Analisis Protein

“ Analisis Bahan Pangan

merupakan suatu kegiatan
yang dilakukan dengan
tujuan mengetahui
karakteristik fisik dan kimiawi
dari suatu bahan pangan.

2
“ Protein merupakan zat
makanan yang penting bagi
tubuh karena berfungsi
sebagai bahan bakar, zat
pembangun dan pengatur

3
KANDUNGAN PROTEIN PADA PANGAN

Jenis Pangan Persen Protein (wb)

Susu penuh 3,5
Keju cheddar 25,0
Daging sapi 28,6
Dada ayam 27,3
Telur mentah 12,9
Ikan tuna 24,2
Beras pecah kulit 7,5
Kedelai (kering) 34,1
Terigu ( hard wheat) 13,3
Polong-polongan (semua var.) 22,3
4
 Manfaat Analisis Protein

1. Penentuan aktivitas biologis

Protein : enzim dan inhibitor enzim

2. Penelitian tentang sifat fungsional

Memiliki sifat fungsional unik
Ex: gliadin dan glutenin untuk roti, casein pada susu
untuk keju, albumin telur untuk busa

3. Label Nutrisi

5
 Analisis Kadar Protein

Kjeldahl UV-Vis

Pengikat
Biuret Lowry Zat warna

6
1
Metode Kjeldahl
7
Prinsip: Protein dalam sampel didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis.
Hasil destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan alkali melalui destilasi. Destilat
ditampung dalam larutan asam borat. Selanjutnya ion-ion borat yang terbentuk dititrasi
dengan menggunakan larutan HCl.

Reaksi:
Senyawa N + H2SO4 Campuran Se CO2 + H2O + SO2 + (NH4)2SO4
(NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + NH4OH

NH4OH NH3 + H2O

NH3 + H3BO3 NH4H2BO3

NH4H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO3 8
Cara Kerja:

1. Destruksi
Senyawa N organik didestruksi oleh H2SO4 pekat dengan katalis campuran selen
menghasilkan amonium sulfat.

+H2O
Dihomogenkan

Didinginkan
9
Sampai larutan jernih
Cara Kerja:

2. Destilasi
Amonium sulfat pada tahap destruksi ditambah larutan NaOH dan didestilasi menghasilkan
amoniak yang ditampung dengan larutan asam (antara lain asam borat) yang mengandung
campuran indikator MM dan BCG

Dipipet 10 mL + 10mL NaOH 30% + 10 mL H3BO3 2,5%

Hingga lar. berwarna 10
+ Ind BCG MM
hijau
Cara Kerja:

3. Titrasi
Amoniak dititar langsung dengan asam (HCl) yang sudah diketahui kenormalannya.
Dilakukan titrasi Blanko

Sampai larutan
berwarna hijau

11
Perhitungan:

Kadar Protein = (V-Vb) x N HCl x 0,014 x 6,25 x fp x 100%

Berat contoh (g)

Jenis Pangan % N dlm protein Faktor konversi

Telur & daging 16,0 6,25
Susu 15,7 6,38
Terigu 18,0 5,70
Jagung 16,0 6,25
Oat 17,15 5,83
Kedelai 17,51 5,71 12
Keuntungan :
 Dpt diaplikasikan untuk semua jenis pangan
 Metode relatif sederhana
 Murah
 Akurat untuk kadar protein kasar

Kelemahan :
 Mengukur semua /total N organik ( bukan hanya dr protein)
 Butuh waktu relatif lama ( minimal 2 jam)
 Ketelitian lebih rendah dr metode Biuret
 Reagent korosif
13
2
Metode Biuret
14
Prinsip: dalam suasana basa, ion cupri (Cu2+) dapat membentuk kompleks yang berwarna ungu
jika berinteraksi dengan ikatan peptida dari suatu protein.
Reagen yang direaksikan pada protein ini disebut reagen biuret.

Reaksi:

15
Cara Kerja:

+Sampel
+ Lar. Biuret
Diamkan 15 menit

540 nm

16
Keuntungan :
•Lebih murah daripada metode Kjeldahl
•Cepat ( dapat selesai < 30 menit)
•Metode paling sederhana utk analisis protein
•Sangat sedikit senyawa pengganggu yg dpt bereaksi dg biuret
•Tidak mendeteksi nitrogen dr senyawa non peptida atau non protein
Kelemahan:
•Tidak sangat sensitif dibandingkan metode Lowry
•( Kandungan protein minimal 2 – 4 mg protein dlm contoh)
•Absorbansi dpt dipengaruhi /diperoleh dari pigmen bile jika ada .
•Warna bervariasi dari protein yg berbeda ; gelatin (ungu merah jambu).
•Bukan metode absolut; warna harus distandarkan dengan protein yg sdh diketahui
(BSA) atau metode Kjeldahl
17
3
Metode Lowry
18
Prinsip: kombinasi reaksi Biuret dg reduksi reagent Folin – Ciocalteau phenol (asam
fosfomolibdat – fosfotungstat) oleh residu tirosin dan triptofan dalam protein.
Terbentuknya warna kebiruan diukur pd 750 nm ( sensitivitas tinggi utk kons protein
rendah) atau 500 nm ( sensititvitas rendah utk konsentrasi protein tinggi)

