TEORI PEWARNAAN SECARA UMUM

Zat warna dipakai untuk pengecatan

jaringan atau untuk afinitas jaringan dan
reagen.
Jika komponen jaringan dikatakan
mempunyai afinitas yang tinggi berarti
dalam keadaan di bawah kondisi
komponen itu membutuhkan pewarnaan
yang lebih kuat.
Afinitas kekuatan daya tarik ikatan antara
warna dan jaringan.
a) Sitologi:
b) Giemsa
c) Papaniculaou
d) Ziehl Nielsen, dll
2. Histopatologi:
a) Hematoksilin-Eosin
b) Histokimia:
Gomori/Threechrom untuk melihat colagen
PAS
PAS Diastase
Congo Red
PTAH
Van Gieson,dll
 Interaksi Contoh dalam praktek
Interaksi pelarut Sistem pulasan yang
pelarut menggunakan zat
Ikatan Hydrophobic warna cair atau
reagen organik
substrat enzim
Pulasan
Interaksi pewarna Metachromatic
pewarna dengan warna
dasar,Gomoritype
enzim histokimia,
impregnasi perak
 Interaksi Reagen Pengecatan asam
Jaringan dan basa,reagen ionik
Daya tarik lainnya,termasuk
garam anorganik
Coulombic
(elektrostatik) Paling baik pada
molekul besar seperti
Reaksi van der pulasan jaringan
Waals elastis
Pulasan polysacarida
Ikatan Hydrogen seperti glycogen oleh
asam carminic dari
larutan non-air

Metode seperti
Ikatan Covalent Feulgen nucleal, PAS,
dan mercury orange
 Daya tarik Coulombic: berasal dari daya
tarik-menarik kation(bahan pewrna) dengan
anion (jaringan yang kaya akan DNA , RNA,
karboksilasi dan mukosubstan)
Ikatan Van der Waals: menggambarkan
daya tarik intermolekuler yang mervariasi
termasuk kutub yng mempengaruhi kutub
lainnya dengan daya tersebar.
Beberapa faktor yang menyebabkan
pewarnaan tidak merata pada tiap
jaringan:
Banyaknya sisi yang terkena dan
afinitasnya
Tingkat penyerapan reagen
Tingkat reaksi
Tingkat kehilangan reagen
Metachromasia dan kejadian yang
menyertainya
Pewarnaan jaringan mewarnai inti sel dan
sitoplasma.
Inti sel hematoksilin dan toluidin blue
Sitoplasma eosin, orange G dan safranin.
Berdasarkan afinitas antara jaringan dengan zat
warna yang digunakan, dapat dikelompokkan
menjadi dua, yaitu:
Direct stain ( pewarnaan langsung )
yaitu jaringan dan zat warna dapat berikatan
secara langsung, misalnya : toluidin dan
safranin

Indirect stain ( pewarnaan tidak langsung )

yaitu zat warna tidak dapat berikatan secara
langsung, agar dapat berikatan antara
jaringan dengan zat warna maka harus diberi
mordan, misalnya : hematoksilin + aluminium /
besi / tembaga.
Pewarnaan rutin yang paling sering
digunakan hematoksilin eosin
- pewarnaan yang alamiah
- dapat dikombinasikan dengan
aluminium, besi, krom, tembaga atau
garam tungsten yang sangat baik untuk
pewarnaan inti
 Kata hematoxylin is berasal dari bahasa
Yunani, Haimato (blood) and Xylon (wood),
karena getah pohonnya merah tua gelap,
dan metode pembuatannya dari kayunya.

