kadit %6

LFT 09
828
7-Q
41
9 0
9
O,0
L 1,0 %6 %6 %9
4±9
17
6 %6

LCS 4,0 %2 %12 %0%

11±±
704
1 %201 %9

RBT 2,0 %6 %5 %7 %7 %2
01
859
2
9 8-Q
50
1
9
2 9
O,0
L

XRP %7 %5 %9 %6
1±1
07
5 %401 %1

ACOC 40,0 %2 %1 %8

TBLC %3 %1 %82 %4
7±2
85
8 %8

TBLS kadit %1 kadit %04 %8

90929-Q
9,3
O
0,>
L
0 1
isnaark
tn
aia
hlAe
pF
ad
in
T
ka
-ta
5
.C
g
Q
s
ia
u
k
ea
F
u
)e
ll0
B
s a1
nictO
lrta
5
A
n
O
g
vL
e
,e
d
n
a
g
ÿ
y
o
il0
t,in
lv
C
K
S
0
u
L
n
b
a
1
d
si(tli
ÿ
k
y

isartnihlAa
ek
pa
tC
su
ia
u
)la
n
1
ciO
ltvn
d
0
ÿg
o2lC
e b
2
u
a
L
s(
k
ÿ

nanissaeakslada
u
eom
an
tprn
ktA
rm
eage
arS
lD
e
ta
diA
d
p
ict
k
s
Baglietto M. dkk.
Machine Translated by Google
Bahan-bahan yang sah dan terlarang dalam suplemen makanan: optimalisasi kemometri…
Tabel 4 Kuantifikasi target DS ACSa
analit dalam sampel; bila tidak
dilaporkan secara berbeda, ÿg gÿ1
pengenceran 10 ribu kali dianggap.
C1 ND
ND adalah singkatan dari “tidak
terdeteksi” yang berarti<LOD C2 ND
C3 (100-
bahkan pada pengenceran yang lebih rendah ND
melipat) C4 ND
C5 ND
P1 (7,66±0,04)× 103 (27±1)× 103 b ND (8,5±0,3)× 103 b ND ND (1,95±0,06)× 103
P2 620±4 ND
P3 ND (0,5±0,1)× 10399±5
A
Hasil eksperimen dikoreksi untuk perolehan analit ketika lebih rendah dari 70%, seperti yang dilaporkan pada Tabel 3
B
Kuantifikasi menggunakan pengenceran 50 ribu kali
C
Kuantifikasi menggunakan pengenceran 1 ribu kali
yang juga merupakan dosis maksimum yang sah untuk DS yang
dijual di Italia [66]. Baik C4 (berbasis ekstrak tumbuhan) dan C5
(berbasis protein) adalah DS dalam bentuk kapsul yang tidak
melaporkan analit target apa pun pada labelnya, dan tidak ada satu
pun yang terdeteksi.
Karena P1, P2, dan P3 berbentuk bubuk sehingga perlu
dilarutkan dengan air sebelum diminum, sehingga perlu diberi rasa
yang enak. Masing-masing dari mereka menyatakan pada labelnya
setidaknya satu pemanis antara ACS dan SCL, yang terdeteksi
dengan benar dalam ekstrak. Sebagai contoh, kromatogram yang
menunjukkan transisi MRM ACS yang ada dalam ekstrak encer P2
dilaporkan pada Gambar S.5. Namun, jumlah senyawa-senyawa ini
tidak dicantumkan pada label sehingga perbandingan tidak
mungkin dilakukan, namun jumlah yang terdeteksi konsisten
dengan yang diperlukan untuk memperoleh rasa manis (mengingat
kekuatan pemanisnya [67] dan pengenceran bubuk yang
disarankan). P1 sekali lagi merupakan DS berbasis kafein sebelum
latihan, dikonfirmasi oleh kuantisasi metilxantin ini, sedangkan P2
dan P3 adalah DS berbasis protein yang mengandung bubuk kakao
untuk meningkatkan rasa; ini menjelaskan mengapa TBR dan
CAFF terdeteksi dalam ekstrak. Selain itu, rasio TBR/CAFF
eksperimental (dalam kisaran 16,2-17,3) pada DS ini masuk akal
dengan rasio alami yang ditemukan dalam bubuk kakao dalam
literatur (5,8-19,8) [68], menunjukkan bahwa tidak satu pun dari
mereka yang sesuai. ditambahkan secara buatan sebagai senyawa
murni dalam formulasi DS. Untuk jenis produk ini, asupan kafein
dosis tunggal yang sesuai bergantung pada jumlah DS yang
dikonsumsi dengan mengikuti petunjuk yang tertera pada labelnya:
karena label P1 mengharuskan pelarutan 9 g DS untuk satu porsi,
ini akan melebihi batas legislatif Italia yaitu 200 mg CAFF [66],
sebagaimana sudah dapat disimpulkan dari labelnya sendiri.
