LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI (PENGENCERAN), PEMURNIAN, DAN IDENTIFIKASI CENDAWAN

ADELIA APRILIANI AHMAD

M021221057

NAMA ASISTEN

MUH. YUSRIL SURYAMSYAH, S.HUT

SAIDIL
FARDHATILLAH
CHERY PRATIWI IRWAN
RIFKA ZHAFIRA
LIDIA NATALI
SAKILA AGUS SALIM

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI DAN PEMULIAAN POHON

PROGRAM STUDI REKAYASA KEHUTANAN
FAKULTAS KEHUTANAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2024
 ii

DAFTAR ISI

SAMPUL.................................................................................................................... i
DAFTAR ISI.............................................................................................................. ii
DAFTAR GAMBAR................................................................................................. iii
BAB I PENDAHULUAN............................................................................................1
I. Latar Belakang....................................................................................................... 1
I.1 Tujuan................................................................................................................ 2
I.2 Kegunaan.......................................................................................................... 2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA..................................................................................3
2.1 Pengambilan sampel........................................................................................3
2.2 DNA.................................................................................................................. 3
2.3 Ekstraksi dan isolasi DNA.................................................................................5
BAB III METODE PRAKTIKUM..............................................................................12
3.1 Waktu dan Tempat.........................................................................................12
A. Pengambilan Sampel....................................................................................12
B. Ekstraksi dan isolasi DNA.............................................................................12
3.2 Alat dan Bahan............................................................................................... 12
A. Alat................................................................................................................ 12
B. Bahan............................................................................................................ 12
3.3 Prosedur Praktikum........................................................................................ 13
A. Pengambilan Sampel.....................................................................................13
B. Ekstraksi dan isolasi DNA..............................................................................13
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................................14
4.1 Pengambilan Sampel......................................................................................14
4.2 Ekstraksi dan isolasi DNA...............................................................................16
BAB V PENUTUP................................................................................................... 15
5.1 Kesimpulan..................................................................................................... 15
5.2 Saran.............................................................................................................. 15
DAFTAR PUSTAKA............................................................................................... 16
LAMPIRAN............................................................................................................. 17
 iii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Persiapan pengambilan sampel............................................................17

Gambar 2. Pengambilan sampel............................................................................17
Gambar 3. Penggunaan alat centrifuge..................................................................17
Gambar 4. Penggunaan alat mikropipet.................................................................17
 1

BAB I
PENDAHULUAN

3.1 Latar Belakang

Pengambilan contoh daun sangat penting peranannya untuk mengetahui
apakah suatu unsur hara pada tanaman dalam keadaan optimal atau tidak.
Kebutuhan hara tanaman dapat diketahui melalui analisis jaringan tanaman.
Pemupukan merupakan salah satu kegiatan pemeliharaan tanaman yang
berperan penting terhadap produktivitas tanaman. Penggunaan sampel biasanya
berupa organ tanaman muda karena diketahui dapat menghasilkan ekstrak DNA
yang bagus. Biologi Sel dan Molekuler merupakan bidang ilmu yang terus
menerus berkembang. Ilmu ini bermanfaat hampir di semua bidang. Baik dalam
bidang medis untuk menangani kelainan-kelainan genetik dan penemuan obat-
obat baru, pada bidang pertanian, peternakan, kehutanan untuk meningkatkan
produk produk baik tanaman maupun hewan unggul maupun di bidang lingkungan
dalam hal mengatasi polutan serta perannya dalam kemajuan produksi pangan.
DNA merupakan asam nukleat yang di dalamnya terkandung materi genetik.
Pada organisme hewan maupun tumbuhan DNA terdapat pada inti sel dan
organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. DNA memiliki fungsi dan peranan
yang penting yakni mengatur perkembangan biologis seluruh kehidupan secara
seluler (Anhar, 2021).
Isolasi DNA merupakan teknik yang penting dalam pengembangan ilmu
biologi molekuler. Derajat kemurnian dan kualitas dalam isolasi DNA sangat
mempengaruhi hasil yang akan diperoleh. Isolasi DNA memiliki prinsip utama
yang terbagi menjadi tiga yaitu lisis atau penghancuran, ekstraksi atau tahapaan
memisahkan DNA dari bahan lain dan tahap terkahir yakni pemurnian. Dalam
melakukan isolasi DNA terdapat banyak cara yang dapat dilakukan, akan tetapi
tidak semuanya dapat diterapakan pada semua jenis tanaman. Secara umum,
prosedur ekstraksi yang baik untuk isolasi DNA mencakup tiga hal penting, yaitu
harus bisa dihasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNA nya harus utuh,
dan jumlahnya mencukupi (konsentrasi tinggi). Isolasi DNA juga merupakan
langkah pertama dalam studi sekuen DNA dari populasi DNA kompleks dan
dalam analisis struktur genom dan ekspresi gen. Kuantitas, kualitas dan integritas
DNA akan mempengaruhi hasil yang diperoleh secara langsung.
Dalam melakukan isolasi DNA terdapat banyak cara yang dapat dilakukan,
akan tetapi tidak semuanya dapat diterapakan pada semua jenis tanaman.
Ekstraksi DNA merupakan bagian yang sangat penting dalam ativitas pemuliaan
berbasis molakuler. Untuk menuju tahapan setelahnya sangat diperlukan DNA
yang memiliki kualitas dan kuantitas yang baik (Listihani, et al., 2018).
Praktikum yang dilakukan adalah praktikum ekstraksi dan isolasi DNA yang
dilakukan untuk memisahkan DNA dari komponen sel lainnya seperti protein,
lemak dan cairan seluer lainnya termasuk zat ekstraktif. Isolasi dan ekstraksi DNA
berguna untuk beberapa analisis molekuler dan rekayasa genetika seperti genom
editing, transformasi dan PCR. Kemampuan mengekstraksi DNA sangat penting
untuk mempelajari penyebab genetik penyakit tanaman, terutama dalam hal ini
adalah sampel tanaman dari pohon Swietenia machrophylla.
 2