Hematoxylin pewarna alami yg diekstraksi

dari rebusan kayu asal Amerika Selatan yaitu
pohon logwood (Haematoxylon
campechianum), dan dimurnikan dalam
bentuk kristal .
Berdasarkan mordan yang digunakan, hematoksilin
dibagi menjadi :
Alum hematoksilin ( Mayer's, Harris, Ehrlich,
Delafield, Cole's, Carazzi's, Gill's )
Iron hematoksilin ( Weigert's, Heidenhain's,
Loyez, Verheff's )
Tungsten hematoksilin
Molybdenum hematoksilin
Hematoksilin Lead
Hematoksilin tanpa mordan
 Paling banyak digunakan terutama
pewarnaan hematoksilin dan eosin yang
menghasilkan pewarnaan inti yang baik.
Mordan yang digunakan adalah
aluminium dalam bentuk aluminium
potasium sulfate atau ammonium alum /
aluminium ammonium sulfate.
Semua pulasan inti berwarna merah,
yang secara umum dikonversikan menjadi
biru kehitaman ketika apusan dicuci dalam
larutan basa/alkali lemah
 Alum hematoksilin :

bersifat regresif potongan jaringan yang

kelebihan pewarnaan kemudian dimasukkan ke
dalam asam alkohol untuk pembiruan inti
hematoksilin harris

bersifat progresif melakukan pewarnaan inti

tapi latar belakang/sitoplasma tidak diwarnai
hematoksilin mayer
 Tiga jenis alum haematoxylin yang utama dan
sering digunakan adalah:
1. Ehrlich's haematoxylin,
2. Harris's haematoxylin,
3. Mayer's haematoxylin.
Istilah haemalum lebih dissukai dibandingkan dengan
"haematoxylin" karena haematein adalah product
oxidation dari haematoxylin, gabungan antara ion
aluminium I sebagai pewarnaan kompleks yang
aktif.
Alum haematoxylin solutions impart to the nuclei of
cells a light transparent red stain that rapidly turns
blue on exposure to any neutral or alkaline liquid.
 Bahan hematoksilin berupa bubuk warna
kecoklatan yang susah larut dalam air, tetapi
mudah dilarutkan dalam ethyl alcohol (1
gm/100ml air dan 30-40 gm/100 ml alcohol).
Bahan pewarna aktif bukan hematoksilin saja,
tetapi juga produk oksidasinya hematein.
Hematein ada juga yang menjual
sediaannya, tetapi sangat mahal. Hasil
pewarnaannya sama dan lebih mudah
mengoksidasi sendiri produk hematoksilin
kasar.
Pada pewarnaan ini, garam besi (iron salts)
digunakan bersama-sama dengan
hematoksilin sebagai oksidasi agen
sebagai mordan.
Iron salts yang paling sering digunakan ferric
chloride dan ferric ammonium sulfate.
Macam-macam iron hematoksilin yang sering
digunakan adalah :
Hematoksilin weigerts
Hematoksilin heidenhains
Hematoksilin loyez untuk myelin
Hematoksilin verheffs untuk serabut
elastin
 1. Secara progresif
Masukkan slide berisi sayatan jaringan berturut-turut
kedalam :
Xylol : 2 menit
Xylol : 2 menit
Etanol absolut : 1 menit
Etanol absolut : 1 menit
Etanol 95% : 1 menit
Etanol 95% : 1 menit
Air mengalir : 10-15 menit
 Mayers Hematoksilin :15 menit
Air mengalir :20 menit
Eosin :15 dtk 2 menit
Etanol 95% :2 menit
Etanol 95% :2 menit
Etanol absolut :2 menit
Etanol absolut :2 menit
Xylol :2 menit
Xylol :2 menit
Xylol :2 menit
Mounting dengan entellan, tutup dengan
coverglass.
 2. Secara regresif
Masukkan sayatan jaringan berturut-turut ke
dalam :
Xylol : 2 menit
Xylol : 2 menit
Etanol absolut : 1 menit
Etanol absolut : 1 menit
Etanol 95% : 1 menit
Etanol 95% : 1 menit
Air mengalir : 10 - 15 menit
Harris Hematoksilin: 15 menit
 Air mengalir : 10 menit
Alkohol asam 1% : 3 -10 celup
Air mengalir : 10 menit
Air amonia/litium carbonat : 3-10 celup
Air mengalir : 20 menit
Eosin : 15 dtk - 2 menit
Etanol 95% : 2 menit
Etanol 95% : 2 menit
Etanol 95% : 2menit
Etanol absolut : 2 menit
Etanol absolut : 2 menit
Etanol absolut : 2 menit
Xylol : 2 menit
Xylol : 2 menit
Xylol : 2 menit
Mounting dengan entellan/ kanada balsem
 Mallory (1897-1900) mengkombinasi
hematoksilin dengan 1% aqueous
phosphotungstic acid sebagai mordan

