Analisis Glimepirid dengan HPLC

Kelompok 5:
1. Annisa Fajriyah
2. Erfina Dwi Meilandari
3. Fakhriyah Aulia
4. Idhadi Putra
5. Lovina Aldelyn
6. Nur sophia
Dosen Pembimbing : Armond Fernando,M.Si,Apt
 Jurnal
Analisis Glimepirida Dalam Plasma Tikus

Analisis Glimepirid dalam Sediaan Farmasi dengan HPLC dan

Metode Spektrofotometri Derivat Pertama

Analisa Campuran Pioglitazon dan Glimepirid dengan HPLC

Perhitungan Kadar Campuran Metformin

Hidroklorida,Pioglitazon, dan Glimepirid dengan HPLC dalam
sediaan Tablet

Penelitian Metode Analisis HPLC dan Validasi dari tiga obat

yaitu glimepirid,Pioglitazon,dan Metformin
 Analisis Glimepirida Dalam Plasma Tikus

Glimepirida merupakan antidiabetes oral dari golongan sulfonil

urea generasi II yang terbaru. Obat ini bekerja dengan cara
menstimulasi sekresi insulin dari sel beta pankreas

Obat ini sering digunakan pada penderita diabetes karena efek

terapi yang rendah serta resiko hipoglikemia nya lebih kecil dari
obat antidiabtes golongan sulfonil urea lainnya.

Karena kadar glimepirida dalam darah cukup kecil(ng/ml)sehingga

diperlukan suatu metode yang sensitif untuk menetapkan kadar
glimepirid dalam cairan biologis.Salah satu metode yang dapat
digunakan adalah HPLC.
 • Melakukan analisis glimepirida secara in vivo
dengan menggunakan metode yang telah
Tujuan divalidasi dan mengamati seberapa jauh
gangguan yang dapat muncul dalam analisis
glimepirida.

• KCKT Alliance Waters 2695 dengan detektor

Alat Photodiode Array (PDA) Waters 2996

• Bahan Uji : Glimepirida (Kalbe Farma),
Glipizida (BPOM), Gliklazida Glibenklamida

• Fase gerak Metanol : Air(50:50)

Sistem • Kecepatan alir : 1,0 ml/menit

• Panjang gelombang : 228nm

KCKT • Volume injeksi : 20 µl

• Konsentrasi sampel : 100, 200, 300, 400, 800 dan
1000 ng/ml
 Penyiapan Sampel
1.Penetapan kondisi analisis

2.Pemilihan baku dalam yang cocok

3.Uji Linearitas

4. Analisis glimepirida dalam plasma in vitro

5. Analisis glimepirida dalam plasma tikus

 1.Penetapan kondisi analisis

Larutan induk glimepirida diencerkan hingga didapat

konsentrasi 1 µg/ml, kemudian disuntikkan sebanyak 20 µl ke
dalam alat KCKT dengan fase gerak metanol:air masing–masing
dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40, dan 50:50. Diamati
kondisi analisis yang paling optimum dari berbagai perbandingan
komposisi fase gerak.
2.Pemilihan baku dalam yang cocok
Larutan induk glipizida, gliklazida, dan
glibenklamida diencerkan dengan fase gerak
terpilih hingga didapat konsentrasi masing -
masing 1 µg/ml
Masing-masing larutan baku dalam
disuntikkan 20 µl ke dalam KCKT dengan
kondisi terpilih.

Kemudian diamati waktu retensi masing-

masing zat dan dibandingkan dengan waktu
retensi glimepirida.
 3.Uji Linearitas
Larutan standar glimepirida diencerkan dengan fase gerak hingga didapat konsentrasi 100, 200,
300, 400, 800 dan 1000 ng/ml

Kemudian disuntikkan sebanyak 20 ml ke dalam alat KCKT dengan kondisi terpilih, dan dibuat kurva persamaan garis
regresi linier luas puncak terhadap konsentrasi glimepirida

Langkah yang sama dilakukan pada larutan glimepirida dengan penambahan baku dalam
1000ng/ml pada masingmasing konsentrasi

Kemudian dibuat kurva persamaan garis regresi linier perbandingan luas puncak terhadap
konsentrasi glimepirida