3.2 Tujuan
1. Mengetahui dan memahami metode pengambilan sampel daun molekuler.
2. Mengetahui dan memahami apa itu DNA
3. Mengetahui dan mempelajari teknik ekstraksi dan isolasi DNA.
3.3 Kegunaan Praktikum
Pengambilan sampel, ekstraksi dan isolasi DNA diharapkan mampu
meningkatkan pemahaman praktikan mengenai metode yang tepat dalam
pengambilan sampel di lapangan, memahami langkah-langkah tekhnik ekstraksi
dan isolasi DNA untuk memisahkan DNA dari komponen sel lainnya seperti
protein, lemak, dan cairan seluler lainnya termasuk zat ekstraktif.
 3

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengambilan Sampel

Pengambilan contoh daun sangat penting peranannya untuk mengetahui
apakah suatu unsur hara pada tanaman dalam keadaan optimal atau tidak.
Kebutuhan hara tanaman dapat diketahui melalui analisis jaringan tanaman.
Pemupukan merupakan salah satu kegiatan pemeliharaan tanaman yang
berperan penting terhadap produktivitas tanaman. Penggunaan sampel biasanya
berupa organ tanaman muda karena diketahui dapat menghasilkan ekstrak DNA
yang bagus. Kayu dan kulit kayu juga berpotensi sebagai sumber DNA karena
sifatnya yang mudah didapat (Listihani, et al., 2018)
Pengambilan sampel yang akurat mensyaratkan pemilihan bagian tanaman
tertentu pada tahap perkembangan tanaman tertentu. Mengumpulkan sampel
tanaman yang baik untuk diagnosis penyakit penting untuk memastikan diagnosis
yang akurat. Pengambilan sampel dari jaringan hidup yang bergejala sangatlah
penting. Pengambilan sampel dari berbagai jaringan seperti akar, batang, dan
daun sangat membantu ketika patogen penyebab gejala tidak diketahui. Patogen
dapat hidup di jaringan tertentu atau berpindah di antara jaringan tanaman
sepanjang siklus hidupnya, sehingga akses ke berbagai jaringan meningkatkan
kemungkinan menemukan penyebab masalahnya (Wilisiani, 2014).
Daun yang tidak boleh dijadikan sampel adalah daun yang sakit atau mati,
jaringan tanaman yang dirusak oleh serangga dan peralatan mekanis, jaringan
tanaman yang tertekan oleh suhu dingin, panas, atau kelembapan yang
berlebihan, serta tanaman sampel daun yang sangat muda atau tua. Sampel
daun yang tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda dipilih untuk ekstraksi dan
isolasi DNA karena kedua kondisi tersebut dapat mempengaruhi kualitas dan
kuantitas DNA yang diperoleh. Daun yang terlalu tua cenderung mengalami
degradasi DNA. Proses alami seperti perubahan kimia dan aktivitas enzimatik
dalam daun yang sudah tua dapat menyebabkan kerusakan pada DNA, sehingga
sulit untuk diekstraksi dengan baik. DNA yang terdegradasi dapat menghasilkan
hasil yang tidak akurat atau rendah dalam isolasi DNA. Di sisi lain, daun yang
terlalu muda mungkin tidak mengandung jumlah DNA yang mencukupi untuk
diekstraksi. Meskipun daun muda umumnya memiliki DNA yang relatif baik dalam
kondisi tidak terdegradasi, jumlahnya mungkin kurang karena ukuran dan
kedewasaan sel yang lebih kecil. Ini dapat mengakibatkan rendahnya kuantitas
DNA yang dapat diekstraksi dari sampel tersebut (Faatih, 2009).
Daun yang tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda cenderung memiliki
kualitas DNA yang lebih baik, mengandung jumlah DNA yang cukup untuk dii
ekstraksi, memungkinkan keseragaman hasil isolasi DNA, serta hasil yang lebih
efisien. DNA dalam daun yang tidak terlalu tua biasanya kurang terdegradasi,
sementara DNA dalam daun yang tidak terlalu muda sudah cukup berkembang
untuk memberikan kuantitas yang cukup untuk isolasi. Dengan demikian, memilih
daun yang berada di antara kedua ekstrem tersebut memungkinkanuntuk
 4

