Laporan Praktikum Biokimia

STERILISASI, PEMBUATAN MEDIA DAN PEREMAJAAN BAKTERI

BAKHITAH NURUL RAMADHANI

H031 21 1007

KELOMPOK III

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
 MAKASSAR
2023
BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroba disebut juga dengan mikroorganisme. Mikroba bukan merupakan

nama dari suatu kelompok organisme seperti hewan dan tumbuhan. Tetapi istilah

ini digunakan untuk menyatakan suatu organisme dengan ukuran yang sangat

kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang, melainkan harus

menggunakan mikroskop. Umumnya bakteri, protozoa dan beberapa alga serta

fungi mikroskopik merupakan mikroba bersel tunggal. Bahkan mikroba yang

multiseluler pun tidak memiliki ukuran sel yang besar (Hafsan, 2011).

Mikroorganisme biasanya hidup dalam komunitas mikroba yang kompleks

dan aktivitasnya diatur oleh interaksi satu sama lain, dengan lingkungan mereka

serta dengan organisme lain (Madigan dkk., 2019).

Sterilisasi adalah proses penghancuran semua bentuk kehidupan, termasuk

spora. Proses ini membutuhkan larutan seperti fenol, alkohol, klorin atau yodium

yang diaplikasikan pada peralatan yang akan disterilkan. Proses sterilisasi termal

menggunakan uap jenuh di bawah tekanan berlangsung di suatu bejana yang

disebut autoklaf, dan merupakan proses sterilisasi yang paling banyak dilakukan.

Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang

ditambahkan ke dalam autoklaf (Tridianti dkk., 2013). Berdasarkan uraian di atas

maka dilakukanlah percobaan ini untuk mempelajari dan memahami tentang

sterilisasi alat dan bahan serta pembuatan media yang akan digunakan untuk
isolasi enzim ataupun isolasi bakteri demi menambah pengetahuan agar dapat

dikembangkan dan diterapkan pada saat melakukan penelitian.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

1.2.1 Maksud Percobaan

Maksud dari percobaan ini adalah untuk mempelajari dan memahami cara

sterilisasi dan pembuatan media serta peremajaan bakteri.

1.2.2 Tujuan Percobaan

Adapun tujuan dari percobaan ini adalah:

1. mengetahui dan mempelajari cara sterilisasi alat dan bahan,

2. mengetahui dan mempelajari cara pembuatan media Nutrient Agar,

3. mengetahui dan mempelajari teknik metode gores kuadran dalam peremajaan

bakteri Acinetobacter Calcoaceticus.

1.3 Prinsip Percobaan

1.3.1 Sterilisasi Alat

Prinsip dari percobaan ini adalah mengetahui sterilisasi alat dengan

menggunakan autoklaf pada suhu 121 oC dan tekanan 1 atm atau 15-20 psi selama

15 menit serta penyemprotan dengan etanol 70%.

1.3.2 Pembuatan Media

Prinsip dari percobaan ini adalah mengetahui pembuatan media

Nutrient Agar dengan cara pelarutan dan pemanasan, kemudian penuangan dalam

cawan petri dan tabung reaksi (media miring).

1.3.3 Teknik Penggoresan

Prinsip dari percobaan ini adalah mengetahui teknik metode gores kuadran

pada peremajaan bakteri dengan mengambil isolat bakteri menggunakan jarum

ose yang telah difiksasi dan digoreskan secara zig-zag pada media cawan petri dan

tabung reaksi (media miring).

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sterilisasi Alat dan Bahan

Sterilisasi adalah proses penghilangan atau membunuh mikroorganisme

(protozoa, fungi, bakteri, mycoplasma, virus) dalam benda/peralatan untuk

menjaga peralatan dilaboratorium tetap bersih/steril, serta mencegah terjadinya

kontaminasi. Peralatan laboratorium yang akan disterilisasi memerlukan bahan

pengemas. Kemasan adalah suatu benda yang digunakan sebagai wadah/tempat

yang dikemas dan dapat mencegah/mengurangi kerusakan, melindungi bahan

yang ada di dalamnya dari pencemaran serta gangguan fisik (Istin, 2020).

Saat ini, sterilisasi instrumen dapat dilakukan dengan autoklaf, perawatan

sinar gamma, paparan sinar UV dan penggunaan gas seperti etilen oksida,

hidrogen peroksida, formaldehida, asam perasetat. Setiap metode sterilisasi

memiliki kelebihan dan kekurangan. Autoklaf relatif cepat, sangat penetrasi dan

tidak menghasilkan residu beracun, tetapi suhu 121oC dapat merusak bahan yang

disterilkan. Perawatan kimia adalah suhu rendah dan efektif, tetapi prosedur ini

umumnya melibatkan penggunaan gas beracun yang mungkin bersifat

karsinogenik dan mudah terbakar. Selain itu, gas-gas tersebut terkadang

menyebabkan perubahan biokimia yang tidak diinginkan (Sakudo dkk., 2019).

