Validasi Metode Analisis

Definisi VMA
Validasi metode adalah suatu proses untuk
mengkonfirmasi bahwa prosedur analitik yang
digunakan untuk suatu pengujian/test khusus
sesuai untuk tujuan penggunaannya

Huber, in: Nash and Wachter, 2003

3
 Definisi Validasi Metode Analisis

• Proses pembakuan suatu metode analisis

dengan cara studi laboratorium agar
karakteristik metode dapat memenuhi syarat
untuk penggunaan analisis yang dimaksud

• Proses peninjauan ulang prosedur analisis

secara berkala untuk memastikan bahwa
prosedur tersebut masih sesuai bila digunakan
untuk menyajikan/memperoleh hasil uji yang
dapat dipercaya sepanjang waktu
4
5
 Verification

Verification of an analytical procedure is:

The demonstration that a laboratory is capable of
replicating with an acceptable level of
performance a standard method.

Verification under conditions of use is

demonstrated by meeting system suitability
specifications establihed for the method, as
well as a demonstration of accuracy and
precision or other method parameters for the
type of method
6 Laboratory Procedure, FDA: Ora-Lab.5.4.5
Ora VMA
 Kapan Suatu Metode Analisis Perlu
divalidasi atau revalidasi ?
[ Huber, in: Nash and Wachter, 2003 ]

Sebelum metode diterapkan atau diberlakukan

untuk penggunaan rutin

Bila kondisi berubah dilihat dari tujuan metode

tersebut divalidasi [misal: instrumen dengan
karakteristik yang berbeda]

Bila metode tersebut berubah dan perubahan

tersebut diluar lingkup awal metode tersebut
saat divalidasi
7
 Revalidasi
• Revalidasi perlu dilakukan dalam kasus berikut:
penyerahan prosedur analisis yang direvisi
kepada Panitia Farmakope, atau penggunaan
suatu prosedur umum yang telah ditetapkan
pada produk baru atau bahan baku baru.
• Menurut dokumen "International Conference on
Harmonization" (ICH) revalidasi perlu dilakukan
jika terjadi : perubahan dalam sintesis senyawa
obat, perubahan dalam komposisi sediaan
farmasi, dan perubahan dalam prosedur analisis.
 Apakah

Metode Compendia

Pasti Sudah Divalidasi

???

9
10
11
12
Assignment of Validation Parameters

Kazakevich, Y. and LoBrutto, R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists, Chpt. 9
13
14
15
16
Typical Analytical Characteristics Used
In Method Validation

Accuracy
Precision
Specificity
Limit of Detection
Limit of Quantitation
Linearity
Range

17
 Data Elements Required for Validation
(USP, XXX)
Analytical Assay Assay Category II Assay Assay
Performance Category I Category Category
Quanti- Limit
Characteristics III IV
tative Tests
Accuracy Yes Yes * * No
Precision Yes Yes No Yes No
Specificity Yes Yes Yes * Yes
Limit of No No Yes * No
Detection
Limit of No Yes No * No
Quantitation
Linearity Yes Yes No * No
Range Yes Yes * * No
* Mungkin diperlukan, tergantung sifat ujinya 18
Unsur Data yang Diperlukan untuk
Validasi

Farmakope Indonesia, Edisi V

 20
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 VMA
Categories of assays for which validation data
[ USP XXX ]

• Category I :
Analytical methods for quantitation of major
components of bulk drug substances or active
ingredients (including preservatives) in finished
pharmaceutical products.

• Category II :
Analytical methods for determination of
impurities in bulk drug substances or
degradation compounds in finished
pharmaceutical products. These methods
include quantitative assays and limit tests.
21
Categories of assays for which validation data
[ USP XXX ]

• Category III :
Analytical methods for determination of
performance characteristics (e.g., dissolution,
drug release).