memperoleh DNA dengan kualitas dan kuantitas yang optimal, serta

memaksimalkan efisiensi proses isolasi (Hanifa, et al., 2021).
Morfologi daun Swietenia mahagoni termasuk ke dalam daun yang tidak
lengkap dengan bagian terlebar pada pangkal daun yang tidak bertoreh, bangun
daunnya yang bulat telur dan memiliki panjang 3- 15 cm. Ujung dan pangkal daun
meruncing, pertlangan daun yang menyirip sehingga daunnya termasuk golongan
daun majemuk menyirip genap, tepi daun rata, daging daun seperi kertas, warna
daun hijau tua dengan permukaan atas yang licin mengkilap dan permukaan
bawahnya yang licin suram. Filotaksis daunnya Folia opposita, yaitu terdapat dua
daun yang saling berhadapan pada tempat melekatnya daun atau nodus. daun
mahoni merupakan daun majemuk dengan bentuk lonjong, ujung runcing dan
pangkal berduri. Panjang pelat bervariasi dari 35-50 cm. Daun muda mahoni
berwarna merah dan kemudian berubah menjadi hijau saat dewasa. Mahoni baru
berbunga ketika tanaman berumur 7 tahun (Rizko, et al., 2020).
2.2 DNA
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi gen etik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan
terdapat di dalam inti sel dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria
dan kloroplast. DNA merupakan senyawa makro molekul yang terdiri dari polimer
nukleotida. Setiap nukleotida memiliki tiga komponen utama, yaitu gugus
phosphate, gula deoksiribosa dan basa nitrogen. DNA memiliki fungsi sebagai
wadah informasi genetik dan pewarisan sifat/karakteristik dari suatu organisme.
Pada tanaman, DNA terletak di dalam nukleus, kloroplas dan mitokondria.
Berbeda dengan sel hewan, sel tumbuhan memiliki dinding sel kaku yang terbuat
dari bahan berserat keras dan mengandung senyawa yang dapat mengganggu
isolasi DNA. Struktur DNA adalah berupa dua rantai polinukleotida yang
berbentuk seperti tangga berpilin,setiap anak tangga ini terdiri atas pasangan
basa adenine (A), guanine (G), cytosine (C), dan thymine (T). Adenin selalu
berpasangan dengan thymine, cytosine selalu berpasangan dengan guanine.
DNA tersimpan di dalam inti sel, sehingga disebut genom DNA inti. Contohnya,
genom DNA inti manusia tersusun sekitar tiga miliar pasang basa dengan panjang
kira-kira 3 meter. DNA tersimpan di dalam inti sel, sehingga disebut genom DNA
inti. Contohnya, genom DNA inti manusia tersusun sekitar tiga miliar pasang basa
dengan panjang kira-kira 3 meter. Apabila dibandingkan dengan ukuran sel, maka
panjang DNA bisa mencapai 300 ribu kali diameter sel yang mengandungnya.
Meski demikian, DNA tetap berada dalam inti sel karena mengalami pengepakan
sedemikian rupa. Sebagai materi genetik, DNA harus mampu menyimpan
informasi genetik dan bisa meneruskan informasi tersebut secara tepat keturunan
makhluk hidup dari generasi ke generasi. Fungsi ini adalah fungsi genotipik yang
dilakukan melalui replikasi, DNA bertugas mengatur perkembangan fenotipe
organisme. Materi genetik harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasi
organisme mulai dari zigot sampai individu dewasa. Fungsi ini adalah fungsi
fenotipik yang dilakukan melalui ekspresi gen. DNA sewaktu-waktu harus bisa
 5

mengalami perubahan sehingga organisme yang bersangkutan dapat beradaptasi

dengan kondisi lingkungan yang berubah. Tanpa adanya perubahan seperti itu,
maka evolusi tidak akan pernah berlangsung (Litkayasa, 2020).
Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome
inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria
(mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria serta DNA genom
kloroplast berasal dari kloroplast. Perbedaan diantara ketiganya adalah DNA
nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon.
Sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak
berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas
memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis
induk. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan
sifat dari kedua induk.. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda
dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan
berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein
histon. Metabolit sekunder dan polisakarida juga dapat menghambat aktivitas
enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim retriksi dan dapat mengganggu
proses amplifikasi DNA dengan PCR akibat penghambatan aktivitas taq
polymerase. Oleh karena itu diperlukan suatu teknik isolasi DNA genom tanaman
yang tepat sehingga diperoleh kualitas DNA yang baik bagi proses amplifikasi
PCR. Kuantitas DNA dapat di lakukan dengan tehnik elektroforesis menggunakan
gel agarose, Pengenceran total DNA menjadi 10 ng/μl sebagai larutan stock kerja
PCR, proses Amplifikasi DNA melalui Teknik PCR, proses Casting Gel dan
analisis data dilakukan berdasarkan hasil scoring pola pita DNA yang muncul
pada plate. Polimorphic Information Content (PIC) berdasarkan terminology nilai
PIC ini sama dengan nilai diversitas gen (Sembiring, et al., 2023)
Pemisahan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat
dilakukan melalui ekstraksi. Penggunaan nitrogen cair lebih memudahkan proses
ekstraksi, namun ekstraksi dengan bufer CTAB ditambah 0,2% β-mercaptoetanol
dan PVP mampu mengurangi broning. Ekstraksi dengan bufer ini tidak
memerlukan nitrogen cair dan menghasilkan DNA genom yang cukup baik.
Ekstraksi tanpa nitrogen cair lebih efisien, terutama bagi laboratorium yang sulit
mendapatkan nitrogen cair (Litkayasa, 2020).
2.3 Ekstraksi dan Isolasi DNA
Teknik molekuler bervariasi dalam cara pelaksanaan untuk mendapatkan
data, baik tekniknya maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai
kemudahan pelaksanaan, ketersediaan sumber daya manusia, fasilitas, dan
dana. Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan satu
kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam
pencandraan sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman
yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol .Ada tiga langkah
utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA
dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Teknik
 6