Reaksi:

19
 Cara Kerja:

+Sampel + K Na tartarat – Na2CO3 + CuSO4- K Na tartarat – + Reagent Folin

+ H2O (10-200 mg) Diinkubasi pada T kamar NaOH Diinkubasi pada T 50 oC 650 nm
Diinkubasi pada T kamar

20
Keuntungan :
•Sangat sensitif : 50 -100 x lebih sensitif dr metode Biuret
10 – 20 x lebih sensitif dr abs uv 280 nm
bbrp kali lebih sensitif dr metode ninhidrin
•Kurang dipengaruhi oleh kekeruhan sampel
•Lebih spesifik dr hampir semua metode
•Relatif sederhana ( 1 – 1,5 jam)
Kelemahan:
•Warna bervariasi tgt dr sumber protein ( > Biuret)
•Warna tdk proporsional tajam dg kandungan protein
•Reaksi diganggu oleh adanya sukrosa, lipid bufer fosfat, monosakarida dan hexoamina
•Konsentrasi yg tinggi dr gula reduksi, amonium sulfat dan senyawa sulfidril akan
mengganggu reaksi
21
4
Metode Pengikat
Zat Warna
22
Prinsip: kemampuan gugus polar protein yang bermuatan ion berlawanan mengikat zat warna
dan membentuk kompleks tidak larut lalu dipisahkan dengan sentrifus. Semakin rendah
intensitas warna pada larutan maka semakin banyak zat warna yang terikat oleh
protein,semakin tinggi pula kandungan protein dalam contoh.

Cara Kerja :

+Sampel
+ Orange G, Orange
12, Amido Black

23
 Penetapan Kadar N non Protein

Prinsip: Protein dalam sampel diekstrak dengan air dan diendapkan dengan tembaga asetat.
Komponen nitrogen (N)-non protein tinggal dalam larutan. Setelah penyaringan , N dalam
filtrat ditetapkan dengan metode kjeldahl.

Penetapan TVBN

Prinsip: Senyawa TVBN (total volatil base nitrogen) merupakan senyawa nitrogen volatil yang
dihasilkan dari dekomposisi bahan yang kaya protein oleh mikroba. Sampel diekstraksi
dengan TCA 5% (tri chloro acetic acid) sehingga protein mengendap dan komponen N
volatil larut dalam TCA. Ekstrak TCA didestilasi dan komponen N ditangkap HCl. Destilat
dititrasi dengan NaOH sehingga TVBN diketahui.

24
 Penetapan Jenis Asam Amino

Prinsip: Protein di hidrolisis dengan asam kuat (HCL 6N) sehingga asam – asam amino
penyusunnya dapat saling terpisah dan melalui kolom penukar kation pada HPLC
sehingga menghasilkan kromatogram. Kromatogram dibandingkan dengan kromatogram
asam – asam amino standar. Untuk mengetahui jenis asam amino, dapat
membandingkan waktu retensinya. Untuk mengetahui jumlah asam amino, dapat
membandingkan luas kurvanya.

25
 Penetapan Alfa Amino

TNBS Ninhidrin

26
1
Metode TNBS
27
 Prinsip: Gugus alfa amino dari suatu protein dapat direaksikan dengan trinitro benzen sulfonat
pada ph tertentu dan membentuk senyawa berwarna yang dapat diukur absorbannya
pada panjang gelombang 340 nm.

Cara Kerja :

+Sampel +HCl 1N 340 nm

Penangas air 40 oC
+ Buffer fosfat pH 8,2 2 jam
+ TNBS 0,1% 28
2
Metode Ninhidrin
29
 Prinsip: Asam amino, amonia dan gugus amino primer dlm protein, jika didihkan pd bufer pH 5,5
dalam ninhidrin dan hidrindantin akan membentuk warna ungu Ruhemann

Cara Kerja :

+Sampel +Ethanol 570 nm

Penangas air 40 oC
+ Ninhidrin 15 menit
30
“ TERIMAKASIH

31