Autoklaf (Autoclave) merupakan alat sterilisasi berbagai macam alat dan

bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas

bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau 1 atm dan
dengan suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan

benda adalah 15 pon tiap inchi (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama waktu

yang dibutuhkan untuk sterilisasi adalah 15 menit pada suhu 121 oC. Syarat suhu,

tekanan dan waktu tersebut akan mematikan mikroorganisme (Hafsan, 2014).

Autoklaf merupakan pressure cooker yang sangat efektif mematikan

mikroba karena pada suhu 121°C dapat melepaskan 686 kalori/g uap air.

Sterilisasi media menggunakan autoklaf dilakukan dengan cara memanfaatkan

uap air panas. Mekanisme kerusakan oleh panas ini ditandai dengan rusaknya

produksi rantaitunggal DNA akibat tekanan tinggi yang menyebabkan penetrasi

uap air ke dalam sel-sel mikroba menjadi optimal sehingga langsung

mematikan mikroba (Dewi dkk., 2017).

Prinsip proses sterilisasi dengan menggunakan autoklaf yaitu dengan

memanfaatkan panas dan tekanan dari uap air. Biasanya untuk mensterilkan media

menggunakan temperatur 121oC dengan tekanan 2 bar selama 15 menit. Alasan

mengapa digunakan temperatur 121oC karena pada saat itu menunjukkan tekanan

2 bar yang akan membantu membunuh mikroorganisme dalam suatu benda.

Tekanan pada atmosfer pada ketinggian di permukaan laut air mendidih pada

temperatur 100oC, sedangkan autoklaf yang diletakkan pada ketinggian yang

sama, menggunakan tekanan 2 bar maka air akan mendidih pada temperatur

121oC (Maulana dan Simanjuntak, 2021).

Salah satu elemen penting dalam sterilisasi menggunakan autoklaf uap air

adalah kehadiran uap air dan penembusannya ke dalam bahan selama sterilisasi.

Contoh spora membentuk organisme pada medium anhidrat tidak mati pada

temperatur di atas 121oC (temperatur yang biasa digunakan pada autoklaf saat

sterilisasi) bahkan setelah pemaparan 45 menit. Pada umumnya, temperatur lebih

tinggi dan periode pemaparan yang lebih panjang dibutuhkan untuk menghasilkan

sterilisasi dengan panas kering lebih panjang dimana prosesnya diluar uap air

pemaparannya pada 121oC selama 12 menit adalah efektif, sterilisasi panas kering

membutuhkan pemaparan pada 150 – 170oC selama 1-4 jam (Tungadi, 2017).

2.2 Media Nutrient Agar

Pertumbuhan dan perkembangan mikroba memerlukan substrat yang

disebut media. Mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik di dalam

media dengan persyaratan tertentu, yaitu di dalam media harus terkandung semua

unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan, media harus

mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan

kebutuhan mikroba, serta media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum

ditanami mikroba yang dimaksud tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak

diharapkan (Suriawiria, 2005). Bagian komposisi masing-masing media

menjelaskan bahan-bahan yang membentuk media, jumlahnya dan pH. Media

untuk kultur mikroorganisme memiliki sumber karbon untuk dimasukkan ke

dalam biomassa. Media autotroph dengan sumber karbon paling sering digunakan

adalah karbon dioksida, yang dapat disuplai sebagai bikarbonat di dalam medium.

Karbohidrat, seperti glukosa, atau senyawa organik lainnya, seperti asetat,

bermacam-macam lipid, protein, hidrokarbon dan senyawa organik lainnya

dimasukkan dalam media sebagai sumber karbon untuk heterotrof. Senyawa

lainnya, seperti ion NH4+, ion NO2-, unsur belerang (S), dan besi tereduksi, dapat

digunakan sebagai sumber energi untuk kultur autotrof (Atlas, 2005).

Media merupakan suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang

digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme baik dalam mengkultur

bakteri, jamur dan mikroorganisme lain. Suatu media dapat menumbuhkan

mikroorganisme dengan baik bila memenuhi persyaratan antara lain kelembapan

yang cukup, pH yang sesuai, kadar oksigen baik, media steril dan media harus

mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan mikroorganisme. Media yang

umum digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di laboratorium seperti

bakteri adalah media (NA) Nutrient Agar (Juariah dan Sari, 2018).

