1.

Metode Biuret

 Prinsip
Warna ungu keunguan dihasilkan ketika ion cupric dikomplekskan dengan ikatan peptida (zat yang
mengandung setidaknya dua ikatan peptida, yaitu, biuret, peptida besar, dan semua protein) dalam
kondisi basa (Gbr. 9-2). Absorbansi warna yang dihasilkan dibaca pada 540nm. Intensitas warna
(absorbansi) sebanding dengan kandungan protein sampel (14).
 Prosedure
1. Reagen biuret 5 ml dicampur dengan 1 ml bagian larutan protein (1–10 mg protein / ml). Reagen
tersebut meliputi tembaga sulfat, NaOH, dan kalium natrium tartrat, yang digunakan untuk
menstabilkan ion cupric dalam larutan alkali.
2. Setelah campuran reaksi dibiarkan pada suhu kamar selama 15 atau 30 menit, absorbansi dibaca pada
540nm terhadap blanko reagen.
3. Filtrasi atau sentrifugasi sebelum membaca absorbansi diperlukan jika campuran reaksi tidak jernih.
4. Kurva standar konsentrasi versus absorbansi dibuat dengan menggunakan albumin serum sapi (BSA).
 Aplikasi
Metode biuret telah digunakan untuk menentukan protein dalam sereal (15, 16), daging (17), protein
kedelai (18), dan sebagai uji kualitatif untuk pakan ternak [Metode AOAC 935.11 (mengacu pada
Metode 22.012–22.013 ,AOAC, edisi ke-10, 1965)] (19). Metode biuret juga dapat digunakan untuk
mengukur kandungan protein dari protein yang diisolasi.
Keuntungan:
1. Lebih murah daripada metode Kjeldahl; cepat (dapat diselesaikan kurang dari 30 menit); metode
paling sederhana untuk analisis protein.
2. Penyimpangan warna lebih jarang ditemui dibandingkan dengan metode Lowry, penyerapan
ultraviolet (UV), atau turbidimetri (dijelaskan di bawah).
3. Sangat sedikit zat selain protein dalam makanan yang mengganggu reaksi biuret.
4. Tidak mendeteksi nitrogen dari sumber nonpeptida atau nonprotein.
Kekurangan:
1. Tidak terlalu sensitif dibandingkan dengan metode Lowry; membutuhkan setidaknya 2-4mg protein
untuk pengujian.
2. Absorbansi dapat berkontribusi pada pigmen jika ada.
3. Konsentrasi garam amonium yang tinggi mengganggu reaksi.
4. Warna bervariasi dengan protein yang berbeda; agar-agar memberi warna ungu kemerahan.
5. Opalescence dapat terjadi dalam larutan akhir jika terdapat karbohidrat tingkat tinggi pada paru-paru.
6. Bukan metode mutlak: warna harus distandarisasi terhadap protein yang diketahui (misalnya, BSA)
atau terhadap metode nitrogen Kjeldahl.

2. Metode Lowry

 Prinsip Metode
Lowry (20,21) menggabungkan reaksi biuret dengan reduksi fenolreagen Folin-Ciocalteau (asam
fosfomolibdis-fosfotungistik) oleh residu tirosin dan triptofan dalam protein (Gbr.9-3). Warna biru yang
dikembangkan konsentrasi protein rendah) atau 500nm (sensitivitas rendah untuk konsentrasi protein
tinggi). Prosedur asli telah dimodifikasi oleh Miller (22) dan Hartree (23) untuk meningkatkan linearitas
respon warna terhadap konsentrasi protein.
 Prosedur
berikut ini didasarkan pada prosedur yang dimodifikasi dari Hartree (23):
1. Protein dianalisis diencerkan ke kisaran yang sesuai (20-100μg).
2. Larutan K Na Tartrate-Na2CO3 ditambahkan setelah pendinginan dan diinkubasi pada suhu kamar
selama 10 menit.
3. Larutan CuSO4-K Na Tartrate-NaOH ditambahkan setelah pendinginan dan diinkubasi pada suhu
kamar selama 10 menit.
4. Reagen Folin yang baru disiapkan ditambahkan dan kemudian campuran reaksi dicampur dan
diinkubasi pada suhu 50◦C selama 10 menit.
5. Absorbansi dibaca pada 650nm.
6. Kurva standar BSA dikonstruksi dengan hati-hati untuk memperkirakan konsentrasi yang tidak
diketahui.
 Aplikasi
Karena kesederhanaan dan kepekaannya, metode Lowry telah banyak digunakan dalam biokimia
protein. Namun, ini belum banyak digunakan untuk menentukan protein dalam sistem pangan tanpa
terlebih dahulu mengekstraksi protein dari campuran makanan.
Keuntungan:
1. Sangat sensitif (a) 50–100 kali lebih sensitif dibandingkan metode biuret (b) 10-20 kali lebih sensitif
dibandingkan metode penyerapan 280-nmUV (dijelaskan di bawah) (c) Sensitivitas serupa dengan
Nesslerization; Namun, lebih nyaman daripada Nesslerization
2. Lebih sedikit dipengaruhi oleh kekeruhan sampel.
3. Lebih spesifik daripada kebanyakan metode lainnya.
4. Relatif sederhana; bisa dilakukan dalam 1–1.5h.
Kekurangan:
Untuk alasan berikut, prosedur Lowry memerlukan standar yang cermat untuk aplikasi tertentu:
1. Warna bervariasi dengan protein yang berbeda untuk tingkat yang lebih besar daripada metode
biuret.
2. Warna tidak terlalu proporsional untuk konsentrasi protein.
3. Reaksi terganggu dengan berbagai tingkat oleh sukrosa, lipid, buffer fosfat, monosakarida, dan
heksoamina.
4. Konsentrasi tinggi gula reduksi, amonium sulfat, dan senyawa sulfhidril mengganggu reaksi.
Metode Biuret

Metode Lowry
Pengujian kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Lowry. Analisis kadar
protein menggunakan metode Lowry yaitu dengan cara mengencerkan dadih dengan aquadest,
menyiapkan sampel cair, menambahkan biuret, melakukan inkubasi dan membaca skala pada
Photometer Boehringer dengan panjang gelombang 546-550 nm. Metode Lowry merupakan uji
protein secara kuantitatif secara modern, yaitu dengan spektrofotometer visible. Metode ini
digunakan untuk menguji kadar protein terlarut atau protein yang dapat diserap oleh tubuh.
Dalam metode Lowry dikenal dua reagen yaitu reagen Lowry A dan reagen Lowry B.
Prinsip kerja dari metode Lowry adalah reaksi antara protein dengan asam fosfotungstat-
fosfomolibdat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya tergantung
pada konsentrasi protein yang ditera. Sebelum dilakukan peneraan, terlebih dahulu dilakukan
pengenceran terhadap sampel supaya masuk dalam range standard protein yang telah dibuat
sebelumnya. Dalam hal ini sampel diencerkan sampai 100 x factor pengenceran (1 ml ditambah
aquadest sampai volumenya 100 ml) (Nisa et al., 2007)