molekuler juga bervariasi tergantung cara pelaksanaan untuk mendapatkan data

maupun tingkatan target data yang diinginkansesuai kemudahan pelaksanaan,
kapabilitas sumber daya manusia, fasilitas dan peralatan sertakecukupan
finansial. Selain itufaktor-faktor di atas, maka masalah biaya selalumenjadi faktor
penghambat, karena harga bahankimia yang sangat mahal serta pengadaannya
yang memakan waktu sangat lama, karena pada umumnya bahan kimia yang
diperlukan adalah produk impor. Dengan memperhatikan permasalahan tersebut,
maka perlu dilakukan inovatif-terobosan penelitian yang dapat memberikan solusi,
khususnya untuk tanaman tahunan atau tanaman yang mengandung fenoltinggi,
di antaranya dengan cara memodifikasi metode-metode yang sudah ada. Baik
dalam hal pemakaian bahan kimia maupun pengaturan annealing temperature
pada saat running Polimerase Chain Reaction (PCR) pada tingkat yang paling
optimal (Harnelly. et al., 2021)
Kualitas DNA yang baik yang diperoleh dari hasil ekstraksi merupakan
syarat dasar yangharus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam penanda
sidik jari DNA. Setil Trimetil Amonium Bromida (CTAB) merupakan metode yang
umum digunakan dalam ekstraksi DNA tanaman yang banyak mengandung
polisakarida dan senyawa polifemol. Investigasi genetika kehutanan molekuler
dimulai dari proses ekstraksi DNA. Kualitas DNA genom yang diekstraksi secara
optimal menjadi tolak ukur keberhasilan analisis penanda molekuler. Ekstraksi
DNA adalah teknik untuk mengeluarkan DNA dari inti sel atau organel sel seperti
DNA kloroplas dan DNA mitokondria, fungsinya untuk memisahkan DNA murni
dari protein, karbohidrat dan lemak. DNA dapat diekstraksi dari sampel yang
masih segar, beku, dikeringkan maupun disimpan dalam alkohol atau buffer.
Sampel tanaman segar lebih direkomendasikan untuk memperoleh DNA yang
berkualitas baik. Sampel ekstraksi DNA tumbuhan umumnya berasal dari organ
muda dan lunak seperti daun, kuncup, bunga, tunas atau cambium ( Anhar, 2021)
Teknik atau metode yang digunakan dalamisolasi DNA semakin
berkembang dan beragam,tergantung dari jenis tanaman dan jaringan tanaman
yang digunakan. Tetapi pada dasarnya adatiga faktor penentu dalam ekstraksi
dan pemurnian DNA secara optimal. Penghomogenan jaringan tanaman,.
komposisi penambahan larutan buffer pada saat penggerusan daun/jaringan
tanaman sampel, dan penghilangan enzim penghambat polisakarida khususnya
untuk tanaman tahunan. Tanaman yang mengandung senyawa metabolit
sekunder yang cukup tinggi, seperti getah dan polifenol, begitu juga dengan
tanaman jambu mete, maka perlu dilakukan modifikasi teknik dan penggunaan
bahan kimia pada saat ekstraksi dan isolasi DNA untuk mendapatkan kuantitas
DNA yang banyak dengan kualitas tinggi (Hairuddin, 2013)
Isolasi DNA merupakan salah satu tahap penting dalam kegiatan
memperoleh informasi genetik dan analisis genetik.DNA dengan kualitas yang
baik digunakan untuk kegiatan seperti pemanfaatan marka molekuler,
pembuatan pustaka genom, hingga sekuensing.Prinsip isolasi DNA terdiri dari tiga
tahapan, yaitu: lisis dinding dan membran sel, pemisahan atau purifikasi DNA,
dan presipitasi DNA. Permasalahan utama yang sering muncul dalam
 7

proses isolasi DNA tanaman adalah kandungan senyawa polisakarida,

polifenol, protein, RNA, dan senyawa metabolit sekunder yang
terdapat pada tanamanyang dapat menghambat tahapan isolasi DNA.
Metode Doyle and Doyle dengan penambahan CTAB yang digunakan pada
penelitian bertujuan untuk memudahkan dalam ektraksi DNA
tanaman.Keunggulan metode Doyle and Doyle adalah mudah, biaya murah,
cepat serta hasil isolasi DNA memiliki kemurnian dan konsentrasi yang baik
dibandingkan dengan metode isolasi tanaman lainnya (Faatih, 2019)
Tinggi rendahnya konsentrasi DNA yang dihasilkan dalam proses ekstraksi
DNA juga dapat disebabkan oleh beberapa faktor pada metode yang telah
dimodifikasi seperti faktor suhu inkubasi, suhu yang terlalu tinggi dapat merusak
DNA sedangkan jika suhunya terlalu rendah akan mengakibatkan membran sel
tidak dapat hancur. Faktor lainnya adalah waktu inkubasi. Jika waktu inkubasi
DNA terlalu lama maka akan merusak DNA dan jika terlalu sebentar maka tidak
dapat menghancurkan membran dan jaringan sel. konsentrasi DNA akan
berdampak pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi DNA yang terlalu
rendah akan menghasilkan fragmen yang sangat tipis pada gel atau bahkan tidak
terlihat secara visual, sebaliknya konsentrasi DNA yang terlalu tinggi akan
menyebabkan fragmen terlihat tebal sulit dibedakan antara satu fragmen dengan
fragmen lainnya. Konsentrasi hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh 2 faktor yaitu
kecepatan ekstraksi pada waktu ekstraksi dan komposisi penambahan lisis bufer.
Faktor kecepatan ekstraksi merupakan faktor paling berpengaruh karena pada
tahap lisis sel dan presipitasi pengambilan supernatant harus dilakukan per
sampel, sehingga beberapa sampel terjadi pengendapan DNA maupun sisa-sisa
guanidina yang biasanya terdapat pada kit. Namun hal ini dapat dihindari dengan
pembersihan pedestal dan uji blanko dengan bufer elusi yang sama dengan
sampel sebelum proses pengujian. Konsentrasi DNA yang besar pula tidak
menjamin bahwa DNA tersebut murni, sehingga perlu dilihat nilai kemurniannya.
Nilai kemurnian DNA diperlukan untuk menilai derajat kontaminasi dari DNA yang
dihasilkan (Buchori, et al.,2023).
DNA genom dapat diekstraksi dengan berbagai macam teknik. Pada
prinsipnya, sel harus dipecah terlebih dahulu menggunakan beberapa agensia,
baik secara fisik maupun kimiawi. Senyawa yang sering digunakan untuk
memecah sel pada isolasi DNA genom adalah CTAB. Senyawa CTAB biasanya
digunakan untuk ekstraksi DNA dari jaringan tanaman. Setelah sel dipecah
selanjutnya dilakukan ekstraksi dan pemurnian DNA (Yuwono, 2008). Teknik
pemecahan sel dapat dibagi dalam metode fisik, metode mekanik dan metode
kimiawi (Sudjadi, 2008). Sel diperlakukan dengan pemaparan senyawa kimiawi
yang mempengaruhi dinding sel. Metode kimiawi lebih banyak digunakan untuk
preparasi DNA. Dalam suatu teknik ekstraksi DNA masih diperlukan suatu
tahapan untuk meminimalkan senyawa-senyawa kontaminan yang dapat
mengganggu reaksi PCR seperti polisakarida dan metabolit sekunder. Hal ini
disebabkan keberadaan polisakarida dan metabolit sekunder dalam sel tanaman
sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat. Kandungan senyawa sekunder
 8