Nutrient Agar adalah media yang sering digunakan dalam pertumbuhan

bakteri. Bakteri yang digunakan merupakan suatu bakteri gram negatif dan bakteri

gram positif karena media Nutrient Agar sudah memiliki banyak sumber nutrisi

bagi pertumbuhan bakteri (Ramadhan dkk., 2021). Media Nutrient Agar dalam

pembuatannya menggunakan pelarut akuades, tetapi di daerah-daerah tertentu

masih belum terjangkau untuk mendapatkan akuades, selain harganya yang mahal

jangkauan untuk mendapatkan akuades tidaklah mudah karena alat untuk

pembuatan akuades masih cukup mahal, sehingga digunakan pelarut alternatif

yang mudah di jangkau dan di temui di daerah-daerah yaitu air minum dalam

kemasan (Bastian dkk., 2021).

Nutrient Agar merupakan suatu media padat dan merupakan perpaduan

antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia. Media Nutrient Agar terbuat

dari campuran ekstrak daging dan pepton dan menggunakan agar sebagai

pemadat. Nutrient Agar digunakan sebagai pemadat karena sifatnya yang mudah

membeku. Nutrient Agar mengandung karbohidrat berupa galaktan sehingga

tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme. Ekstrak daging dan pepton

digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber protein, nitrogen,

vitamin serta karbohidrat yangt dibutuhkan untuk tumbuh dan kembang

mikroorganisme (Fatmariza dkk., 2017).

 Media Nutrient Agar dibuat dengan tujuan sebagai media kultur isolat

bakteri. Sebelum membuat media nutrient agar, dilakukan sterilisasi petrydisk

di dalam autoclave selama ± 1 jam dengan suhu 121 ºC. Setelah itu, bahan media

agar dibuat dengan mencampurkan 2 gram nutrient broth (1%) dan 4 gram agar

(2%) ke dalam 200 mL air garam dan diaduk menggunakan magnetic stirrer.

Setelah bahan teraduk secara sempurna, erlenmeyer ditutup menggunakan kapas

dan alumunium foil dan disterilkan menggunakan autoclave dengan suhu 121ºC

selama ± 1 jam. Media yang sudah steril kemudian dituang secara aseptik ke

dalam petrydisk steril hingga permukaan petrydisk tertutup dengan media agar.

Selanjutnya, media agar didiamkan hingga mengeras dan ditutup menggunakan

cling wrap agar tidak terkontaminasi (Napitupulu dkk., 2019).

2.3 Isolasi Bakteri

Isolasi adalah pemindahan mikroorganisme dari lingkungan di alam

ke lingkungan baru dengan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam

media buatan. Pemindahan bakteri dari alam ke media pertumbuhan

dapat dilakukan dalam dua hal yaitu melalui pengenceran dan secara langsung

melalui media penyuburan (Ihsan, 2021). Bakteri adalah kelompok organisme

mikroskopis yang pada umumnya bersel tunggal dan tidak memiliki membran inti

sel (Febriza dan Adrian, 2021).

Bakteri merupakan mikroba prokariotik uniselular, termasuk kelas

Schizomycetes, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel.

Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang bersifat fotosintetik.

Cara hidup bakteri ada yang dapat hidup bebas, parasitik, saprofitik, patogen

pada manusia, hewan dan tumbuhan. Habitatnya tersebar luas di alam,

dalam tanah, atmosfer (sampai ±10 km di atas bumi), di dalam lumpur, dan

di laut (Suryani dan Taupiqurrahman, 2021). Sebagian besar bakteri memiliki

kromosom tunggal dengan bentuk sirkuler yang terdapat di sitoplasma. Bentuk sel

bakteri bermacam-macam yaitu bulat, batang dan spiral. Bakteri dapat ditemukan

pada berbagai jenis habitat dan memiliki banyak tipe metabolisme. Produk

metabolisme bakteri, seperti antibiotik, enzim, vitamin dan hormon banyak

dimanfaatkan dalam industri farmasi, pangan, dan pertanian (Kanti dkk., 2018).

Pemisahan mikroorganisme di luar lingkungan bertujuan untuk

mendapatkan biakan bakteri yang tidak lagi bercampur dengan bakteri lain

yang disebut biakan murni. Prinsip isolasi mikroba adalah memisahkan satu

jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai

mikroba. Isolasi mikroba bertujuan untuk memisahkan mikroba tertentu dari

lingkungan alamiahnya dan menumbuhkannya pada media buatan sehingga

diperoleh kultur murni. Kultur murni berguna di dalam mikrobiologi untuk

menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme dan menumbuhkannya sebagai

biakan murni (Mikdarullah dan Nugraha, 2017). Beberapa faktor yang perlu

diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba antara lain, sifat setiap jenis

mikroba yang akan diisolasi, tempat hidup atau asal mikroba, media tumbuh yang

sesuai, cara menginokulasi mikroba, cara inkubasi mikroba, pengujian mikroba

hasil isolasi sudah berupa biakan murni dan sesuai dengan yang dimaksudkan,

menjaga agar mikroba yang telah diisolasi tetap menjadi biakan murni (Jufri,

2020).