Sebaliknya, P2 dan P3 masing-masing membutuhkan 32 dan 33 g
DS per porsi, namun jumlah kafein yang cukup rendah dalam DS
ini masih dalam batas tertentu.
Hasil serupa diperoleh Helle dkk. [6] di Norwegia, yang
menemukan 4 DS dari 93 yang dianalisis mengandung kandungan
kafein terlarang untuk penyajian dosis tunggal (dengan
CAFF TFLa SCL TBRa PRXa
(41,0±0,6)× 103 b 70±2 ND 111±2 27,6±0,4
(192,2±0,5)× 103 b 20± 3c ND (0,58±0,03)× 103 37±3
(106±3)× 103 b 18± 2c ND 45±4 52±1
tidak ND ND tidak tidak
tidak ND ND tidak tidak
19,6±0,2
126±4 (2,04±0,01)× 103 ND
(1,71±0,07)× 103 ND
sehubungan dengan 300 mg dari batas Norwegia). Sayangnya,
mereka tidak melaporkan rincian pengolahan sampel sehingga
tidak mungkin membandingkan aspek tersebut.
Identifikasi tentatif analog clenbuterol
Meskipun tidak ada obat yang dianggap terlarang yang terdeteksi
dalam DS, salah satu dari obat tersebut menampilkan nama
komersial yang sangat mengingatkan pada clenbuterol (meskipun
tidak terdeteksi dalam ekstraknya). Senyawa ini adalah yang
paling umum dari kelas anabolik, agonis ÿ2, yang hanya berbeda
pada substituen nitrogen “R” [17], yang, untuk CLBT, merupakan
gugus tert-butil. Oleh karena itu, pendekatan penyaringan tersangka
diterapkan. Perilaku khas kelompok senyawa ini dalam ESI adalah
pembentukan ion molekul semu [M + H]+, yang mengalami
fragmentasi dengan kehilangan molekul air terlebih dahulu dan
kemudian substituen nitrogen sebagaimana adanya atau, lebih
jarang, sebagai R=NH (kehilangan netral molekul tak jenuh)
menghasilkan ion produk pada m/z=203.0 dan 188.0 [69].
Fragmentasi ini dapat terus berlanjut, menghasilkan ion produk lain
(seperti pada m/z=168.0 dan 132.1) secara independen dari
prekursornya [17, 69]. Dengan demikian, beberapa ion produk
secara teoritis umum untuk semua analog ini, menjadikan kinerja
PcIS pilihan yang layak untuk penyaringan.
Evaluasi ini dilakukan dengan mengelusi ekstrak DS dengan
gradien yang sama yang ditetapkan untuk analit target dan dengan
memantau apakah ada ion prekursor yang mampu menghasilkan
ion produk CLBT yang paling kuat.
Puncak yang menarik diamati pada RT=19,9 menit, karena ion
prekursor pada m/z=262,1 dan 263,1, menghasilkan kedua ion
pada m/z=203,0 dan 132,1. Oleh karena itu, MRM dan PdIS
dilakukan, untuk mendapatkan informasi lebih lanjut. Analisis MRM
mengkonfirmasi fragmentasi dua ion pra-kursor yang diamati,
menghasilkan kedua ion produk, sementara PdIS mengungkapkan
fragmentasi lebih lanjut ke m/z=103,0 dan 115,0. Sepengetahuan
penulis, produksi ion-ion untuk senyawa semacam ini belum pernah
dilaporkan
Machine Translated by Google
Gambar 7 Jalur fragmentasi ESI+/
QQQ yang disarankan dari clen-
properol, salah satu struktur
yang mungkin dihipotesiskan
bertanggung jawab atas sinyal
analitik yang terdeteksi dalam ekstrak C1
sebelum [17, 70], namun hal ini dapat dirasionalisasikan sebagai
kehilangan lebih lanjut CH2 = NH (MW = 29 Da) dan amonia
(MW=17 Da) dari ion pada m/z=132.1.
Karena puncak kromatografi tunggal diamati dengan
mengekstraksi arus ion pada m/z=262.1 dan 263.1, puncak
kromatografi tunggal dapat diinterpretasikan sebagai produksi ion
molekul yang tidak biasa dalam ESI [M]•+ dengan komposisi yang
sama -pon terionisasi melalui protonasi ([M+ H]+) [71, 72] atau
sebagai hilangnya H• dalam sumber, sehingga mengindikasikan
satu spesies yang dielusi. Oleh karena itu, data ini dapat
dirasionalisasikan sebagai kemungkinan adanya analog CLBT
dengan substituen nitrogen -C3H7 , yang kemungkinan jalur
fragmentasinya ditunjukkan pada Gambar. 7. Fakta tambahan yang
mendukung hipotesis ini adalah urutan elusi yang diamati dalam
analisis HILIC (senyawa yang lebih polar akan lebih banyak
tertahan di kolom dibandingkan senyawa yang kurang polar).