dalam sel tanaman berbeda-beda, maka setiap tanaman membutuhkan prosedur

ekstraksi yang optimal untuk memperoleh DNA genom yang layak digunakan
dalam proses analisis molekuler. Ekstraksi DNA bertujuan memisahkan DNA
dengan komponen lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Proses-proses
dalam ekstraksi DNA memiliki fungsinya masing-masing, diantaranya: Beberapa
kandungan dalam senyawa yang digunakan dalam ekstraksi DNA dengan metode
CTAB diantaranya: EDTA merupakan chelating agents. EDTA akan mengikat
ionion logam yang merupakan kofaktor DNase dan protein lain yang dapat
mendegradasi DNA. Hydranate akan berikatan dengan protein dan
memisahkannya dari DNA dengan kekuatan ionik. Secara bersamaan bahan-
bahan ini akan memisahkan protein dari DNA dan melindungi DNA dari
kerusakan. Pada saat dilakukan penggerusan, bahan tanaman yang akan
diisolasi DNAnya dilarutkan dalam larutan CTAB. Hal ini dimaksudkan untuk
menghindari adanya degradasi nukleolitik yang disebabkan karena adanya D
Nase. CTAB memiliki beberapa peranan, yaitu membantu merusak membran,
juga akan berikatan dengan muatan positif protein kromosomal sehingga DNA
akan dilepaskan ke dalam larutan dan EDTA pada CTAB akan segera
menonaktifkan DNase. CTAB mengandung NaCl. Garam akan meminimalkan
daya ikatan antara DNA dan protein dengan merusak keseimbangan muatan
negatif dan positif antara keduanya. Dengan demikian DNA akan lebih mudah
dipisahkan. Garam akan berikatan dengan gugus fosfat DNA yang bermuatan
negatif yang dapat membantu DNA mengendap pada saat pemberian ethanol
absolute dingin (Faatih, 2009).
Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan
berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian
atas tabung. Tehnik sentrifugasi dilakukan oleh mesin sentrifugasi dengan
kecepatan yang bervariasi. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam
fraksi yang terpisah, yaitu supernatan di bagian atas dan pelet di bagian bawah.
Klorofom dan isoamil alkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan
mengendapkan komponen polisakarisa didalam bufer ekstrasi yang
mengkontaminasi larutan DNA. Ethanol 70% berfungsi untuk mengeluarkan
endapan garam karena NA+ bermuatan positif dan DNA bermuatn negatif.
Pemberian isoprofanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga
terjadi presipitasi. Presipitasi Merupakan langkah yang dilakukan untuk
mengendapkan suatu komponen dari campuran. Pengeringan pelet DNA
berfungsi untuk mengeringkan pelet dari sisa-sisa bufer maupun etanol. Bufer TE
berfungsi melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah
rusak. Dalam bufer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa
pengkelat yang mengikat ion magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk
aktivitas berbagai enzim nuclease. Pada dasarnya semua metode ekstraksi
memiliki prinsip yang sama yaitu penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan
DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian, hanya saja
setiap metode merancang senyawa-senyawa yang berbeda sesuai dengan
 9

kebutuhan teknik ekstraksi yang semakin berkembang. Adapun fungsi-fungsi

senyawa dalam metode D Neasy Plant Mini Kit diantaranya: Bufer AP1 (cell lysis
buffer) berfungsi melisis sampel, bufer AP2 berfungsi untuk merusak kandungan
protein dalam sampel, buffer AW1 dan AW2 berfungsi untuk membersihkan
sampel dari sisa-sisa bahan ekstraksi. Buffer AE berfungsi sebagai pelarut DNA
yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak (Hanifa, et al., 2021).
 10