Dihitung nilai koefisien korelasi dari kedua kurva tersebut

4. Analisis glimepirida dalam plasma in vitro
Uji
spesifisitas
(selektivitas)

Uji
Uji akurasi
perolehan
dan presisi
kembali

Uji limit
deteksi dan
Uji Linearitas
limit
kuantitasi
 a. uji spesifisitas (selektivitas)
• Sebanyak 0,5 ml plasma kosong (tanpa penambahan
glimepirida) diekstraksi dengan 2,5 ml kloroform dengan cara
dikocok menggunakan shaker pada kecepatan 100 rpm
selama 15 menit.
• Pisahkan fase organik, kemudian ekstraksi kembali dua kali
dengan cara yang sama. Semua fraksi kloroform dikumpulkan
dan diuapkan dengan gas nitrogen pada temperatur 37°C
hingga kering. Kemudian residu dilarutkan dalam 1,0 ml
metanol, vorteks selama 30 detik.
• Larutan yang diperoleh disuntikkan sebanyak 20 µl pada KCKT
dengan kondisi terpilih, diamati adanya gangguan pada
kromatogram di sekitar waktu retensi glimepirida dan baku
dalam terpilih. Langkah yang sama juga dilakukan pada
plasma yang mengandung glimepirida 100, 400, 1000 ng/ml
dan baku dalam terpilih 1000 ng/ml.
 b. Uji perolehan kembali
• Sebanyak 0,5 ml plasma yang mengandung glimepirida 100,
400, dan 1000 ng/ml diekstraksi dengan 2,5 ml kloroform
dengan cara dikocok menggunakan shaker pada kecepatan 100
rpm selama 15 menit.
• Pisahkan fase organik, kemudian ekstraksi kembali dengan cara
yang sama sebanyak dua kali. Semua larutan kloroform
dikumpulkan dan diuapkan dengan gas nitrogen pada
temperatur 37°C hingga kering. Kemudian residu dilarutkan
dalam 1,0 ml metanol, vorteks selama 30 detik.
• Masingmasing larutan yang diperoleh disuntikkan secara
berulang sebanyak 20 µl pada KCKT dengan kondisi terpilih,
dihitung persentase perolehan kembali dengan
membandingkan luas puncak yang diperoleh dengan larutan
standard. Uji perolehan kembali juga dilakukan pada plasma
yang mengandung glimepirida 100, 400, 1000 ng/ml dan baku
dalam terpilih 1000 ng/ml.
C. Uji limit deteksi dan limit kuantitasi
Larutan ekstrak plasma yang mengandung
glimepirida dengan konsentrasi 100 ng/ml
disuntikkan sebanyak 20 ml ke dalam alat KCKT
dengan kondisi terpilih, kemudian dihitung tinggi
puncak pada kromatogram

Dihitung nilai perbandingan tinggi puncak dengan

tinggi derau (S/N’ = signal to noise ratio).

Untuk tinggi derau (noise) disuntikkan pelarut

metanol:air (50:50), kemudian pada kromatogram
dihitung tinggi derau tertingginya.
 d. Uji Linearitas
• Sebanyak 0,5 ml plasma yang mengandung glimepirida 100, 200, 300,
400, 800 dan 1000 ng/ml diekstraksi dengan 2,5 ml kloroform sebanyak
dua kali.
• Semua fraksi kloroform dikumpulkan dan diuapkan dengan gas nitrogen
pada temperatur 37°C hingga kering. Kemudian residu dilarutkan dalam
1,0 ml metanol, vorteks selama 30 detik.
• Masingmasing larutan yang diperoleh disuntikkan sebanyak 20 µl pada
KCKT dengan kondisi terpilih.
• Kemudian dibuat kurva persamaan garis regresi linier luas puncak
terhadap konsentrasi glimepirida dalam larutan dari masing-masing
konsentrasi.
• Hal yang sama dilakukan pada plasma yang mengandung glimepirida
100, 300, 400, 800, 1000 ng/ ml dan baku dalam terpilih 1000 ng/ml,
kemudian dibuat kurva persamaan garis regresi linier perbandingan luas
puncak terhadap konsentrasi glimepirida.
• Dihitung nilai koefisien korelasi dari kedua kurva tersebut.
 e. Uji akurasi dan presisi
• Sebanyak 0,5 ml plasma yang mengandung glimepirida 100 ,
400, dan 1000 ng/ml diekstraksi dengan 2,5 ml kloroform
1 sebanyak dua kali