Hematoksilin dapat dioksidasikan secara

kimiawi oleh larutan potasium
permanganat; namun hanya dapat
dipergunakan kurang dari 24 jam.
 Pewarnaan lanjutan / counterstains yang
penting mengikuti hematoxylin adalah eosin
Y atau dapat juga pewarna merah lain yang
bisa memberi warna tajam.
Pewarnaan counterstain tidak hanya kontras
dengan pewarnaan ini yang biru tetapi juga
komponen jaringan lain selain inti sel dapat
dibedakan satu dengan lainnya, misalnya
otot polos dan kolagen.
 Eosin Y larut dalam etanol 95%. Preparat
yang sudah diwarna dengan eosin- akan
mengalami decolorisasi jika dibiarkan lama
dalam 95% ethanol sebelum ditutup dengan
coverglass.
Biasanya kelarutan Eosin dalam ethanol
100% sedikit , namun lama lama pewarnaan
juga bisa menghilang.
 Tahun 1942, Papanicolaou menemukan cara
mewarnai sediaan apusan vagina berbagai
macam sediaan sitologi.
Pertimbangan utama pemilihan tehnik ini adalah :
Mewarnai inti sel dengan jelas yang berguna
untuk melihat struktur inti apabila terdapat suatu
keganasan.
Pewarna banding yang akan menimbulkan
warna pada sitoplasma sehingga warna inti lebih
kontras.
Warna yang cerah dari sitoplasma akan
memungkinkan untuk melihat sel-sel lain di
bawahnya yang kadang-kadang bertumpuk
atau berkelompok.
Yang digunakan untuk mewarnai inti adalah
Harris hematoksilin, kromatin dan membran inti
akan berwarna biru tua sampai ungu, sedangkan
anak inti berwarna merah muda atau orange.
Cara pengecatan :
Sediaan difiksasi dalam alkohol 96% 30 menit
Masukkan ke dalam alkohol 70% 7 celup
Masukkan ke dalam alkohol 50% 7 celup
Masukkan ke dalam aquadest 7 celup
Masukkan ke dalam Harris hematoxylin 3 menit
Cuci di air mengalir
Masukkan ke dalam HCl 1 celup
Cuci di air mengalir
Masukkan ke cairan litium 0,1 % karbonat 1-2
celup
Masukkan ke dalam alkohol 50% 7 celup
Masukkan ke dalam alkohol 70% 7 celup
Masukkan ke dalam alkohol 80% 7 celup
Masukkan ke dalam alkohol 96% 7 celup
 Masukkan ke dalam larutan OG-6 3 menit
Masukkan ke dalam alkohol 95% 7 celup
Masukkan ke dalam alkohol 95% 7 celup
Masukkan ke dalam larutan EA 50 3 menit
Masukkan ke dalam alkohol 95% 7 celup
Masukkan ke dalam alkohol 95% 7 celup
Masukkan ke dalam alkohol absolut 7 celup
Masukkan ke dalam alkohol absolut 7 celup
Masukkan ke dalam larutan xylol I 3 menit
Masukkan ke dalam larutan xylol II 3 menit
Masukkan ke dalam larutan xylol III 3 menit
Sediaan dikeringkan kemudian ditetesi entellan dan
ditutup dengan deck glass