Gugus propil yang dihipotesiskan sebagai substituen nitrogen dan
bukan tert-butil seharusnya menyiratkan polaritas molekul yang
sedikit lebih tinggi, yang sesuai dengan urutan elusi yang diamati (RTCLBT=19,0
Semua informasi ini memungkinkan perolehan titik identifikasi
yang cukup untuk menetapkan sinyal yang terdeteksi antara tingkat
L2 (kemungkinan struktur berdasarkan bukti diagnostik) dan L3
(kandidat tentatif yang diidentifikasi sebagai substruktur dan/atau
kelas) menurut Röhler dkk. [73], juga karena ketidakmungkinan
untuk membedakan beberapa isomer yang mungkin (misalnya,
gugus n-propil dan iso-propil akan menghasilkan fragmentasi yang
sama). Analisis lebih lanjut dapat meningkatkan titik kepercayaan,
namun standar referensi masih diperlukan untuk mengkonfirmasi
identitas senyawa terdeteksi yang tidak diketahui.
Baglietto M. dkk.
Kesimpulan
Langkah pertama dari pekerjaan ini mengeksploitasi DoE secara
mendalam untuk memahami sepenuhnya mekanisme retensi analit
yang ditargetkan pada kolom HILIC diolik yang dipilih. Karena
variabel-variabel eksperimental memberikan dampak yang berbeda
terhadap tanggapan, maka perlu untuk menemukan kompromi
terbaik. Pemisahan kritis TFL dan PRX memaksa beberapa kondisi
awal pemisahan kromatografi. Terlebih lagi, ketika mencoba
mempercepat analisis dengan melakukan gradien, penekanan
yang kuat pada sensitivitas SLBT diperlukan untuk mengubah
bufer, memulihkan format, yang dikeluarkan dari penyelidikan DoE
D-optimal. Setelah metode instrumental dikembangkan sepenuhnya,
strategi perlakuan sampel juga dipelajari melalui pendekatan
kemometri. SALLE yang dioptimalkan memungkinkan ekstraksi
analit polar dari matriks DS secara memuaskan dan dengan
demikian digunakan untuk memproses sampel sebenarnya. Faktor
pengenceran tinggi yang diterapkan, karena tingginya konsentrasi
yang diharapkan,
menunjukkan hampir
menit, RTanalog=19,9 menit). tidak ada efek matriks, yang
mengkuantifikasi enam bahan legal dalam beberapa DS.
Kesimpulan dari hasil yang diperoleh adalah tidak ada senyawa
terlarang yang ditargetkan terdeteksi (juga pada pengenceran
rendah) dan tidak ada produk yang diberi label dengan jelas,
sementara beberapa senyawa legal terdeteksi dan diukur dengan
benar. Namun, salah satu produk berbasis kafein mengungkapkan
kandungan CAFF dosis tunggal lebih tinggi dari yang diizinkan oleh
otoritas Italia [66]. Kesimpulannya, strategi yang dikembangkan
dapat berhasil digunakan untuk mengukur beberapa bahan legal
polar dan senyawa dopan terlarang
Machine Translated by Google
Bahan-bahan yang sah dan terlarang dalam suplemen makanan: optimalisasi kemometri…
dengan kinerja dan keandalan yang baik. Hal ini dapat berguna
untuk beberapa tujuan, seperti memeriksa kebenaran pelabelan
DS dan mencegah atau mengkonfirmasi kemungkinan doping
yang tidak diinginkan karena kontaminasi atau pemalsuan DS.
Selain itu, serangkaian pemindaian PcIS, PdIS, dan MRM
diterapkan secara positif untuk mendeteksi dan secara tentatif
mengidentifikasi analog struktural CLBT, yang mana penyelidikan
lebih lanjut akan direncanakan.
Informasi Tambahan Versi online berisi materi tambahan yang tersedia di https://
doi.org/10.1007/s00216-024-05173-4.
Kontribusi penulis Matteo Baglietto: konseptualisasi; kurasi data; analisis formal;
penyelidikan; metodologi; validasi; visualisasi; tulisan—draf asli; Barbara Benedetti:
konseptualisasi; analisis formal; metodologi; pengawasan; menulis—meninjau dan
mengedit; Marina Di Carro: pengawasan; menulis—meninjau dan mengedit; administrasi
proyek; Emanuele Magi: pengawasan, administrasi proyek.
Pendanaan Pendanaan akses terbuka disediakan oleh Università degli Studi di
Genova dalam Perjanjian CRUI-CARE.
Deklarasi
Konflik kepentingan Para penulis menyatakan tidak ada kepentingan yang bersaing.