• Semua fraksi kloroform dikumpulkan dan diuapkan dengan gas

nitrogen pada temperatur 37°C hingga kering. Kemudian residu
2 dilarutkan dalam 1,0 ml metanol, vorteks selama 30 detik

• metanol, vorteks selama 30 detik. Masing-masing larutan yang

diperoleh disuntikkan sebanyak 20 ml secara berulang (minimal
3 lima kali) pada KCKT dengan kondisi terpilih
 • Dihitung nilai persentase akurasi dan koefisien
variasinya
4
• Uji akurasi dan presisi juga dilakukan pada plasma yang
mengandung glimepirida 100, 400, 1000 ng/ml dan baku
dalam terpilih 1000 ng/ml dengan mengulangi langkah-
5 langkah seperti di atas.
5. Analisis glimepirida dalam plasma
tikus
Hewan coba dibagi ke dalam dua kelompok

Kelompok I diberi perlakuan pemberian glimepirida

0,432 mg/200 g (per oral) pada tikus normal

Kelompok II diberi placebo (air)

Masing-masing tikus ditimbang dan atur pemberian

dosis sesuai dengan berat tikus
• Tabung yang sudah berisikan darah segera disentrifugasi selama
10 menit dengan kecepatan 7000 rpm lalu diambil bagian
plasmanya.
• Plasma kemudian ditambahkan baku dalam terpilih sehingga
didapat konsentrasi 1000 ng/ml.
• Lalu dipipet 0,5 ml plasma, kemudian diektraksi dengan 2,5 ml
kloroform dengan cara dikocok menggunakan shaker pada
kecepatan 100 rpm selama 15 menit.
• Ambil bagian kloroform dan ektraksi kembali sebanyak dua kali.
• Semua fraksi kloroform dikumpulkan dan diuapkan dengan gas
nitrogen pada temperatur 37°C hingga kering.
• Kemudian residu dilarutkan dalam 1,0 ml metanol, vorteks
selama 30 detik Larutan yang diperoleh disuntikkan sebanyak
20 ml secara berulang ke dalam kolom dengan kondisi terpilih.
 Lanj...

• Pada kelompok yang diberi perlakuan

placebo diamati adanya
gangguan/interferensi pada kromatogram
dari ekstrak plasma blangko.
• Pada kelompok yang diberi perlakuan
glimepirida diamati munculnya puncak
glimepirida dan metabolitnya pada
kromatogram.
 Hasil
• Dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi
menggunakan kolom C18 fase terbalik, fase gerak
metanol:air (50:50; v/v), laju alir 1,0 ml/menit, dan
dideteksi pada panjang gelombang 228 nm dengan
detektor photo diode array, glimepirida dapat dianalisis
dengan penambahan baku dalam gliklazida tanpa
adanya gangguan baik dari metabolit atau komponen
endogen plasma.
• Waktu retensi glimepirida diperoleh pada 17 menit.
• Hasil validasi metode menunjukkan bahwa metode
analisis yang digunakan sudah memenuhi kriteria
akurasi, presisi, selektivitas dan sensitivitas.
Analisis Glimepirid dalam Formulasi Farmasi dengan HPLC dan
Metode Spektrofotometri Derivat Pertama

• Menentukan kadar glimepirid dlam sediaan

Tujuan tablet glimepirid dengan menggunakan 2
Metode

•HPLC Shimadzu LC-10A yang dilengkapi

Alat dengan pompa LC 10 Advp dan menggunakan
Detektor UV

Sistem •
•
•
Fase gerak asetonitril:as.format
Kecepatan alir : 0,5 ml/menit
Panjang gelombang : 228nm

KCKT •
•
Volume injeksi : 20 µl
Konsentrasi sampel : 80 μg/mL.
 Penyiapan Sampel
• 20 tablet digerus halus
1 • Timbang setara 50mg glimepirid

• Masukkan dalam ukur 50 ml

2 • Tambahkan fase gerak sampai tanda batas

• Lakukan pengenceran untuk

3 mendapatkan konsentrasi 80 μg/mL.
 Hasil
Variations Retention Tailing factor Theoretical Assay as (%) of
time (min) plates label
Proposed mobile 7.08 1.21 6999 100.58
phase