• Category IV : Identification tests

For each assay category, different ana-
lytical information is needed list in Table 2 are
data elements that are normally required for
each of the categories of assays.
22
Farmakope Indonesia Edisi V
Validasi Metode Analisis
Presisi
 Presisi

Menurut ICH-Q2A [1995] (3) dan Eurachem

[1993] (2):
- Presisi suatu metode:
merupakan kesesuaian/kedekatan hasil tes
individual beberapa penginjeksian suatu seri
standar

Kedekatan tersebut dilihat dari nilai Standard

Deviation-nya
26
 Presisi

Precision = Ketelitian

Ketelitian suatu metode analisis merupakan

ukuran kemampuan suatu metode untuk
mendapatkan hasil yang mirip (memiliki kedekatan)
satu dengan yang lain

Sebagai ukuran kedekatan tersebut adalah nilai

Percent Relative Standard Deviation
[ % RSD ]

27
 Presisi

Standard Deviation (SD) yang terukur dapat

dibagi menjadi tiga (3) kategori, yaitu:

1. repeatability (ripitabilitas)
2. intermediate precision (presisi antara)
3. reproducibility (reprodusibilitas)

Ruggedness = Intermediate Precision

28
 1. Ripitabilitas

Ripitabilitas diperoleh apabila analisis

dilakukan:
- di satu laboratorium
- oleh satu analis (operator)
- dengan satu alat
- pada rentang waktu singkat

29
 lanjutan…

Analisis tersebut dilakukan paling tidak:

- lima (5) atau enam (6) kali penetapan
- tiga matrik yang berbeda
- dua (2) atau tiga (3) macam konsentrasi
yang berbeda

Relative Standard Deviation-nya (RSD)

30 VMA
 Repeatability

31
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 VMA
 2. Presisi antara

Menurut ICH-Q2A, 1995 (3):

Presisi antara:
- merupakan variabilitas jangka panjang
suatu proses pengukuran dan ditentukan
dengan membandingkan hasil-hasil suatu
metode yang dikerjakan dalam satu
laboratorium selama beberapa minggu

32
 lanjutan…

Metode presisi antara dapat menggambarkan

ketidaksesuaian hasil yang diperoleh akibat:
- analis yang berbeda
- alat yang berbeda
- standar dan reagen dari supplier yang
berbeda
- penggunaan kolom dari batch yang
berbeda
[ atau kombinasi hal-hal yang tersebut di atas ]
33
 Tujuan

Tujuan validasi presisi antara adalah:

- untuk memverifikasi dalam laboratorium
yang sama, suatu metode analisis akan
memberikan hasil yang sama setelah
fase/tahap pengembangan (metode) selesai.

34
 Intermediate Precision

35
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 VMA
 3. Reprodusibilitas

Menurut ICH (1993; 1995):

Reprodusibilitas menggambarkan presisi yang
diperoleh antar laboratorium

Tujuan dilakukannya validasi reprodusibilitas:

- untuk memverifikasi bahwa metode akan
memberikan hasil yang sama bila metode
tersebut digunakan pada laboratorium yang
berbeda
36
 lanjutan…

Reprodusibilitas ditentukan dengan cara:

Menganalisis aliquot sampel yang homogen:
- di laboratorium yang berbeda
- oleh analis yang berbeda
- pada kondisi operasional dan lingkungan
yang mungkin berbeda (tetapi masih
dalam kisaran parameter yang ditentukan

37
 Validasi Reprodusibilitas

Validasi reprodusibilitas penting apabila

metode tersebut akan digunakan di
laboratorium yang berbeda

38
 Faktor-faktor yang mempengaruhi
Reprodusibilitas

Perbedaan temperatur dan kelembaban

Operator dengan pengalaman yang berbeda

Peralatan dengan karakteristik yang berbeda

Variasi bahan dan kondisi instrumen

39
 Lanjutan (Faktor-faktor…)

Peralatan dan bahan habis pakai dengan usia

yang berbeda

Kolom dari suplier yang berbeda dan batch

yang berbeda

Pelarut dan pereaksi dengan kualitas yang

berbeda

40
 Reproducibility

41
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 VMA
Relative Standard Deviation
[ RSD ]

SD
RSD = X 100%
X

RSD = CV

42
 Kriteria Penerimaan Presisi
Sampel Presisi
[ % RSD ]
Sediaan obat ≤ 1

Biologis 10 - 15 %

Lingkungan dan Makanan 2 - 20 %

Sangat tergantung pada:

Matriks sampel
Konsentrasi analit
Teknik analisis
Huber, in: Nash and Wachter, 2003
43
Kriteria Penerimaan Presisi

44
Presisi  RSD [ Horwitz vs AOAC ]

45 VMA
Akurasi
 Akurasi
Accuracy = Ketepatan
Ketepatan suatu metode analisis adalah kese-
suaian antara hasil uji yang diperoleh dan nilai
sebenarnya yang diterima

Akurasi suatu metode analisis adalah ukuran

kesesuaian antara hasil analisis dan nilai
sebenarnya

47
Cara Evaluasi Accuracy

48 VMA
 lanjutan…
Dapat ditempuh dengan cara:
1. membandingkan hasil analisis metode
tersebut dengan hasil analisis yang diperoleh dengan
menggunakan metode baku (established reference
method)
2. Dengan menganalisis sampel yang diketahui
konsentrasinya (certified reference material, CRM)
dan membandingkan hasil analisis terhadap nilai
sebenarnya yang dinyatakan dalam CRM
3. Lakukan sbb: Tambahkan (spiking) zat baku dengan
konsentrasi yang diketahui (by weight or by volume)
ke dalam matrik, kemudian:
lakukan ekstraksi analit  injekkan ke alat analisis
dan hasil yang diperoleh ditentukan rekoverinya (%)
49 VMA
 Akurasi
Konsentrasi harus mencakup rentang zat yang
dianalisis dan salah satunya adalah
konsentrasi yang dekat dengan nilai limit of
quantitaion (LoQ)
Perkiraan rekoveri tergantung pada:
- matrik sampel
- prosedur penyiapan sampel, dan
- konsentrasi sampel

50
 Akurasi

Misal:
Tiga (3) macam konsentrasi yang mencakup
80, 100, dan 120 %
dari nilai kadar sampel
dan masing-masing konsentrasi direplikasi 3 kali

“ Accuracy should be reported as % recovery ”

51 VMA
 Rekoveri
Respon hasil ekstraksi
Rekoveri = X 100%
Respon zat baku

Kadar terukur
* :Rekoveri =
yang dilarutkan dalam pelarut murni X 100%
Kadar sebenarnya

Perhatikan tata-cara penyiapan sampel

52
 Analytical Method Development
• Accuracy and precision

Accurate &
precise Accurate &
imprecise
Inaccurate &
precise Inaccurate & imprecise
54 VMA
Kriteria Penerimaan

55
 Accuracy and Precision

56
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 VMA
Recovery Results for C.U.

LoBrutto and Patel, 2007

57
Linearitas
 Linearitas
Linearitas suatu metode analisis adalah:

kemampuan metode tersebut untuk

mendapatkan hasil uji (respon) yang (secara
langsung atau dengan bantuan perubahan
matematik) proporsional terhadap konsentrasi
analit dalam sampel pada suatu rentang
tertentu

59
Cara Menentukan Linearitas Kalibrasi

60 VMA
 lanjutan…
Linearitas ditentukan dengan menganalisis:

- tiga (3) hingga enam (6) kali penginjeksian

lima (5) atau lebih konsentrasi zat standar yang
terletak antara 80 - 120 % rentang konsentrasi
yang diperkirakan

61 VMA
 Linearitas dapat disiapkan dengan cara:
Pengenceran atau Penimbangan Terpisah

1. Minimum 5 konsentrasi zat standar (dari

pengenceran larutan induk)
atau

2. Minimum 5 konsentrasi zat standar (dari

masing-masing penimbangan zat standar)

62
 lanjutan…
Linearity = Linieritas  Y = bX + a
- hasil pengukuran menggunakan suatu
metode analisis yang berupa: abs, luas area,
atau tinggi puncak menunjukkan proporsio-
nalitas dengan kadar zat yang dianalisis

Syarat:

Koefisien korelasi [ r ] ≥ 0,999

Kazakevich and LoBrutto, 2007, p.471-481; Ahuja and Rasmussen, 2007, p.292;
Snyder dkk., 1997, p. 691 dan Chan dkk., 2004, p.16.
63 VMA
Persamaan Garis Regresi