Akses Terbuka Artikel ini dilisensikan di bawah Lisensi Internasional Creative
Commons Attri-bution 4.0, yang mengizinkan penggunaan, berbagi, adaptasi,
distribusi, dan reproduksi dalam media atau format apa pun, selama Anda memberikan
kredit yang sesuai kepada penulis asli dan sumbernya, berikan tautan ke lisensi
Creative Commons, dan tunjukkan jika ada perubahan. Gambar atau materi pihak
ketiga lainnya dalam artikel ini termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel
tersebut, kecuali dinyatakan lain dalam batas kredit materi tersebut. Jika materi tidak
termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel dan tujuan penggunaan Anda tidak
diizinkan oleh peraturan perundang-undangan atau melebihi penggunaan yang
diizinkan, Anda harus mendapatkan izin langsung dari pemegang hak cipta. Untuk
melihat salinan lisensi ini, kunjungi http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Referensi
1. Daftar terlarang. Dalam: Badan Anti Doping Dunia. 2023.https ://www.
wada-ama.org/en/resources/world-anti-doping-program/prohi
daftar yang digigit. Diakses November 2023.
2. Kode anti-doping dunia. Dalam: Badan Anti-Doping Dunia. 2021.https ://www.wada-
ama.org/en/resources/world-anti-doping-progr
am/kode-anti-doping-dunia. Diakses November 2023.
3. Eichner A, Lewis LA, Leonard B, Wagoner RMV, Eichner D, Fedoruk MN. Obat-
obatan generik sebagai sumber kontaminasi diuretik pada atlet yang menjalani
pengujian obat olahraga. Aksi Olahraga Depan Hidup. 2021;3:692244. https://
doi.org/10.3389/fspor.2021.692244.
4. Martínez-Sanz JM, Sospedra I, Ortiz CM, Baladía E, Gil-Izquierdo A, Ortiz-Moncada
R. Doping yang disengaja atau tidak? Tinjauan keberadaan zat doping dalam
suplemen makanan yang digunakan dalam olahraga. Nutrisi. 2017;9:1093. https://
doi.org/10.3390/nu9101093.
5. Walpurgis K, Thomas A, Geyer H, Mareck U, Thevis M. Suplemen makanan dan
kontaminasi makanan serta implikasinya terhadap pengendalian doping.
Makanan. 2020;9:1012. https://doi.org/10.3390/
makanan9081012.
6. Helle C, Sommer AK, Syversen PV, Lauritzen F. Doping zat dalam suplemen
makanan. Tidsskrift untuk Den norske
legforening. 2019;139(4). https://doi.org/10.4045/tidsskr.18.
0502.
7. Geyer H, Parr MK, Koehler K, Mareck U, Schänzer W, Thevis M. Suplemen nutrisi
terkontaminasi silang dan dipalsukan dengan zat doping. J Spektrum Massa.
2008;43:892–902. https://
doi.org/10.1002/jms.1452.
8. Van Thuyne W, Van Eenoo P, Delbeke FT. Suplemen nutrisi: prevalensi
penggunaan dan kontaminasi dengan agen doping. Nutr Res Rev.2006;19:147–
58. https://doi.org/10.1079/NRR2006122.
9. Roifé RR, Sardela VF, Lima AL dos S, Oliveira DS, Aquino FR de, Lima K dos SC,
Cruz MN da S de la. Penentuan semut pezinah dalam suplemen makanan
protein whey dengan kromatografi cair ditambah dengan spektrometri massa
resolusi tinggi Orbitrap. Teknologi Pangan Braz J. 2019;22:. https://doi.org/
10.1590/1981-6723.20618.
10. Suplemen Hubungkan Daftar Risiko Tinggi | USADA. 2021.https ://
www.usada.org/athletes/substances/supplement-connect/high-risk-list/ . Diakses
November 2023.
11. Dopingautoriti. Di: Nederlands Zekerheidssysteem Voedings-suplementen
Topsport. 2023. https://www.dopingautoriteit.nl/
nzvt/database. Diakses November 2023.
12. KG HG& C. Produkt-Datenbank. 2023.https ://www.koelnerlis
te.com/produkt-datenbank. Diakses November 2023.
13. Sertifikasi Suplemen Olahraga | Olahraga yang Diinformasikan. 2023. https://
sport.wetestyoutrust.com/. Diakses November 2023.
14. Favretto D, Visentin S, Scrivano S, Roselli E, Mattiazzi F, Per-tile R, Vogliardi S,
Tucci M, Montisci M. Beberapa kejadian resep diuretik hidroklorotiazid dalam
suplemen nutrisi majemuk. Tes Narkoba Anal. 2019;11:512–22. https://doi.org/
10.1002/dta.2499.
15. Thevis M, Walpurgis K, Thomas A. Pendekatan analitis dalam pengujian obat
olahraga manusia: kemajuan terkini, tantangan, dan solusi. Kimia Anal.