2.4 Peremajaan Bakteri

 Peremajaan bakteri untuk meregenerasi bakteri supaya dapat diperoleh

bakteri yang muda dan tidak terkontaminasi (Pinarsi dan Syukrilla, 2021). Bakteri

tersebut sebelumnya disimpan di lemari pendingin pada keadaan inaktif

pada media. Siklus pertumbuhan merupakan pertumbuhan teratur atau

berkesinambungan semua komponen suatu organisme. Fase tersebut dapat dibagi

menjadi 4 yakni fase pertama disebut fase adaptasi atau lag, yaitu fase

penyesuaian bakteri pada suatu lingkungan baru. Ciri dari fase ini yaitu tidak

terdapat peningkatan jumlah sel. Fase kedua yakni fase eksponensial atau log

merupakan fase terjadinya pembelahan sel, sehingga sel baru terus terbentuk

dengan laju yang konstan dan pertumbuhan secara eksponensial. Fase ketiga

adalah fase stationer yaitu fase terjadinya keseimbangan antara sel yang

membelah dengan sel yang mati. Fase terakhir yaitu fase kematian yang

merupakan fase jumlah sel mati meningkat. Hal tersebut dikarenakan faktor

ketidaktersediaan nutrisi baru dan terakumulasinya produk buangan yang bersifat

(Sari dkk., 2022).

Peremajaan dilakukan dengan cara mengambil 1 koloni tunggal kemudian

diinokulasikan pada media (Andarila dkk., 2018). Koloni tunggal yang terpisah

bewarna kuning, bentuk bulat kecil (Rosmania dan Yanti, 2020). Penginokulasian

dilakukan dengan menggunakan jarum ose kemudian buka mulut tabung media

kemudian goreskan secara merata pada media segera tutup dengan tutupnya

(Lestari dkk., 2020). Hasil peremajaan kemudian diinkubasi di dalam inkubator

dalam suhu dan waktu tertentu (Aviany dan Pujiyanto). Manfaat dari peremajaan

bakteri misalnya adalah daur ulang antibiotik yang membuat antibiotil lama dapat

digunakan kembali ketika resistensi dari antibiotik muncul (Coates dkk., 2019).
2.5 Bakteri Acinetobacter calcoaceticus

Acinetobacter calcoaceticus pertama kali dijelaskan pada tahun 1911

Beijerinck sebagai Micrococcus calco-aceticus. Acinetobacter adalah bakteri yang

tidak bisa bergerak (akinetos) karena kurangnya kemampuan motilitasnya. Bakteri

ini merupakan organisme aerob gram-negatif yang tersebar luas di lingkungan,

terutama di dalam tanah dan air. Bakteri ini juga dapat ditemukan pada kulit,

membran mukosa, sekret, dan lingkungan rumah sakit (Silvani dkk., 2018).

Acinetobacter calcoaceticus sebagai bakteri aerob membutuhkan oksigen untuk

pertumbuhannya. Sifat gram-negatifnya merujuk pada karakteristik dinding sel

bakteri yang mengambil pewarnaan warna merah muda atau merah pada tes

pewarnaan Gram. Hal ini berbeda dengan bakteri gram-positif yang akan

mengambil pewarnaan warna ungu atau biru. Acinetobacter calcoaceticus dikenal

sebagai organisme yang cukup tahan terhadap kondisi ekstrem dan mampu

bertahan dalam lingkungan yang beragam. Selain tanah dan air, bakteri ini juga

dapat hidup di permukaan kulit manusia serta membran mukosa (Silvani dkk.,

2018).
 BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan

Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah media nutrient agar

(yeast extract, NaCl, pepton), akuades, etanol 70%, spiritus, kapas, kain kasa,

plastik tahan panas, kertas HVS, aluminium foil, benang dan isolat bakteri

Acinetobacter Calcoaceticus.

3.2 Alat Percobaan

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah tabung reaksi, jarum ose,

enkas, pembakar spiritus, gelas kimia 50 mL, gelas ukur 100 mL, batang

pengaduk, neraca analitik, hot plate, spatula, autoklaf, cawan petri, erlenmeyer

250 mL, labu semprot, inkubator dan sikat tabung.

3.3 Prosedur Percobaan

3.3.1 Sterilisasi Alat

Alat yang akan disterilisasi dibersihkan dan dikeringkan. Tabung reaksi

dan cawan petri dibungkus dengan menggunakan kertas HVS. Semua alat yang
ingin disterilisasi dimasukkan ke dalam plastik tahan panas, kemudian

dimasukkan ke dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 oC dan tekanan 1

atm atau 15-20 psi.

