UJI KARBOHIDRAT

SECARA KUANTITATIF
 Analisa Karbohidrat

 Uji Kualitatif  Uji Kuantitatif

o Uji Molisch o Cara Kimiawi
o Uji Seliwanoff o Cara Enzimatis
o Uji Anthrone o Cara kromatografi
o Uji Benedict o Cara Optic (fisis)
o Uji Barfoed
o Uji Iodin
o Uji Pembentukan Osason
o Uji Fehling
 II. Uji Karbohidrat secara Kuantitatif

Penentuan karbohidrat dari kelompok polisarida dan

oligisakarida, perlu perlakuan pendahuluan , yaitu
hidrolisa sehingga diperoleh monosakarida.
Hidrolisa
Oligo / polisakarida  monosakarida
(Pati) Asam atau enzim (glukosa)
Penentuan monosakarida:
 kimiawi
 fisik
 enzimatik
 kromatografi
 Cara kimiawi

1. Metoda oksidasi dengan kupri

Dasar : reduksi kuprioksida menjadi kuprooksida karena

adanya gula reduksi

Reagen :
- Reagen Luff (campuran CuSO4, Na2CO3, dan asam sitrat)
- Reagen soxhlet (campuran CuSO4 dengan K – Na –tartrat)

K-Na tartrat : pencegah pengendapan CuSO4 dalam reagen

kuprioksida  - sebagai oksidator
- direduksi oleh gula reduksi
membentuk
kuprooksida
Penentuan kuprooksida (endapan
yang merah bata)
terbentuk:
 Menimbang setelah dikeringkan
 Melarutkan kembali, kemudian dititrasi
Menentukan selisih kuprioksida sebelum dan
sesudah direaksikan dengan gula reduksi
Penentuan gula reduksi dalam larutan:
 Cara luff Schoorl
 Cara Munson Walker
 Cara Lane-Eynon
 Cara Luff Schoorl

Yang ditentukan adalah CuO sebelum dan sesudah

direaksikan dengan gula reduksi
= (titrasi blanko – titrasi sampel)
Reaksi :
R – COH + CuO  Cu2O + R – COOH
H2SO4 + CuO  CuSO4 + H2O
CuSO4 + 2KI  CuI2 + K2SO4
2CuI2  Cu2I2 + I2
I2 + Na2S2O3  Na2S4O6 + NaI
I2 + amilum : biru
 Metode oksidasi dengan larutan Ferrisianida alkalis

Dasar : reduksi ferisianida  ferrosianida oleh gula reduksi.

2K3Fe(CN)6 + 2KI  2K4Fe(CN)6 + I2
2K4Fe(CN)6 + 3 ZnSO4  K2Zn2[Fe(CN)6]2 + 3 K2SO4
gula reduksi ditentukan :
 berdasar  I2
 berdasar  NaS2O3 untuk titrasi
Indikator : amilum (warna biru hilang)
K4Fe(CN)6 yang terbentuk dihitung dari selisih antara
K3Fe(CN)6 sebelum dan sesudah reaksi reduksi.

Perlu dilakukan percobaan standarisasi

 Metoda Iodometri

 Kelebihan I2 dititrasi dengan Na2S2O3

 Reaksi : Sampel Spesifik untuk aldosa,

ketosa hanya sedikit yang teroksidasi

 Harus dihilangkan zat yang dapat bereaksi

dengan Iodin : etanol, aseton, mannitol,

gliserin, Na laktat, Na format dan Urea
 Laktosa secara kimiawi
 25 ml susu + reagen  filtrat
 5 ml filtrat + reagen  titrasi dengan Na2S2O3

100
A = (Tb – Ts) x N x 0,171 x 
5

A = Kadar Laktosa (g/100 ml)

Tb = titrasi blanko
Ts = titrasi sampel

 Susu dengan kadar protein = 3,2%, lemak = 3,5%

dari 100 ml susu  48,4 ml filtrat

48,4 100
Kadar laktosa/100 ml susu = A x  x 
100 25
 Penentuan Sukrosa
Langsung dengan Polirimeter/refraktometer
Kimia : hidrolisa (tentukan jumlah gula reduksi)

C6H12O11 + H2O  C6H12O6 + C6H12O6

Sukrosa fruktosa glukosa
(342) (180) (180)

 Sukrosa = 0,95 x  gula reduksi


BM Sukrosa 342
FK =  = 
2 BM gula reduksi 360
Penting : Cek dulu kemungkinan adanya gula reduksi
dalam sampel sebelum hidrolisa.
 Penentuan pati

Prinsip : pati dihidrolisa dengan asam/enzim 

gula reduksi  ditera jumlahnya
[C6H10O25] m + mH2O  m C6H12O6
pati glukosa
BM = m.162 BM = 180 m
BM pati
FK = 
m . BM gula reduksi
m x 162
=  = 0,9
m x 180
 Cara Enzimatis

Terutama untuk penentuan gula dalam

campuran
 karena enzim bersifat spesifik
Misal: penentuan glukosa dan fruktosa

Dasar :
glukosa dan fruktosa difosforilasi menjadi
glu–6-fosfat (G6P) dan fruktosa-6-fosfat (F6P)
dengan bantuan enzim heksokinase dan Adenosin–
5-trifosfat (ATP)
 Glu + ATP  G-6-P + ADP
Fruk + ATP  F-6-P + ADP
G-6-P-DH
G-6-P + NADP  glukonat 6P + NADPH + H+