Acetonitrile : formic 5.68 1.36 6712 100.26

acid (90 : 10)

Acetonitrile : formic 9.28 1.18 7028 101.72

acid(70 : 30)

Aqueous phase pH 7.11 1.20 6808 101.51

3.0
Aqueous phase pH 7.20 1.22 6750 100.12
4.0
Analisa Campuran Pioglitazon dan Glimepirid dengan
HPLC

•PU 980 pump

Alat •Detektor UV 970 nm

• Spektrofotometri double-beam untuk melakukan
scanning dan pemilihan panjang gelombang

Sistem • Fase gerak Methanol, acetonitrile,dan asam

orthophosphoric dengan perbandingan 20:35:45
• Fase Diam : Colom C18

KCKT • Kecepatan alir : 1 ml/menit

Larutan Standar Penyiapan Sampel
Untuk larutan stok Pioglitazon disiapkan dengan cara melarutkan 11,02 mg Pioglitazon HCl
dalam 10 ml metanol (M1)

Untuk larutan stok Glimepirid disiapkan dengan cara melarutkan 10 mg Glimepirid dalam
10 ml metanol (M2)

Untuk larutan stok internal, disiapkan dengan cara melarutkan garam kalsium
atorvastatin murni sebanyak 10,17 mg dalam 100 ml metanol

Larutan yang mengandung campuran Pioglitazon dan Glimepirid dibuat menjadi 7

konsentrasi berbeda dan tambahkan larutan atorvastatin ke masing-masing konsentrasi
larutan

Kisaran konsentrasi larutan masing-masing obat adalah 2,50-30,00 ppm untuk Pioglitazon dan
0,10-10,00 ppm untuk Glimepirid
 Sampel
20 tablet di timbang dan dihitung berat rata ratanya

Tablet digerus halus dan homogen lalu di timbang berat

ekuivalen untuk 1 tablet(0,1282mg)

Dimasukkan dalam labu ukur 100 ml,dilarutkan dengan

metanol sampai tanda batas

Larutan disaring dengan kertas saring whatman No.4

Diambil 1 ml dari larutan induk,masukkan dalam labu ukur

10ml,lalu adkan dengan fase gerak yang digunakan.
 Perhitungan Kadar Campuran Metformin
Hidroklorida,Pioglitazon, dan Glimepirid dengan HPLC dalam
sediaan Tablet

Alat •HPLC Shimadzu yang dilengkapi dengan manual injektor

dan detektor photodiode ara(PDA)

Sistem •
•
•
Fase gerak Metanol:bufer fosfat(72:25)
Fase Diam : Colom C18
Kecepatan alir : 1 ml/menit

KCKT • Panjang Gelombang :258 nm

Penyiapan Sampel
20 tab Tribet 1 dan Tribet-2 Nicholas Piramal
India Limited terdiri dari
metformin,pioglitazon dan glimepirid
digerus halus

Kemudian ditimbang setara 500mg berat

metformin,kemudian dilarutkan dalam 100
ml metanoldan dan disonikasi selama 10 mnt
lalu disaring menggunakan kertas saring
whatman no.242

Kemudian dihitung masing – masing kadar

dari sampel
Penelitian Metode Analisis HPLC dan Validasi dari tiga
obat yaitu glimepirid,Pioglitazon,dan Metformin

Alat
•Spektrofotometer UV-VIS digunakan adalah Shimadzu
model-2450.Instrumen HPLC yang digunakan adalah
Shimadzu model LC 2010 CHT

Sistem • Fase gerak menggunakan

asetonitril,dapar,tetrahidrofurin(40:50:10)
• Fase Diam : Colom C18

KCKT • Volume Injeksi :20 µl

 Penyiapan Sampel

Persiapan larutan Standar

Persiapan Linearitas Larutan

Persiapan Sampel untuk Akurasi

Persiapan Solusi Sampel untuk Analisis Batch

Hasil
 Hasil

• Waktu retensi untuk masing – masing obat

didapatkan 5000 min,3942 min,dan 1342 min
untuk glimepirid,pioglitazon dan metformin
• Linearitas yang didapat berada pada range
0,2-0,6 mg/ml
• Metode yang digunakan akurat
TERIMA KASIH