3.3.2 Pembuatan Media Nutrient Agar

Media Nutrient Agar dibuat dengan 2% serbuk nutrient agar yang

dilarutkan dalam 100 mL akuades, kemudian dipanaskan di hot plate hingga larut

sempurna. Diukur pH larutan dan dicukupkan hingga mencapai pH 7 dengan

menggunakan NaOH atau HCl. Setelah itu, erlenmeyer ditutup penutup yang

sudah dibuat dan dilapisi dengan aluminium foil, kemudian direkatkan dengan

menggunakan plastic wrap. Setelah itu, dimasukkan ke dalam plastik tahan

panas, kemudian disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 oC dan pada tekanan

1 atm selama 15 menit. Masing-masing tabung reaksi dan cawan petri diisi

dengan media NA masing-masing 15-20 mL, ditunggu hingga media tersebut

padat.

3.3.3 Teknik Penggoresan

Media nutrient agar yang telah memadat pada tabung reaksi dan cawan

petri dilakukan penggoresan menggunakan metode goresan kuadran dengan

mengambil isolat bakteri menggunakan jarum ose yang telah difiksasi dan

digoreskan secara zig-zag pada media dengan hati-hati. Penggoresan dilakukan di

dalam enkas yang steril. Setelah itu, diinkubasi selama 4 hari dan diamati

pertumbuhan bakeri.
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Sterilisasi Alat

Berdasarkan hasil percobaan, dilakukan sterilisasi pada alat yang akan

digunakan dalam pembuatan media. Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah

untuk membebaskan alat yang akan digunakan dari bakteri (endospora). Sterilisasi

adalah suatu proses untuk membunuh semua mikroba yang ada sehingga jika

ditumbuhkan didalam suatu medium tidak ada lagi mikroba yang dapat

berkembang biak. Sterilisasi pada umumnya menggunakan autoklaf, yaitu alat

yang digunakan untuk mensterilkan suatu benda yang menggunakan uap dan

bertekanan tinggi selama kurang lebih 15 menit. Suhu yang tinggi inilah yang

akan membunuh mikroorganisme, terutama ditujukan untuk membunuh

endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri (Nugraha dkk., 2022).

Tabung reaksi dan erlenmeyer dibuatkan penutup terlebih dahulu menggunakan

kain kasa yang diisi dengan kapas lalu diikat dengan benang. Penutup yang baik

ditandai dengan bunyi saat kita melepaskan penutupnya dari tabung reaksi dan

erlenmeyer. Tujuan tabung reaksi dan erlenmeyer ditutup pada percobaan ini

adalah untuk menghindari terbentuknya uap air pada dinding dan bagian dalam

tabung reaksi dan erlenmeyer yang akan dimasukkan dalam autoklaf. Setelah itu,

tabung reaksi dan erlenmeyer dibungkus dengan menggunakan kertas agar alat

tidak akan pecah karena suhu dan tekanan yang tinggi saat dimasukkan ke dalam

autoklaf. Alat kemudian dimasukkan ke dalam plastik tahan panas. Hal ini

bertujuan agar kertas yang digunakan untuk membungkus alat tidak akan rusak

saat terkena uap air. Setelah itu, semua alat dimasukkan ke dalam autoklaf

dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama 15 menit. Kemudian enkas

disterilisasi dengan menyemprotkan etanol ke seluruh permukaannya. Etanol

digunakan pada percobaan ini karena efektif memecah protein yang ada dalam

mikroorganisme.

4.2 Pembuatan Media NA (Nutrient Agar)

Pada percobaan ini dilakukan pembuatan media dengan menggunakan

media Nutrient Agar (NA). Media Nutrient Agar dibuat dengan 2% serbuk

nutrient agar yang dilarutkan dalam akuades. Komposisi serbuk NA terdiri atas

pepton yang berfungsi sebagai media pertumbuhan yang merupakan sumber

nitrogen dan karbon bagi mikroorganisme, NaCl yang berfungsi sebagai sumber

mineral dan mengurangi kelarutan oksigen sehingga dapat mencegah

pertumbuhan mikroba aerob, beef extract yang berfungsi sebagai sumber karbon,

dan agar yang berfungsi sebagai bahan pemadat. Dimasukkan media NA ke dalam
erlenmeyer lalu dipanaskan di atas hot plate hingga larut sempurna. Pemanasan

bertujuan untuk mempercepat pelarutan media NA, Diukur pH larutan dan

dicukupkan hingga mencapai pH 7 dengan menggunakan NaOH atau HCl.

Pengukuran pH bertujuan agar pertumbuhan bakteri dapat bekerja pada pH

optimal, karena pH dapat mempengaruhi tinggi rendahnya densitas bakteri yang

dihasilkan. Setelah itu, ditutup erlenmeyer dengan menggunakan penutup yang

telah dibuat dan dimasukkan dalam plastik tahan panas. Media NA dalam

erlenmeyer kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 °C dan tekanan 1

atm selama 15 menit, karena pada suhu dan tekanan tersebut tidak akan ada

bakteri yang dapat hidup. Dimasukkan masing-masing 10-15 mL media NA yang

telah steril ke dalam tabung reaksi dan cawan petri kemudian didiamkan di dalam

enkas hingga media memadat.