2020;92:506–23. https://doi.org/10.1021/
acs.analchem.9b04639.
16. Peters RJB, Oosterink JE, Stolker AAM, Georgakopoulos C, Nielen MWF.
Persiapan sampel generik dikombinasikan dengan kromatografi cair resolusi
tinggi – spektrometri massa waktu pertarungan untuk penyatuan skrining urin di
laboratorium kontrol doping. Kimia Bioanal Anal. 2010;396:2583–98. https://
doi.org/
10.1007/s00216-010-3484-3.
17. Nielen MWF, Lasaroms JJP, Essers ML, Oosterink JE, Meijer T, Sanders MB,
Zuidema T, Stolker AAM. Analisis multiresidu beta-agonis dalam urin sapi dan
babi, pakan dan rambut menggunakan kromatografi cair ionisasi elektrospray
spektrometri massa tandem. Kimia Bioanal Anal. 2008;391:199–210. https://
doi.org/10.1007/s00216-007-1760-7.
18. Aly AA, Górecki T. Green pendekatan persiapan sampel berdasarkan teknik
ekstraksi. Molekul. 2020;25:1719. https://doi.org/10.3390/molecules25071719.
19. Müller LS, Moreira APL, Muratt DT, Viana C, de Carvalho LM.
Metode spektrometri massa tandem kromatografi cair kinerja sangat tinggi-
elektrospray untuk penyaringan dan penentuan obat anoreksia, ansiolitik,
antidepresan, diuretik, pencahar, dan stimulan secara bersamaan dalam
suplemen makanan yang dipasarkan untuk menurunkan berat badan. J
Kromatografi Sci. 2019;57:528–40. https://doi.org/10.1093/chromsci/bmz025.
20. Lee JH, Yang YJ, Min AY, Kim SJ, Jung EJ, Kim JH, Beak SY. Skrining dan
penjelasan fragmentasi 23 diuretik dalam suplemen makanan menggunakan
UHPLC-Q-Orbitrap. Keadilan Sains. 2021;61:451–8. https://doi.org/10.1016/
j.scijus.2021.05.004.
21. Anthemidis AN, Ioannou K-IG. Perkembangan terkini dalam ekstraksi cair-cair
homogen dan dispersif untuk penentuan unsur anorganik. Ulasan Talanta.
2009;80:413–21. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2009.09.005.
22. Alshana U, Hassan M, Al-Nidawi M, Yilmaz E, Soylak M.
Mikroekstraksi cair-cair pelarut hidrofilisitas yang dapat dialihkan.
Machine Translated by Google
TraC, Tren Kimia Anal. 2020;131:116025. https://doi.org/10.
1016/j.trac.2020.116025.
23. de Paula Meirelles G, Fabris AL, Ferreira dos Santos K, Costa JL, Yonamine
M. Green toksikologi analitik untuk penentuan metabolit kokain. J Anal
Toksikol. 2022;bkac005. https://doi.
org/10.1093/jat/bkac005
24. Pasupuleti RR, Gurrani S, Tsai PC, Ponnusamy VK. Teknik mikroekstraksi
cair-cair berbantuan garam baru untuk aplikasi analisis sampel lingkungan,
makanan, dan biologi: tinjauan.
Kimia Anal Curr. 2020;18:577–87. https://doi.org/10.2174/15734
11017999201228212537.
25. Magiera S, Kolanowska A, Baranowski J. Metode ekstraksi berbantuan
Salting-out ditambah dengan kromatografi cair interaksi hidrofilik untuk
penentuan ÿ-blocker terpilih dan metabolitnya dalam urin manusia. J
Kromatografi B. 2016;1022:93–101. https://doi.org/10.1016/
j.jchromb.2016.04.010.
26. Labad F, Montemurro N, Berisha S, Thomaidis NS, Pérez S.
Ekstraksi satu langkah dan analisis 45 kontaminan yang menjadi perhatian
menggunakan metodologi QuEChERS dan HR-MS pada daun dan akar
lobak. MetodeX. 2021;8:101308. https://doi.org/10.
1016/j.mex.2021.101308.
27. Gao J, Ma C, Duan Q, Gao W, Li H. Penentuan simultan 16 obat yang
ditambahkan secara ilegal dalam suplemen makanan kapsul menggunakan
metode QuEChERS dan HPLC–MS/MS. Kromatografi. 2021;84:1009–23.
https://doi.org/10.1007/s10337-021-04087-y.
28. Chen D, Xu Q, Lu Y, Mao Y, Yang Y, Tu F, Xu J, Chen Y, Jiang X, Lu J,
Yang Z. Metode QuEChERS ditambah dengan kromatografi cair kinerja
tinggi-spektrometri massa tandem untuk penentuan diuretik dalam makanan
yang berasal dari hewan. J Makanan Kompos Anal. 2021;101:103965.
https://doi.org/10.1016/j.jfca.