NADPH yang terbentuk setara dengan glukosa yang bereaksi 

diukur dengan spektrofotometer ( = 334, 340, 365 nm)

PGI
F-6-P  G-6-P

G-6P-DH
G-6-P + NADP  glukonat-6-P + NADPH + H+

Ditera
 Penentuan Laktosa dan Galaktosa

Dasar :

 galaktosidase
Laktosa + H2O Glukosa +  galaktosa

Gal DH
 galaktosa + NAD  asam galatonat + NADH + H+


ditera (I) pada = 334, 340, 365 nm
 C. Cara Khromatografi
Khromatografi kertas/TLC : diukur besarnya Rf tiap
komponoen karbohidrat

Jarak perpindahan molekul zat

Rf = 
Jarak perpindahan pelarut

Harga Rf
tiap jenis gula tertentu untuk perlakuan yang sama
dipengaruhi :
- Macam zat pelarut
- Ukuran bejana
- Suhu
- Macam fase tetap/stasioner
- Sifat zat yang dianalisa
 Kromatografi kertas untuk karbohidrat

 Zat penyangga : kertas yang tersusun

oleh selulosa murni (misal: kertas
whatman no.1 kecepatan merambat zat
sedang), dipotong sesuai kebutuhan.
 Teteskan sampel (sekecil mungkin),
penetesan 3-4 x (tetesan besar  terjadi
tailing/pemisah tidak sempurna)
 Masukkan kertas ke dalam wadah berisi
pelarut  pelarut merambat pada kertas
sampai tanda (Solvent front)
 Identifikasi :
Cara fisis : menyinari kertas dengan sinar UV

pada : 254 – 370 nm

Kimiawi : semprot dengan larutan kimia

misal:
-gula reduksi: anilinpthalat, AgNO3
- Larutan khloroglusional dan HCl dapat digunakan
-gula non reduksi: naphtoresorcinol dlm asam fosfat.
untuk:
 Aldosa pentosa (violet)
 Ketosa pentosa (hijau tua)
 Ketoheksosa (kuning coklat)
 Metil pentosa (hijau )
Uap Iodin
Semprotkan pada kertas diruang asam
Setelah kering akan timbul noda berwarna
Hitung Rf, bandingkan dengan standar

 Zat pelarut: zat murni atau campuran

 Untuk penentuan gula sederhana:
Campuran butanol : asetat : air atau
asam asetat : pyridin : air (4:1:5)
 Cara fisis (Cara optic)

 Penentuan index bias dengan refraktometer

 tiap jenis gula punya index bias tertentu.
 Keuntungan:
• interval skala index bias cukup besar 1,30 – 1,75
• sampel sangat sedikit (beberapa tetes)
• ketelitian :  0,0002
20
 dinyatakan dengan n D
= pengukuran pada t = 20oC dengan sinar Natrium
sebagai sumber sinar monokromatis.
 Pengaruh konsentrasi terhadap () sangat
kecil  diabaikan

 Suhu berpengaruh  perlu koreksi :

  D
t     1  0,000184 t  20 
D
t
 Penentuan karbohidrat dengan polarimeter

Dasar: Karbohidrat bersifat optis aktif (mampu memutar

bidang sinar terpolarisasi), karena mempunyai C asimetri

Keuntungan
 Sampel tidak mengalami kerusakan
 Dapat dilakukan cepat
Agar hasil teliti, maka:
 Larutan harus jernih dan tidak berwarna
Larutan tidak mengandung bahan asing yang
bersifat optis aktif
Konsentrasi sampel yang optimum: tidak
terlalu pekat amupun encer
 Penentuan dengan polarimeter

Hukum biot: kapasitas rotasi tiap individu gula

sebanding dengan konsentrasi larutan dan panjang
cairan dalam tabung
100
  D
t 
lC
[] : putaran/ritasi spesifik
t : suhu pengukuran (oC)
D : sinar Na (589 nm)
 : sdf putar yang diamati
C : konsentrasi (g sampel/100 ml pelarut)
I : panjang tabung (dm)
 Penentuan Serat Kasar

 Serat kasar :
Senyawa yang tidak dapat dicerna dalam
organ pencernaan manusia maupun
binatang.

 Dalam analisa : diperhitungkan

banyaknya zat yang tidak larut dalam
asam/basa encer pada kondisi tertentu.
Langkah penentuan serat kasar
1. Defatting : menghilangkan lemak dalam
sampel dengan pelarut lemak
2. Digestion :
- pelarutan dengan asam
- pelarutan dengan basa
 dalam keadaan tertutup pada temperatur
terkontrol (mendidih)
 segera dilakukan penyaringan untuk
mencegah kerusakan lebih lanjut
 Protein menyulitkan penyaringan  perlu digesti
pendahuluan dengan enzim proteolitik
 Residu = serat kasar yang mengandung 97%
selulosa dan lignin  sisanya adalah senyawa
yang belum dapat diidentifikasi