4.3 Peremajaan Bakteri

Teknik peremajaan bakteri dengan goresan dilakukan untuk mengisolasi

mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium

baru. Teknik gores umunya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada

medium agar sehingga akan didapatkan koloni terpisah yakni biakan murni.

Percobaan ini menggunakan metode goresan kuadran. Daerah goresan kuadran

dibagi menjadi empat bagian menggunakan spidol pada bagian bawah cawan petri

dan diberi nomor. Teknik goresan dilakukan secara zig-zag tanpa terputus dengan

menggunakan jarum ose yang telah difiksasi. Setelah itu, cawan petri yang telah

diberi goresan diinkubasi selama beberapa hari, lalu dilihat pertumbuhan

bakterinya.
 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
 Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:

1. sterilisasi alat dan bahan yang digunakan pada proses isolasi menggunakan

alat autoklaf pada suhu 121 ºC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit.

2. pembuatan media dilakukan dengan cara melarutkan dan memanaskan bubuk

nutrient agar (beef extract, NaCl dan pepton) kemudian disterilisasi dalam

autoklaf dan dilakukan penggoresan serta inkubasi.

3. penggoresan pada media dilakukan dengan menggunakan metode goresan

kuadran dengan membagi cawan menjadi 4 bagian dan digoreskan secara

zig-zag pada media dengan menggunakan jarum ose yang telah difiksasi.

5. 2 Saran

5. 2.1 Saran untuk Laboratorium

Saran untuk laboratorium yaitu, sebaiknya alat dan bahan yang akan

digunakan sudah tersedia agar praktikum yang dilakukan lebih efisien.

5.2.2 Saran untuk Percobaan

Saran untuk percobaan yaitu sebaiknya media yang digunakan tidak hanya

media padat agar praktikan dapat mengetahui perbedaan hasil yang didapatkan

pada media padat maupun media cair.