2021.103965.
29. Kim BH, Lee W, Kim YL, Lee JH, Hong J. Pembersihan matriks yang efisien
dari suplemen makanan jenis gel lunak untuk penyaringan cepat terhadap
92 pezinah ilegal menggunakan EMR-lipid dSPE dan UHPLC-Q/
TOF-MS. Farmasi. 2021;14:570. https://doi.org/10.3390/
ph14060570.
30. Odoardi S, Mestria S, Biosa G, Valentini V, Federici S, Strano Rossi S.
Gambaran umum tentang obat peningkat kinerja dan citra (PIED) yang
disita di Italia pada periode 2017–2019. Klinik Toksikol. 2021;59:47–52.
https://doi.org/10.1080/15563650.2020.
1770277.
31. Mazzarino M, Fiacco I, de la Torre X, Botrè F. Penapisan dan analisis
konfirmasi stimulan, narkotika dan agen beta-adrenergik dalam urin
manusia dengan kromatografi cair interaksi hidrofilik digabungkan dengan
spektrometri massa. J Kromatografi A. 2011;1218:8156–67. https://doi.org/
10.1016/j.chroma.2011.09.020.
32. Görgens C, Guddat S, Orlovius AK, Sigmund G, Thomas A, Thevis M,
Schänzer W. Uji skrining multi-target “encer-dan-injeksi” untuk zat doping
yang sangat polar menggunakan kromatografi cair interaksi hidrofilik tinggi
resolusi/spektrometri massa akurasi tinggi untuk pengujian obat olahraga.
Kimia Bioanal Anal. 2015;407:5365–79. https://doi.org/10.1007/
s00216-015-8699-x.
33. González-Rubio S, Ballesteros-Gómez A, Carreras D, Muñoz G, Rubio S.
Sebuah studi komprehensif tentang kinerja mekanisme retensi yang
berbeda dalam pengujian obat olahraga dengan spektrometri massa
tandem kromatografi cair. J Kromatografi B. 2021;1178:122821. https://
doi.org/10.1016/j.jchromb.2021.
122821.
34. Peringatan AJ. Kromatografi interaksi hidrofilik untuk pemisahan peptida,
asam nukleat dan senyawa polar lainnya. J Kromatografi. 1990;499:177–
96. https://doi.org/10.1016/s0021-
9673(00)96972-3.
35. Dejaegher B, Heyden YV. Penggunaan desain eksperimental dalam ilmu
pemisahan. Kromatografi Akta. 2009;21:161–201. https://doi.
org/10.1556/achrom.21.2009.2.1.
Baglietto M. dkk.
36. Latrous L. Optimasi dan validasi dalam kromatografi cair menggunakan
desain eksperimen. Kimia Afrika. 2022;5:437–58. https://doi.org/10.1007/
s42250-022-00344-1.
37. Taraji M, Haddad PR, Amos RIJ, Talebi M, Szucs R, Dolan JW, Pohl CA.
Pengembangan metode berbantuan kemometri dalam kromatografi cair
interaksi hidrofilik: tinjauan. Anal Chim Acta. 2018;1000:20–40. https://
doi.org/10.1016/j.aca.2017.09.041.
38. Greco G, Letzel T. Interaksi utama dan pengaruh parameter kromatografi
dalam pemisahan HILIC. J Kromatografi Sci. 2013;51:684–93. https://
doi.org/10.1093/chromsci/bmt015.
39. Laporan angka pengujian anti-doping. Dalam: Badan Anti Doping Dunia.
2023. https://www.wada-ama.org/en/resources/anti-doping-stats/
laporan angka-pengujian-anti-doping. Diakses November 2023.
40. Aturan anti-doping. Di dalam: Fédération Équestre Internasional. 2023.https ://
inside.fei.org/content/anti-doping-rules. Diakses November 2023.
41. Zat terlarang NCAA. Di: NCAA.org. 2023.https ://www.
ncaa.org/sports/2015/6/10/ncaa-banned-subst ances.aspx.
Diakses November 2023
42. Diel P. Cafeine dan doping—apa yang telah kita pelajari sejak tahun 2004.
Nutrisi. 2020;12:2167. https://doi.org/10.3390/nu12082167.
43. Panel EFSA tentang Produk Diet, Nutrisi dan Alergi (NDA). Opini Ilmiah
tentang keamanan kafein. EFSA J.2015;13:4102. https://doi.org/10.2903/
j.efsa.2015.4102.
44. Plackett RL, Burman JP. Desain percobaan multifaktorial yang optimal.
Biometrika. 1946;33:305–25. https://doi.org/10.
1093/biomet/33.4.305.