64 VMA
Rentang [ Range ]
 Rentang
Rentang suatu metode analisis adalah interval
antara tingkat paling atas dan paling bawah
yang sudah terbukti dapat ditentukan dengan
akurasi, presisi, dan linearitas menggunakan
metode seperti yang ditulis

Rentang biasanya digambarkan/dinyatakan

dalam unit (%, ppm) yang diperoleh dengan
metode analitik tersebut

66
 Rentang Minimum

Jenis analisis Rentang [ % ]

PK. Kadar Obat atau Sediaan 80 - 120

Obat

Keragaman kandungan 70 - 130

[ atau lebih lebar ]

Uji disolusi +/- 20

ICH, Q 2A and 2B, 2005 / ICH Q2 (R1)

67
Range for Linearity

68 LoBrutto and Patel, 2007 VMA

 Range

69
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 VMA
Limit of Detection [ LoD ]
dan
Limit of Quantitation [ LoQ ]
 Limit of Detection [LoD]

LoD adalah konsentrasi analit terrendah dalam

sampel yang masih dapat dideteksi tetapi tidak
diperlukan secara kuantitatif

Pada HPLC, LoD adalah jumlah zat yang

diinjeksikan untuk menghasilkan tinggi puncak
paling tidak 2 atau 3 kali tinggi puncak baseline
noise level

71
72 VMA
Ermer and Miller, 2005, p.101
 Noise

73
Ermer and Miller, 2005, p.103
 S/N Ratio

74
Ermer and Miller, 2005, p.109
Limit of Detection

75 VMA
 Limit of Quantitation
LoQ adalah jumlah zat minimum yang
diinjeksikan untuk memberikan hasil
pengukuran secara teliti

Pada HPLC, biasanya tinggi puncak 10 hingga

20 kali lebih tinggi dibanding baseline noise

Sejumlah sampel dengan konsentrasi analit

menurun (semakin kecil) diinjeksikan 6 kali,
 Hitunglah nilai RSD-nya
76
LOD - LOQ

77
Robustness
 Robustness
Robustness adalah ukuran kinerja
(performance) suatu metode analisis apabila
perubahan kecil yang disengaja diterapkan
pada kondisi metode tersebut

Tujuan validasi parameter ini untuk

mengidentifikasi (bila ada) kondisi metode
mana yang paling kritis untuk menampilkan
kinerja metode dengan baik

79
 Parameter Robustness
Parameter Nominal Low value High value

Percent organic in mobile phase 25 20 30

Flow rate (mL/min) 1.0 0.8 1.2

Buffer pH 7.2 6.8 7.6

Buffer concentration (mM) 20 15 25

Column temperature (0C) 30 25 35

Detector wavelength (nm) 220 210 230

HPLC Column Different batches for same column

type
80
 Robustness [ isocratic ]

81
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 VMA
 Robustness [ gradient ]

82
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 VMA
 System Suitability

83
Ermer and Miller, 2005, p.351
 System Suitability Test [ FDA ]

84
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 VMA
Selektivitas - Sepesifisitas
Cara Pengukuran Selektivitas

86
 Spesifisitas

Specificity = Spesifisitas suatu metode analisis

adalah:
- kemampuan suatu metode analisis untuk
mengukur analit yang diinginkan dalam campuran
matrik tanpa mengalami gangguan

Spesifisitas dan selektivitas dalam

penggunaannya sering dipertukarbalikkan

87
 Spesifisitas

Metode Spektrofotometri

Hasil pengukuran nilai absorban pada

maks yg dipilih & pelarut yang dipilih tidak
ada gangguan dari senyawa lain (matrik)

88
Spektrum Meloksikan dalam metanol

205 nm
363 nm

89 VMA
 UV Spectrum Meloksikam
205 nm

363 nm

90 VMA
 Spesifisitas
Metode HPLC

Puncak-puncak kromatogram terpisah

sempurna dilihat dari Resolusi yang dihasilkan

Juga harus diperhatikan baseline resolutionnya

91
HPLC

92
Water soluble vitamines

93 VMA