DAFTAR PUSTAKA

Atlas, R.M., 2005, Handbook of Media for Environmental Microbiology 2nd

Edition, CRC Press, Boka Raton.
Andarilla, W., Sari, R. dan Apridamayanti, P., 2018, Optimasi Aktivitas
Bakteriosin yang Dihasilkan oleh Lactobacillus Casei dari Sotong
 Kering, Jurnal Pendidikan Informatika dan Sains, 7(2); 187-196.
Aviany, H.B. dan Pujiyanto, S., 2020, Analisis Efektivitas Probiotik di Dalam
Produk Kecantikan sebagai Antibakteri terhadap Bakteri Staphylococcus
epidermidis, Berkala Bioteknologi, 3(2); 25-30.
Bastian, Sari, I., dan Fitri, A., 2021, Analisa Jumlah Koloni Bakteri Escherichia
coli pada Media Nutrient Agar dengan Pelarut Akuades dan Air Minum
dalam Kemasan (AMDK), Jurnal Masker Medika, 9(1); 4555-459.
Coates, A.R., Hu, Y., Holt, J., dan Yeh, P., 2020, Antibiotic Combination Therapy
Against Resistant Bacterial Infections: Synergy, Rejuvenation and
Resistance Reduction, Expert review of Anti-infective therapy, 18(1);
5-15.
Dewi, T.M., Nurbaity, Suryatmana, P., dan Sofyan, E.T., 2017, Efek Sterilisasi
dan Komposisi Media Produksi Inokulan Fungi Mikoriza Arbuskula
terhadap Kolonisasi Akar, Panjang Akar dan Bobot Kering Akar Sorgum,
Jurnal Agro, 4(1); 24-31.
Fatmariza, M., Inayati, N., dan Rohmi, 2017, Tingkat Kepadatan Media Nutrient
Agar terhadap Pertumbuhan Bakteri Straphylococcus aureus, Jurnal
Analis Medika Bio Sains, 4(2); 69-73.
Febriana, M., Setyahadi, S., dan Churiyah., 2022, Purifikasi dan Karakterisasi
Enzim Kolagenase Dari Bacillus sp. KUB BPPT CC dengan
Menggunakan Substrat Kolagen dari Kulit Ceker Ayam, CERATA Jurnal
Ilmu Farmasi, 13(1); 1-9.
Febriza, M.A., dan Adrian, Q.J., 2021, Penerapan AR dalam Media Pembelajaran
Klasifikasi Bakteri, Jurnal BIOEDUIN: Program Studi Pendidikan
Biologi, 11(1); 10-18.
Hafsan, 2014, Mikrobiologi Analitik, Alauddin University Press, Makassar.
Hardono, T. dan Supriyadi, K., 2020, Modifikasi Autoclave Berbasis Atmega328
(Suhu), Jurnal Teknik Elektromedik Indonesia, 1(2); 59-65.
Ihsan, B., 2021, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Penerbit Insan Cendekia Mandiri,
Sumatera Barat.
Istin, 2020, Pemanfaatan Plastik Polipropilen Standing Pouch sebagai Salah Satu
Kemasan Sterilisasi Peralatan Laboratorium, Indonesian Journal of
Laboratory, 2(3); 41-46.
Jufri, R.F., 2020, Microbial Isolation, Journal La Lifesci, 1(1); 18-23.
Kanti, A., Ilyas, M., Nurkanto, A., Sulistiyani, T.R., dan Meliah, S., 2018,
Panduan Pengelolaan Koleksi Mikroorganisme, LIPI Press, Jakarta.
Lestari, G., Noptahariza, R. dan Rahmadina, N., 2020, Uji Aktivitas Antibakteri
Formulasi Sabun Cair Ekstrak Kulit Buah Durian (Durio Zibethinus L.)
 terhadap Bakteri Staphylococcus Aureus, Cendekia Journal of
Pharmacy, 4(2); 95-101.
Madigan, M.T., Bender, K.S., Buckley, D.H., dan Stahl, D.A., 2019, Brock
Biology of Microorganisms 15th Editon, Pearson Education, New York.
Maulana, D.A., dan Simanjuntak, R., 2021, Sistem Perawatan Mesin Autoclave,
Mecha Jurnal Teknik Mesin, 4(1); 1-5.
Mikdarullah, M. dan Nugraha, A., 2017, Teknik Isolasi Bakteri Proteolitik dari
Sumber Air Panas Ciwidey, Bandung, Buletin Teknik Litkayasa
Akuakultur, 15(1); 11-14.
Napitupulu, H.G., Rumengan, I.F.M., Wullur, S., Ginting, E.F., Rimper, J.R.T.S.,
dan Toloh, L.B.H., 2019, Bacillus sp. sebagai Agensia Pengurai dalam
Pemeliharaan Brachionus Rotundiformis yang Menggunakan Ikan
Mentah sebagai Sumber Nutrisi, Jurnal Ilmiah Platax, 7(14); 158-169.
Nugraha, A., Priyulida, F., dan Putra, E., 2022, Perancangan Autoclave Berbasis
Sistem Monitoring, Jurnal TEKESNOS, 4(1); 293
Pinarsi, E. dan Syukrilla, G., 2021, Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi N-Heksan,
Etil Asetat dan Air Daun Leunca (Solanum Nigrum L) terhadap Bakteri
(Staphylococus Aureus dan Escherichia Coli), Indonesia Natural
Research Pharmaceutical Journal, 6(1); 11-20.
Ramadhan, W., Juariah S., dan Ryani, V.O., 2021, Potensi Ubi Jalar Putih sebagai
Media Alternatif Pertumbuhan Bakteri, Jurnal Penelitian Farmasi
Indonesia, 1(10); 23-26.
Ramadhani, I.S., dan Wahyuni, 2020, Dasar-Dasar Praktikum Mikrobiologi,
CV. Pena Persada, Banyumas.
Rosmania, R. dan Yanti, F., 2020, Perhitungan Jumlah Bakteri di
Laboratorium Mikrobiologi Menggunakan Pengembangan Metode
Spektrofotometri, Jurnal Penelitian Sains, 22(2); 76-86.
Sakudo, A., Yagyu, Y., dan Onodera, T., 2019, Disinfection and Sterilization
Using Plasma Technology: Fundamentals and Future Perspectives for
Biological Applications, International Journal of Molecular Sciences,
20(5); 1-17.
Sari, I.J., dan Aryantha, I.N.P., 2021, Screening and Identification of Mushrooms
Growth Promoting Bacteria on Straw Mushrooms (Volvariella volvacea),
Journal of Tropical Biodiversity and Biotechnology, 6(1); 1-9.
Sari, R., Apridamayanti, P. dan Pratiwi, L., 2022, Efektivitas SNEDDS
Kombinasi Fraksi Etil Asetat Daun Cengkodok (Melasthoma
malabathricum)-Antibiotik terhadap Bakteri Hasil Isolat dari Pasien Ulkus
Diabetik, Pharmaceutical Journal of Indonesia, 7(2); 105-114.
Silvani, N.I., Samadin, K.H., dan Nita, A., 2018, Pola Kepekaan Bakteri
Acinetobacter calcoaceticus Terhadap Antibiotik pada Pasien Rawat Inap
RSUP Dr. Mohammad Hoesin Palembang, Biomedical Journal of
Indonesia, 4(3): 94-105.
Susiyanto, A.Y., Hitijahubessy, H., Samid, A., dan Cesar, O., 2021, Pengaruh
Ekstrak Lamun Enhalus Acoroides secara In Vitro sebagai Antibakteri
Vibrio sp. penyebab Penyakit Ice-Ice pada Rumput Laut Eucheuma
cottoni, MjoCE, 11(2); 93-98.
Suriawiria, U., 2005, Mikrobiologi Dasar, Papas Sinar Sinanti, Jakarta.
Suryani, Y., dan Taupiqurrahman, O., 2021, Mikrobiologi Dasar, Penerbit LP2M
UIN SGD, Bandung.
Tungadi, R., 2017, Teknologi Sediaan Steril, Sagung Seto, Jakarta.
Wahab, S., Bachri, S., Nugraha, A.F., dan Idrus, I., 2021, Kemampuan Senyawa
Bioaktif Formula Salep Ekstrak Metanol Curcuma aeruginosa Roxb dalam
menghambat Pertumbuhan Staphylococcus aureus Menggunakan Media
Nutrient Agar, JSSHA (Journal of Social Science, Humanities and
Humaniora), 1(1); 54-60.