45. Leardi R, Melzi C, Polotti G. CAT (Alat Agile Kemometri). 2023.http: //
www.gruppochemiometria.it/index.php/software.
46. Leardi R. D-desain optimal. Dalam: Ensiklopedia kimia analitik. John Wiley
& Sons, Ltd; 2018. hal 1–11. https://doi.org/10.
1002/9780470027318.a9646.
47. Benedetti B, Caponigro V, Ardini F. Desain eksperimental langkah demi
langkah: panduan praktis untuk pemula. Kimia Anal Crit Rev. 2020;52(5):1015–
28. https://doi.org/10.1080/10408347.2020.1848517.
48. Benedetti B, Baglietto M, MacKeown H, Scapuzzi C, Di Carro M, Magi E.
Metode pemrosesan yang dioptimalkan untuk sampel integratif kimia
organik polar yang digunakan dalam air laut: menuju maksimalisasi
akurasi analisis untuk jejak kontaminan yang muncul .
J Kromatografi A. 2022;1677:463309. https://doi.org/10.1016/j.
kroma.2022.463309.
49. MacKeown H, Magi E, Di Carro M, Benedetti B. Mengungkap peran ukuran
pori membran dalam sampler integratif kimia organik polar (POCIS) untuk
memperluas kisaran polaritas sampel analit. Kimia Bioanal Anal.
2022;414:1963–72. https://doi.org/10.
1007/s00216-021-03832-4.
50. Kruve A, Rebane R, Kipper K, Oldekop ML, Evard H, Herodes K, Ravio P,
Leito I. Review tutorial validasi metode kromatografi cair-spektrometri
massa: bagian II. Anal Chim Acta. 2015;870:8–28. https://doi.org/10.1016/
j.aca.2015.02.016.
51. Pengendalian mutu analitis dan prosedur validasi metode analisis residu
pestisida pada pangan dan pakan - SANTE 11312/2021.
Di: EURL | Residu Pestisida | Pengendalian Mutu Analitik dan Prosedur
Validasi Metode Analisis Residu Pestisida pada Pangan dan Pakan. 2021.
https://www.eurl-pestisida.eu/userfiles/fle/
EurlALL/SANTE_11312_2021.pdf. Diakses November 2023.
52. Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategi penilaian efek
matriks dalam metode bioanalitik kuantitatif berdasarkan HPLCÿMS/MS.
Kimia Anal. 2003;75:3019–
30.https ://doi.org/10.1021/ac020361s.
53. Lehotay SJ, Mastovska K, Lightfeld AR, Gates RA. Kinerja multi-ana-lyst,
multi-matriks dari pendekatan QuEChERS untuk residu pestisida dalam
makanan dan pakan menggunakan analisis HPLC/MS/MS dengan teknik
kalibrasi yang berbeda. J AOAC Int. 2010;93:355–
67. https://doi.org/10.1093/jaoac/93.2.355.
Machine Translated by Google
Bahan-bahan yang sah dan terlarang dalam suplemen makanan: optimalisasi kemometri…
54. Pena-Pereira F, Wojnowski W, Tobiszewski M. SETUJU—Pendekatan
dan perangkat lunak metrik GREEnness analitik. Kimia Anal.
2020;92:10076–82. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c01887.
55. Dejaegher B, Vander Heyden Y. Metode HILIC dalam analisis farmasi. J
Sep Sains. 2010;33:698–715. https://doi.org/10.1002/
jssc.200900742.
56. Buszewski B, Noga S. Kromatografi cair interaksi hidrofilik (HILIC)—
teknik pemisahan yang ampuh. Kimia Bioanal Anal. 2012;402:231–47.
https://doi.org/10.1007/
s00216-011-5308-5.
57. Cech NB, Enke CG. Implikasi praktis dari beberapa penelitian terbaru
dalam dasar-dasar ionisasi elektrospray. Spektrum Massa Rev.
2001;20:362–87. https://doi.org/10.1002/mas.10008.
58. Narduzzi L, Royer AL, Bichon E, Guitton Y, Buisson C, Le Bizec B, Dervilly-
Pinel G. Ammonium fuoride sebagai aditif yang sesuai untuk metabolisme
LC-HRMS berbasis HILIC. Metabolisme. 2019;9:292. https://doi.org/
10.3390/metabo9120292.
59. He K, Echigo S, Asada Y, Itoh S. Penentuan kafein dan metabolitnya di
pabrik pengolahan air limbah menggunakan ekstraksi fase padat dan
kromatografi cair – spektrometri massa tandem.
Sains Anal. 2018;34:349–54. https://doi.org/10.2116/analsci.34.349.
60. Mälkki-Laine L, Purra K, Kähkönen K, Tammilehto S. Dekomposisi
salbutamol dalam larutan air. II. Pengaruh spesies bufer, pH, konsentrasi
bufer dan antioksidan. Farmasi Int J. 1995;117:189–95. https://doi.org/
10.1016/0378-5173(94)00329-4.