BAB III
METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum pengambilan sampel molekuler ini dilakukan pada hari sabtu, 02
maret 2024 pukul 08.00 – selesai yang bertempat di tegakan mahoni, Hutan
Pendidikan, Fakultas Kehutanan, Universitas Hasanuddin.. Praktikum selanjutnya
yaitu praktikum ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan 3 hari berturut- turut pada hari
rabu - jumat, pada tanggal 20-22 maret 2024 pukul 09:50 – selesai yang
bertempat di Laboratorium Bioteknologi dan Pemuliaan Pohon, Fakultas
Kehutanan, Universitas Hasanuddin.
3.2 Alat dan Bahan
A. Alat
1. Mortar dan pistil, untuk menggerus sampel daun molekuler.
2. Vortex, untuk menghomogenkan ekstrak daun dan larutan.
3. Tube, sebagai wadah sampel dan larutan.
4. Centrifuge, untuk memisahkan supernatant dan pellet DNA.
5. Gabus, sebagai wadah tube untuk pengeringan
6. Mikropipet, untuk memindahkan larutan dengan ukuran tertentu.
7. Mikrotips, alat yang digunakan pada mikropipet pada saat proses pipetting.
8. Timbangan analitik, untuk menimbang sampel daun molekuler dengan
ukuran tertentu.
9. Waterbath,
B. Bahan
1. Sampel daun, sebagai bahan yang akan dilakukan pengujian ekstraksi dan
isolasi DNA.
2. Buffer CTAB
3. CIA (Kloroform Isoamil Alkohol)
4. Isopropanol
5. Natrium asetat
3.3 Prosedur Praktikum
A. Pengambilan sampel
Adapun metode pengambilan sampel dalam studi molekuler tanaman yaitu,
sebagai berikut:
1. Pemilihan jenis sampel tanaman, yaitu Swietenia machrophylla
2. Memilih daun atau jaringan tanaman yang tidak terlalu muda dan tidak tua,
dalam keadaan sehat (tidak terdapat bercak maupun tanda penyakit
tanaman)
3. Potong menggunakan gunting steril
4. Sampel kemudian dimasukkan kedalam amplop cokelat, kemudian
dimasukkan kedlam plastik sampel.
5. Sampel yang telah diambil dimasukkan kedalam coolbox dan siap dibawa
ke laboratorium.
6. Sampel disimpan didalam freezer untuk mencegah kerusakan sel.
 11

7. Sampel siap dilanjutkan ke tahapan ekstraksi dan isolasi DNA.

B. Ekstraksi dan Isolasi DNA

a) Proses perusakan dinding sel
1. Menghaluskan sampel daun tanpa tulang daun menggunakan mortar dan
pistil.
2. Sampel daun yang sudah dihaluskan diambil ditimbang sebanyak 0,1 g,
ditambahkan buffer CTAB sebanyak 500 µl, kemudian dihomogenkan
menggunakan vortex selama 15 detik.
3. Tube yang berisi larutan diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65°C
selama 120 menit, divortex setiap 30 menit.
4. Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan kloroform isoamil-alkohol (24:1)
100 µl.
5. Tube di centrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit.
6. Supernatan dipindahkan ke tube kemudian ditambahkan isopropanol 800
µl.
7. Centrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.
8. Supernatan dibuang dari tube lalu dikeringkan selama 24 jam.

b) Proses pemisahan DNA dengan komponen Lainnya

1. Ditambahkan buffer TE 500 µl ke dalam tube yang telah dikeringkan
kemudian di centrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.
2. Supernatan dipindahkan ke tube baru kemudian ditambahkan kloroform
100 µl lalu di centrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.
3. Supernatan dipindahkan ke tube baru kemudian ditambahkan natrium
asetat 100 µl + isopropanol 800 µl lalu di centrifuge dengan kecepatan
10.000 rpm selama 10 menit.
4. Kemudian supernatan dibuang dan endapan diambil lalu dikeringkan
selama 24 jam.

c) Proses pemurnian DNA

1. Ditambkan buffer TE 1x, 100 µl ke dalam tube yang telah dikeringkan.
2. Setiap DNA total yang diperoleh ditambahkan R Neasy 4 µl ke dalam tube,
lalu disentrifugasi selama ± 15 detik.
3. Hasil DNA master disimpan dalam freezer.
 12

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel yang akurat mensyaratkan pemilihan bagian tanaman
tertentu pada tahap perkembangan tanaman tertentu. Mengumpulkan sampel
tanaman yang baik untuk diagnosis penyakit penting untuk memastikan diagnosis
yang akurat. Pengambilan sampel dari jaringan hidup yang bergejala sangatlah
penting. Pengambilan sampel dari berbagai jaringan seperti akar, batang, dan
daun sangat membantu ketika patogen penyebab gejala tidak diketahui. Patogen
dapat hidup di jaringan tertentu atau berpindah di antara jaringan tanaman
sepanjang siklus hidupnya, sehingga akses ke berbagai jaringan meningkatkan
kemungkinan menemukan penyebab masalahnya (Rizko, et al., 2020).
Daun yang tidak boleh dijadikan sampel adalah daun yang sakit atau mati,
jaringan tanaman yang dirusak oleh serangga dan peralatan mekanis, jaringan
tanaman yang tertekan oleh suhu dingin, panas, atau kelembapan yang
berlebihan, serta tanaman sampel daun yang sangat muda atau tua. Sampel
daun yang tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda dipilih untuk ekstraksi dan
isolasi DNA karena kedua kondisi tersebut dapat mempengaruhi kualitas dan
kuantitas DNA yang diperoleh. Daun yang terlalu tua cenderung mengalami
degradasi DNA. Proses alami seperti perubahan kimia dan aktivitas enzimatik
dalam daun yang sudah tua dapat menyebabkan kerusakan pada DNA, sehingga
sulit untuk diekstraksi dengan baik. DNA yang terdegradasi dapat menghasilkan
hasil yang tidak akurat atau rendah dalam isolasi DNA. Di sisi lain, daun yang
terlalu muda mungkin tidak mengandung jumlah DNA yang mencukupi untuk
diekstraksi. Meskipun daun muda umumnya memiliki DNA yang relatif baik dalam
kondisi tidak terdegradasi, jumlahnya mungkin kurang karena ukuran dan
kedewasaan sel yang lebih kecil. Ini dapat mengakibatkan rendahnya kuantitas
DNA yang dapat diekstraksi dari sampel tersebut.
Daun yang tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda cenderung memiliki
kualitas DNA yang lebih baik, mengandung jumlah DNA yang cukup untuk dii
ekstraksi, memungkinkan keseragaman hasil isolasi DNA, serta hasil yang lebih
efisien. DNA dalam daun yang tidak terlalu tua biasanya kurang terdegradasi,
sementara DNA dalam daun yang tidak terlalu muda sudah cukup berkembang
untuk memberikan kuantitas yang cukup untuk isolasi. Dengan demikian, memilih
daun yang berada di antara kedua ekstrem tersebut memungkinkanuntuk
memperoleh DNA dengan kualitas dan kuantitas yang optimal, serta
memaksimalkan efisiensi proses isolasi (Listihani, et al., 2018).
Proses pengambilan sampel ini dilakukan dengan aseptik. Pengambilan
sampel daun molekuler Swietenia machrophylla dilakukan dengan mengambil 4
sampel pohon, masing-masing 15 daun setiap pohon. Daun yang dijadikan
sampel sesuai dengan kriteria sampel, yaitu tidak terlalu tua dan tidak terlalu
muda, daun dalam keadaan sehat (tidak terdapat tanda penyakit tanaman seperti
bercak pada daun). Sampel diambil dalam keadaan steril, dan tidak menyentuh
 13

