Band Hilang

• Jumlah atau konsentrasi RNA yang dimuat pada gel tidak mencukupi.
• RNA terdegradasi; Hindari kontaminasi nuklease.
• Elektroforesis gel untuk waktu yang lebih singkat, gunakan voltase yang lebih rendah,
atau gunakan gel dengan persentase yang lebih tinggi.

Smear
• RNA-nya terdegradasi.
• Terlalu banyak RNA yang dimuat pada gel à mengurangi jumlah RNA.
• Kondisi elektroforesis yang digunakan tidak tepat à periksa apakah buffer
elektroforesis yang digunakan memiliki kapasitas buffer yang cukup.
• RNA terkontaminasi dengan protein/DNA à menggunakan ekstraksi fenol untuk
menghilangkan protein sebelum elektroforesis.
• Pita RNA kecil menyebar selama pewarnaan à gunakan etidium bromida selama
elektroforesis.

Guideline
Tidak ada band
1.1. Pewarnaan yang tidak memadai.
• Gunakan 2x loading dye u/ ladder RNA RiboRulerTM konvensional dan preparasi
sampel RNA sebelum elektroforesis.
• Pewarnaan tambahan dengan etidium bromida (konsentrasi akhir 0,5 g/ml)
direkomendasikan.
• Jika RNA dipisahkan pada gel agarosa glioksal/DMSO yang mendenaturasi, warnai gel
dalam larutan etidium bromida (konsentrasi akhir 0,5 g/ml) dalam amonium asetat
0,5 M selama 15-30 menit setelah elektroforesis. Cuci gel dalam larutan amonium
asetat 0,5 M segar selama 15-30 menit.
1.2. Tidak ada pewarnaan.
• Jika Anda menggunakan pewarna pemuatan yang tidak mengandung etidium
bromida, tambahkan etidium bromida ke gel agarosa dan buffer elektroforesis pada
konsentrasi akhir 0,5 g/ml.
• Sebagai alternatif, warnai gel setelah elektroforesis dengan etidium bromida (0,5
g/ml etidium bromida) selama 20 menit, atau SYBR® Green II (ikuti rekomendasi
pemasok).
1.3. Jumlah ladder dimuat tidak mencukupi.
• Ikuti rekomendasi untuk pemuatan yang dijelaskan dalam sertifikat analisis tangga
RiboRulerTM RNA (0,25 l per mm jalur gel untuk tangga konvensional; 0,5 l per mm
jalur gel untuk tangga siap pakai).
1.4. degradasi RNA.
• Minimalkan paparan sinar UV karena hal ini dapat menyebabkan degradasi/fading
RNA.
• RNA, termasuk ladder RNA RiboRulerTM, sangat sensitif terhadap degradasi oleh
ribonuklease.
• Direkomendasikan penggunaan buffer elektroforesis segar, gel yang baru dituang,
larutan yang diolah dengan DEPC, dan sarung tangan pelindung.
1.5. difusi RNA dari gel.
• Hindari elektroforesis yang berkepanjangan atau prosedur pewarnaan dan destaining
yang berlebihan karena hal ini dapat menyebabkan difusi fragmen RNA yang lebih
kecil dari gel.
• Hindari penyimpanan jangka panjang gel sebelum dokumentasi foto, karena ini dapat
menyebabkan difusi fragmen RNA dan pita memudar.
1.6. RNA telah kehabisan gel.
• Hentikan elektroforesis setelah bromofenol biru melewati dua pertiga panjang gel.
• Pada kebanyakan sistem gel agarosa yang mendenaturasi, bromofenol biru bermigrasi
sedikit lebih cepat dari 5S rRNA dan xilena cyanol FF bermigrasi sedikit lebih lambat
dari 18S rRNA.
• Pastikan tangki elektroforesis berada dalam posisi vertikal sepenuhnya.

Smear
2.1. degradasi RNA oleh nuklease.
• RNA, termasuk ladder RNA RiboRulerTM, sangat sensitif terhadap degradasi oleh
ribonuklease.
• Direkomendasikan penggunaan buffer elektroforesis segar, gel yang baru dituang,
larutan yang diolah dengan DEPC, dan sarung tangan pelindung.
2.2. Penyimpanan atau ladder RNA yang tidak tepat.
• Simpan tangga RiboRulerTM RNA pada -20°C selama 6 bulan atau pada -70°C selama
24 bulan. Mencairkan tangga di atas es.
2.3. Kedalaman gel atau volume sampel yang berlebihan.
• Gunakan gel tipis (~0,5 cm) dan hindari memuat volume besar di jalur gel.
2.5. ladder RNA yang berlebihan dimuat ke gel.
• Ikuti rekomendasi untuk pemuatan yang dijelaskan dalam sertifikat analisis tangga
RiboRulerTM RNA (0,25 l per mm jalur gel untuk tangga konvensional; 0,5 l per mm
jalur gel untuk tangga siap pakai).
2.6. Gel yang tidak terendam sempurna.
• Selalu pastikan bahwa ada cukup buffer elektroforesis dalam peralatan elektroforesis.
2.4. Kondisi elektroforesis yang tidak tepat.
• Pastikan ada cukup buffer elektroforesis dalam peralatan elektroforesis dan gel
terendam seluruhnya.
• Jangan gunakan tegangan yang terlalu tinggi untuk elektroforesis. Jalankan gel
agarosa pada 5 V/cm (gel poliakrilamida/urea pada 8 V/cm). Untuk meningkatkan
ketajaman pita, gunakan tegangan yang lebih rendah selama beberapa menit di awal
elektroforesis.
• Namun, tegangan yang sangat rendah selama seluruh proses dapat mengakibatkan
difusi pita.

High background staining

4.1. Konsentrasi etidium bromida yang terlalu tinggi atau pewarnaan yang berkepanjangan.
• Gunakan etidium bromida pada konsentrasi akhir 0,5 g/ml. Hindari pewarnaan gel
yang berkepanjangan.
4.2. Pewarnaan gel tidak mencukupi.
 • Jika gel diwarnai secara ekstensif dengan etidium bromida, destaining tambahan
dalam air diperlukan untuk menghilangkan pewarnaan latar belakang.
• Cuci gel agarosa glioksal/DMSO setelah pewarnaan dalam larutan amonium asetat 0,5
M segar selama 15-30 menit.

TRISure
Kontaminasi RNA
- Pemisahan antara fase organic dan aquous kurang hati2 à pastikan saat memipet
tidak terbawa fase aquousnya
- Ketidaktepatan saat membuang fase aquous à sebisa mungkin fase aquous ini
dihilangkan saat pemisahan walau sedikit mungkin

Yield RNA rendah

- Homogenisasi saat lisis sampelnya tidak tepat à kurangi jumlah bahan awal saat lisis
sel jangan terlalu banyak tapi pastikan akan cukup
- Masalah solubilisasi RNA, pelete à tingkatkan solubilisasinya dengan Teknik pipetting
dan panaskan sampel di 60oC
- Kehilangan pellet à jika sampel awal sedikit memang akan susah melihat peletnya,
jadi hati-hati saat memisahakan pellet dengan supernatannya.

Absorbansi Rendah
- Volume TRIsure sedikit
- Kontaminasi fase interphase à aquous phase pastikan dihilangkan