Lampiran 1. Bagan Kerja

1. Sterilisasi Alat

Alat-alat gelas Larutan agar Jarum ose dan enkas

- dimasukkan dalam
 - disumbat dengan - dicelupkan jarum

penutup pocong. ose ke dalam etanol

- dibungkus alat alat dan dibakar hingga

gelas dengan kertas membara.

HVS. - disemprot enkas

- dimasukkan ke dengan alkohol

dalam autoklaf serta alat dan bahan

dengan mengatur yang akan

suhu 121oC dan dimasukkan ke

tekanan 2 atm atau dalamnya.

15-20 psi selama

15 menit.

Alat dan bahan steril

2. Pembuatan Media NA

a. Pembuatan Media Nutrient Agar Miring

Serbuk Nutrient Agar

 - dilarutkan dengan komposisi 2% ke dalam 100 mL akuades di

dalam erlenmeyer.

- dipanaskan diatas hot plate hinggah mendidih.

- disterilkan di dalam autoklaf dengan suhu 121oC pada tekanan 2

atm atau 15-20 psi selama 15 menit.

- dituangkan pada tabung reaksi dan cawan petri masing-masing

sebanyak 10-15 mL.

- didiamkan dalam enkas dan ditunggi hingga media padat.

Media Nutrient Agar

b. Pembuatan Media Luria Broth (LB)

0,1% pepton, 0,1% NaCl dan 0,005% yeast extract

- dilarutkan ke dalam 100 mL akuades di dalam erlenmeyer.

- disterilkan di dalam autoklaf dengan suhu 121 oC pada tekanan

2 atm atau 15-20 psi selama 15 menit.

- dituangkan pada tabung reaksi dan cawan petri masing-masing

sebanyak 10-15 mL.

Media Luria Broth

3. Teknik Penggoresan

a. Goresan Sinambung

Media Nutrient Agar

 - dipanaskan ujung ose hingga berwarna jingga-merah.

- disentuhkan beberapa kali pada pinggiran media NA hingga

ujung jarum ose sedikit dingin.

- diambil koloni sebanyak 1 ose.

- digoreskan pada media NA secara zig-zag.

Hasil Goresan Sinambung

b. Goresan T

Media Nutrient Agar

- dibagi media menjadi 3 daerah.

- dipanaskan ujung ose hingga berwarna jingga-merah.

- disentuhkan beberapa kali pada pinggiran media NA hingga

ujung jarum ose sedikit dingin.

- diambil koloni sebanyak 1 ose.

- digoreskan pada daerah pertama secara zig-zag dan dilanjutkan

dengan daerah kedua hingga ketiga tanpa terputus.

Hasil Goresan T

c. Goresan Kuadran

Media Nutrient Agar

 - dibagi media menjadi 4 daerah.

- dipanaskan ujung ose hingga berwarna jingga-merah.

- disentuhkan beberapa kali pada pinggiran media NA hingga

ujung jarum ose sedikit dingin.

- diambil koloni sebanyak 1 ose.

- digoreskan pada daerah pertama secara zig-zag dan dilanjutkan

dengan daerah kedua hingga keempat tanpa terputus.

Hasil Goresan Kuadran

d. Goresan Radian

Media Nutrient Agar

- dibagi media menjadi 4 daerah.

- dipanaskan ujung ose hingga berwarna jingga-merah.

- disentuhkan beberapa kali pada pinggiran media NA hingga

ujung jarum ose sedikit dingin.

- diambil koloni sebanyak 1 ose.

- digoreskan pada daerah pertama secara zig-zag tanpa terputus.

- diangkat jarum ose dan dilanjutkan dengan beberapa goresan

vertikal di atas goresan sebelumnya.

Hasil Goresan Radian

Lampiran 2. Dokumentasi Percobaan

 Gambar 1. Hasil Peremajaan Bakteri pada Cawan Petri

Gambar 2. Hasil Peremajaan Bakteri pada Tabung Reaksi