tanah. Pemeriksaan kesehatan daun dilakukan menggunakan handscoon agar

sampel tetap dalam keadaan steril. Setelah mendapatkan sampel dengan jumlah
dan kriteria yang diinginkan, sampel tersebut dimasukkan kedalam amplop coklat.
Amplop coklat biasanya terbuat dari bahan yang dapat melindungi sampel dari
paparan cahaya yang berlebihan. Paparan cahaya yang berlebihan dapat
menyebabkan degradasi atau kerusakan pada materi genetik, seperti DNA. Oleh
karena itu, amplop coklat dapat membantu menjaga kestabilan sampel selama
penyimpanan atau pengiriman sampel sehinggan menjaga sampel tidak
kontaminan. Setelah itu dimasukkan kedalam plastic sampel lalu dimasukkan
kedalam coolbox untuk pengiriman sampel. Tujuan pewadahan sampel dalam
coolbox adalah agar sampel yang diambil tidak mengalami perubahan kondisi
baik secara fisika, kimia, ataupun biologi pada saat pengiriman. Sampel juga
dimasukkan kedalam freezer agar tidak rusak. Sampel tersebut didiamkan dalam
freezer untuk dilakukan tahapan praktikum selanjutnya.
4.2 Ekstraksi dan Isolasi DNA
Pemisahan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat
dilakukan melalui ekstraksi. Penggunaan nitrogen cair lebih memudahkan proses
ekstraksi, namun ekstraksi dengan bufer CTAB ditambah 0,2% β-mercaptoetanol
dan PVP mampu mengurangi broning. Ekstraksi dengan bufer ini tidak
memerlukan nitrogen cair dan menghasilkan DNA genom yang cukup baik.
Ekstraksi tanpa nitrogen cair lebih efisien, terutama bagi laboratorium yang sulit
mendapatkan nitrogen cair (Hanifa, 2021).
Ekstraksi DNA menggunakan nitrogen cair untuk melisis dinding sel dapat
mengeluarkan semua isi sel yang kemudian ditampung dalam larutan penyangga
yang berisi Tris HCl dan EDTA. Dinding sel juga dapat dipecahkan dengan
penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan penghangatan pada
suhu 65°C. Detergen seperti sodium dodecil sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB
dapat digunakan untuk proses lisis (Subandiyah 2006). Penggunaan bufer CTAB
sebagai pengganti nitrogen cair untuk ekstraksi dapat menghasilkan produk DNA
yang berkualitas. Dengan demikian, bufer CTAB dapat digunakan untuk
mengisolasi DNA pada tanaman Swietenia machrophylla.
Proses ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan dengan tiga tahap yaitu proses
perusakan dinding sel (lisis), proses pemisahan DNA dengan komponen lainnya,
dan proses pemurnian DNA. Pada tahapan lisis, dilakukan dengan menggerus
sampel daun tanpa tulang daun. Proses menggerus ini menghabiskan waktu
kurang lebih selama 2 jam untuk menghasilkan tekstur yang sangat halus.
Kemudian dihomogenkan dengan larutan buffer CTAB yang berfungsi untuk
memecahkan dinding sel dan menghasilkan produk DNA yang berkualitas.
Setelah dihomogenkan dan inkubasi, ditambahkan CIA (kloroform isoamil alcohol)
yang berfungsi untuk mengekstrak dan mengendapkan komponen polisakarisa di
dalam buffer ekstraksi yang mengkontaminasi larutan DNA (Ningrum, 2008) dan
dilakukan proses sentrifugasi untuk mendapatkan supernatan yang akan
dikeringkan selama 24 jam. Selanjutnya proses pemisahan DNA dilakukan untuk
mendapatkan endapan dari supernatan. Proses ini melibatkan larutan buffer TE. .
 14

Bufer TE berfungsi melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak
mudah rusak. Dalam bufer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai
senyawa pengkelat yang mengikat ion magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan
untuk aktivitas berbagai enzim nuclease , kloroform, natrium asetat, dan
isopropanol. Hasil endapan ini kemudian dikeringkan selama 24 jam. Pengeringan
pelet DNA berfungsi untuk mengeringkan pelet dari sisa-sisa bufer maupun
etanol. Tahap akhir yaitu proses pemurnian DNA untuk mendapatkan hasil DNA
murni yang kemudian disimpan kedalam freezer.
 15

BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
1. Pengambilan sampel adalah langkah pertama dan aspek penting dari
keseluruhan proses analisis. Pengambilan sampel dilakukan dengan
menggunakan 3 pohon Swietenia machrophylla sebagai sampel praktikum.
Sampel yang diambil terdapat 45 daun, dengan masing-masing pohon
memiliki 15 sampel daun. Sampel pohon yang diambil memiliki kriteria dalam
keadaan sehat ( tidak terdapat tanda penyakit tanaman ), dan merupakan
daun yang tidak terlalu tua tetapi juga tidak terlalu muda. Ketiga sampel
tersebut dimasukkan dalam 3 amplop coklat berbeda yang sudah di berikan
penanda dan disatukan kedalam plastik sampel. Dalam pengirimannya,
disimpan dalam coolbox agar sampel tetap aman dalam proses pengiriman.
Sampel tersebut disimpan dalam freezer, untuk dilakukan tahapan praktikum
selanjutnya.
2. DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi gen etik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA merupakan senyawa makro molekul yang terdiri dari
polimer nukleotida. Setiap nukleotida memiliki tiga komponen utama, yaitu
gugus phosphate, gula deoksiribosa dan basa nitrogen. DNA memiliki fungsi
sebagai wadah informasi genetik dan pewarisan sifat/karakteristik dari suatu
organisme. Pada tanaman, DNA terletak di dalam nukleus, kloroplas dan
mitokondri. DNA berupa dua rantai polinukleotida yang berbentuk seperti
tangga berpilin,setiap anak tangga ini terdiri atas pasangan basa adenine
(A), guanine (G), cytosine (C), dan thymine (T). Adenin selalu berpasangan
dengan thymine, cytosine selalu berpasangan dengan guanine.
3. Prinsip dasar dari tahapan ekstraksi dan isolasi DNA yaitu penghancuran
dinding dan membran sel, kemudian mengeluarkan DNA didalam nukleus
tanpa menyebabkan kerusakan pada DNA. Proses ekstraksi DNA dibagi
menjadi beberapa tahap yaitu persiapan materi yang akan digunakan, proses
penghancuran sel, penghilangan senyawa kontaminan, dan pengumpulan
DNA. Dalam proses pemghacuran dinding dan membran sel digunakan
buffer yang mampu mendegradasi dinding sel seperti Cetyl Trimethyl
Ammonium Bromide (CTAB). Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA,
yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, dan tahap akhir yaitu pemurnian DNA.
5.2 Saran
Pada praktikum selanjutnya, sebaiknya dapat mempertahankan materi yang
disampaikan dengan lebih baik lagi.
 16

DAFTAR PUSTAKA

Buchori, A., Firmansah, H., Anika, M., Ratnawati, S., Ulfa, U. T., & Zendrato, Y.
(2023). Agriculture and Biological Technology Komparasi Metode Ekstraksi
DNA Menggunakan Daun Padi: Review. In Agriculture and Biological
Technology (Vol. 1, Issue 1).
Faatih Jurusan Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Surakarta Jl
Yani Tromol Pos I Pabelan Kartasura Surakarta, M. A. (n.d.) (2009) Isolasi
Dan Digesti Dna Kromosom Isolation And Digestion Of Chromosomal Dna.
Harnelly, E., & Anhar, A. (2021). Optimalisasi Metode Ekstraksi Dna Daun, Kulit
Kayu Dan Kayu Pinus Merkusii Jungh. Et De Vriese Optimization Of Dna
Extraction Methods of Leaves, Wood Skins and Wood Pine merkusii Jungh.
Et de Vriese. JFP Jurnal Ilmiah Mahasiswa Pertanian, 6(4).
www.jim.unsyiah.ac.id/JFP
Hairuddin, R. (2013). Analisis Dna Pada Tanaman Gandum (Triticumaestivum l.).
Hanifa, Y. R., Pujiyanto, S., Ferniah, R. S., & Kusumaningrum, H. P. (2021).
Identifikasi Molekuler Jeruk Nipis Tegal Berdasarkan Fragmen Gen 18s
Ribosomal RNA. Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia (JBBI), 8(2), 244-
254.
Litkayasa, T., (2020) Pada Balai, N., Tanaman, P., Tropika, B., Raya, J., & Km, S.
A. (n.d.). Kotak Pos 5 Solok 27301.
Listihani, L., Damayanti, T. A., Hidayat, S. H., & Wiyono, S. (2018). Karakterisasi
Molekuler Papaya ringspot virus tipe P pada Tanaman Mentimun di Jawa.
Jurnal Fitopatologi Indonesia, 14(3), 75.
Rizko, N., Pancasakti Kusumaningrum, H., Siti Ferniah, R., Pujiyanto, S., Erfianti,
T., Nurunnisa Mawarni, S., Tri Rahayu, H., & Khairunnisa, D. (2020). 6 Isolasi
DNA Daun Jeruk Bali Merah (Citrus maxima Merr.) dengan Modifikasi
Metode Doyle and Doyle. In Berkala Bioteknologi (Vol. 3, Issue 2).
Sembiring, E. R., Terryana, R. T., Anggraheni, Y. G. D., Prihaningsih, A., Batubara,
I., Nurcholis, W., Ridwan, T., & Harmoko, R. (2023). Efektivitas Metode
Ekstraksi DNA pada Daun Segar dan Kering dari Tanaman Obat. Vegetalika,
12(3), 211.
Simatupang, D. F., Situmorang, M., & Saputra, H. (2023). Identifikasi Gulma
Sembung Rambat Berbasis Molekuler. Justek: Jurnal Sains dan Teknologi,
6(1), 79-86.
Wilisiani, F., Somowiyarjo, S., & Hartono, S. (n.d.). Identifikasi Molekuler Virus
Penyebab Penyakit Daun Keriting Isolat Bantul Pada Melon Molecular
Identification Of Virus Causing Leaf Curl Disease Bantul Isolate On Melon.
 17

LAMPIRAN

Gambar 1. Persiapan pengambilan Gambar 2. Pemilihan sampel

sampel

Gambar 3. Penggunaan alat Centrifuge Gambar 4. Penggunaan alat

mikropipet