61. Rütters H, Möhring T, Rullkötter J, Griep-Raming J, Metzger JO. Efek
memori persisten trietilamina dalam analisis fosfolipid dengan
kromatografi cair/spektrometri massa.
Spektrum Massa Komunitas Cepat. 2000;14:122–3. https://doi.
org/10.1002/(SICI)1097-0231(20000130)14:2%3c122::AID-
RCM844%3e3.0.CO;2-R.
62. Peraturan Pelaksana Komisi (EU) 2021/808 tanggal 22 Maret 2021
tentang kinerja metode analisis residu zat aktif farmakologis yang
digunakan pada hewan penghasil makanan dan interpretasi hasil serta
metode yang akan digunakan. untuk pengambilan sampel dan
pencabutan Keputusan 2002/657/
EC dan 98/179/EC. 2021. http://data.europa.eu/eli/reg_impl/2021/
808/2021-06-10/eng.
63. Skibinski R, Komsta L. Kinetika stabilitas dan degradasi asam asetilsalisilat
dalam larutan organik yang berbeda ditinjau kembali – studi spektrometri
UHPLC – ESI-QTOF. Isu Terkini dalam Ilmu Farmasi dan Kedokteran.
2016;29:39–41. https://doi.org/10.
1515/cipms-2016-0009.
64. dos Santos JRMP, Junior JGM, Albert ALM, Leandro KC. Metode
penyaringan cepat dalam identifikasi 17 pezinah dalam suplemen
makanan. Kromatografi. 2021;84:267–74. https://doi.org/
10.1007/s10337-021-04007-0.
65. Yoo C, Xing D, Gonzalez D, Jenkins V, Nottingham K, Dickerson B,
Leonard M, Ko J, Faries M, Kephart W, Purpura M, Jäger R, Wells SD,
Sowinski R, Rasmussen CJ, Kreider RB. Penelanan paraxanthine akut
meningkatkan kognisi dan memori jangka pendek dan membantu
mempertahankan perhatian dalam uji coba crossover double-blind, terkontrol plasebo.
Nutrisi. 2021;13:3980. https://doi.org/10.3390/nu13113980.
66. Ministero della Salute. Kafeina: batas pembagian makanan tidak
terintegrasi dan diklaim berdasarkan peraturan (CE) 1924/2006. 2017.
https://www.trovanorme.salute.gov.it/norme/renderNorm
sanPdf?anno=2017&codLeg=58252&parte=1%20&serie=null.
67. Chattopadhyay S, Raychaudhuri U, Chakraborty R. Pemanis buatan –
ulasan. J Teknologi Sains Pangan. 2014;51:611–21. https://doi.org/
10.1007/s13197-011-0571-1.
68. Zoumas BL, Kreiser WR, Roberta M. Theobromine dan kandungan kafein
pada produk coklat. J Ilmu Makanan. 1980;45:314–6. https://
doi.org/10.1111/j.1365-2621.1980.tb02603.x.
69. Niessen WMA, Correa C.RA. Fragmentasi obat-obatan dan pestisida.
Dalam: Interpretasi spektrum massa MS-MS obat dan pestisida. John
Wiley & Sons, Ltd; 2017. hlm.129–349. https://
doi.org/10.1002/9781119294269.ch4.
70. (2023) Cari Database NIST 20 dan Wiley MS. Dalam: Layanan Instrumen
Ilmiah (SIS) oleh Adaptas Solutions. https://www.
sisweb.com/software/ms/nistsearch.htm. Diakses November 2023.
71. Vessecchi R, M. Crotti A, Guaratini T, Colepicolo P, Galem-beck S, Lopes
N. Proses pembentukan ion radikal senyawa organik dalam spektrometri
massa ionisasi elektrospray.
MROC. 2007;4:75–87. https://doi.org/10.2174/1570193077
79815910.
72. Demarque DP. Reaksi fragmentasi menggunakan spektrometri massa
ionisasi elektrospray: alat penting untuk penjelasan struktural dan
karakterisasi produk sintetis dan alami. Perwakilan Nat Prod 2016. https://
doi.org/10.1039/c5np00073d.
73. Röhler L, Schlabach M, Haglund P, Breivik K, Kallenborn R, Bohlin-
Nizzetto P. Karakterisasi kontaminan organik yang tidak ditargetkan dan
dicurigai di udara Arktik – Bagian 2: penerapan alat baru untuk identifikasi
dan penentuan prioritas bahan kimia munculnya kekhawatiran Arktik di
udara. Fisika Kimia Atmos. 2020;20:9031–49. https://doi.org/10.5194/
acp-20-9031-2020.
Catatan Penerbit Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim
yurisdiksi dalam peta yang diterbitkan dan afiliasi kelembagaan.