Laporan Praktikum

Struktur dan Fungsi Subseluler

Hari/tanggal
Waktu
PJP
Asisten

: Senin, 17 Maret 2014

: 08.00-11.00 WIB
: Syaefudin, SSi, MSi
: Dwi Ayu Setianingrum
Syahrul Mustopa
Puji Rahmadani
Mustika Weni

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE LOWRY

Kelompok 14
Herlani Tri Widhiastuti
Bella Marisa
Dhani Lutfi R

G84120046
G84120016
G84120078

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PENDAHULUAN

Terdapat beberapa metode dalam penentuan kadar protein, salah satunya

adalah metode Lowry. Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode
Biuret. Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain
(Folin-Ciocalteau phenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan
dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara
500 - 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Muncul puncak kecil di
sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan
konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar di sekitar 750 nm yang dapat
digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah. Metode
ini lebih sensitif untuk protein dengan konsentrasi rendah dibanding metode
biuret. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya
(Harr 2002).
Reagen Lowry ada empat macam yaitu reagen A yang terdiri dari
fosfotungstat-fosfomolibdad (1:1) dan reagen Lowry B yang terdiri dari Nacarbonat 2% dalam NaOH 0,1 N, kupri sulfat dan Na-K-tartat 2%. Reagen C
merupakan campuran dari 50 ml reagen A dan 1 ml reagen B, sedangkan reagen D
merupakan pengenceran folin ciocalteu 2,5 M menjadi 1M. Reagen folin ciocalteu
apat mendeteksi residu tirosin (dalam protein) karena kandungan fenolik dalam
residu tersebut mampu mereduksi fosfotungsat dan fosfomolibdat, yang
merupakan konstituen utama reagen folin ciocalteu, menjadi tungsten dan
molibdenum yang berwarna biru. Hasil reduksi ini menunjukkan puncak absorbsi
yang lebar pada daerah merah. Sensitifitas dari metode folin ciocalteu ini
mengalami perbaikan yang cukup signifikan apabila digabung dengan ion-ion Cu.
(Copriady 2011).
Uji Lowry sering digunakan dalam industri gen, biasanya uji Lowry
digunakan untuk menguji kadar protein sampel yang dapat digunakan sebagai
obat (Kusmiati 2007). Uji Lowry juga dapat diterapkan dalam menentukan kadar
protein dalam makanan seperti telur dan susu (Copriady 2011). Selain itu, dapat
digunakan untuk mengukur protein dalam intrasel bakteri yang akan digunakan
sebagai vaksin (Hermanto 2008).

Praktikum bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu sampel

dengan metode Lowry dengan menggunakan instrumen spektrofotometer 20 D
dan kurva standar absorbansi.
METODE PRAKTIKUM
Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Pendidikan 1 Biokimia
Departemen Biokimia FMIPA IPB. Waktu praktikum yaitu hari Senin, 17 Maret
2014 pukul 08.00 11.00 WIB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah spectronic 20-D,
kuvet, labu takar, pipet tetes, pipet mohr, tabung reaksi, vortex, dan gelas
piala.Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini antara lain reagen C,
reagen D, sampel protein, BSA (Bovine Serum Albumin), larutan NaCl, dan
aquades.
Prosedur Percobaan
Penentua kurva standar. Menyiapkan 7 buah tabung reaksi yang berisi
reagen BSA (400 g/ml) dengan masing-masing konsentrasi 0 ml, 0,05 ml, 0,1
ml, 0,15 ml, 0,2 ml, 0,25 ml, dan 0,3 ml ,kemudian ditambahkan aquades masingmasing 0,5 ml, 0,45 ml, 0,4 ml, 0,35 ml, 0,3 ml, 0,25 ml, dan 0,2 ml. Setelah itu,
ditambahkan reagen C masing-masing 5 ml, kemudian dikocok dan didiamkan
selama 10 menit. Kemudian ditambahkan kembali reagen D masing-masing 0,5
ml dan didiamkan selama 30 menit, lalu diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 700 nm.
Pembuatan sampel. Disiapkan dua buah tabung reaksi yang berisi sampel
protein masing-masing 0,5 ml, kemudian ditambahkan 5 ml reagen C dan
divortex. Setelah itu, didiamkan selama 10 menit, lalu ditambahkan 0,5 ml reagen
D pada masing-masing tabung dan didiamkan selama 30 menit, kemudian diukur
nilai absorbansinya menggunakan panjang gelombang 700 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penentuan kadar sampel protein dilakukan dengan metode Lowry
menggunakan spektrofotometri serta menggunakan kurva standar hubunga antara
nilai absorbansi dengan konsetrasi sampel dalam g/ml dan didapatkan hasil
sebagai berikut.
Tabel 1 Analisis kuantitas standar BSA
Tabung
Absorbansi
Absorbansi
Terukur
Terkoreksi
1
0.14
0
2
0.237
0.097
3
0.257
0.117
4
0.364
0.224
5
0.482
0.342
6
0.541
0.401
7
0.549
0.409
Contoh perhitungan:

[BSA]
(g/ml)
0
40
80
120
160
200
240

Absorbansi terkoreksi = Absorbansi terukur Absorbansi blanko

= 0,237 0,140
= 0,097
[BSA] (g/ml) (Tabung 2)
V1.M1 = V2.M2
0,05 ml.400 g/ml = 0,5 ml . M2
M2 = 40 g/ml
0.45
0.4 f(x) = 0x + 0.01
R = 0.96
0.35
0.3
0.25
Absorbansi terkoreksi (A) 0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 50 100 150 200 250 300
Konsentrasi BSA (g/mL)

Gambar 1 Hubungan konsetrasi BSA dengan absorbansi

Tabel 2 Analisis kuantitas protein
Ulangan
Absorbansi
Absorbansi
Terukur
Terkoreksi
1
0,229
0,089

[protein]
(g/ml)
83

2
Rata-rata

0,222

0,082

76
79,5

Contoh perhitungan:

Absorbansi terkoreksi = Absorbansi terukur Absorbansi blanko

= 0,229 0,140
= 0,089
[ Protein ] = y=a+bx
y=o .oo 6 4+ o . oo 18 x
0.089=o . oo 6 4+ o . oo 1 8 x
x=83
Ulangan 1+langan2
Rerata=
2
83+ 76

2
= 79.5 g/mL

Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B)

menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion
Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E)
membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya. Terdapat 2 reaksi dalam
metode Lowry, yaitu kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana
metode biuret yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I).
Ion

Cu+ kemudian

akan

mereduksi

phosphomolibdat-phosphotungstat

reagen

Folin-Ciocalteu,

kompleks

menghasilkan heteropoly-molybdenum

blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis
Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri
(Lowry 1951). Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali)
daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit.
Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry
lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya (Bintang 2010).
Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain
(Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan
dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara
500 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak
kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan
konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar disekitar 750 nm yang dapat

digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah. Perlakuan

inkubasi selama 10 menit dan 30 menit setelah penambahan reagen dilakukan
untuk membuat zat warna mengompleks pada sampel protein dengan stabil
sehingga dapat ditentukan nilai absorbansinya dari warna yang terbentuk
(Waterborg 2002).
Pengukuran protein menggunakan metode Lowry memiliki kelebihan dan
kelemahan. Kelebihannya yaitu metode ini sama sensitif dengan reagen Nessler
namun tidak memerlukan digestion. Metode ini 10 atau 20 kali lebih sensitif dari
pengukuran penyerapan ultraviolet di panjang gelombang 280 nm dan jauh lebih
spesifik, apalagi sensitif terhadap gangguan oleh kekeruhan. Metode ini memiliki
dua kekuarangan yaitu warna tidak sepenuhnya sebanding dengan konsentrasi dan
tidak dapat digunakan untuk mengukur protein campuran terutama nilai absolut
karena jumlah warna bervariasi dengan protein yang berbeda sehingga akan
mempengaruhi panjang gelombang yang digunakan(Lowry 1951).
Hasil

percobaan

kurva

standar

menunjukkan

bahwa

semakin

meningkatnya nilai absorbansi maka konsentrasi juga meningkat. Hal ini dapat
dilihat pada gambar grafik. Pengukuran sampel dilakukan dengan dua kali
ulangan dan diperoleh konsentrasi BSA sebesar 83 g/ml untuk nilai absorbansi
0,089 dan 76 g/ml untuk nilai absorbansi 0,082. nilai yan didapat telat sesuai
dengan teori yaitu konsentrasi meningkat seiring meningkatnya nilai absorbansi.
Jika dibandingkan dengan nilai kurva standar, nilai konsentrasi pada sampel jauh
di atas dari konsentrasi BSA pada kurva standar yang menunjukkan nilai
konsentrasi sebesar 40 g/ml dengan nilai absorbansi sekitar 0,097. Hal ini
mungkin disebabkan karena kandungan protein dalam sampel dan BSA yang
berbeda sehingga memberikan nilai yang berbeda.
SIMPULAN
Metode Lowry dapat digunakan untuk mengetahui kadar protein dari suatu
bahan dengan menggunakan spektrofotometri. Metode ini lebih sensitif dari
metode Biuret dan memberikan warna yang berbeda pada setiap jenis protein.
Kadar protein dalam sampel yang diuji sebesar 83 g/ml dan 76 g/ml.
Konsentrasi sampel berbanding lurus dengan nilai absorbansi.

DAFTAR PUSTAKA
Bintang M.2010. Biokimia teknik Penelitian. Jakarta (ID): Erlangga.
Copriady J et al. 2011. Isolasi karakterisasi dan penentuan kadar laktalbumin susu
sapi fries holdstein dengan metode Lowry. Jurnal Nature Indonesia. 13(2):
134-137.
Harr R. 2002. Resensi Ilmu Laboratorium Klinis. Jakarta (ID): Penerbit Buku
Kedokteran EGC.
Hermanto S et al. 2008. Profil protein Escherichia coli hasil inaktivasi iradiasi
gamma sebagai bahan vaksin mastitis. Jurnal Nature Indonesia. 4(2): 53-57.
Kusmiati et al. 2007. Pengaruh penambahan urasil dalam media fermentasi
terhadap hasil -glukan dari dua galur agrobacterium. Makara Sains. 11(2):
68-74.
Lowry et al. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. New
York: Kluwer Academic Publishers.
Waterborg J. 2002. The Lowry method for protein quantification from the Protein
protocols handbook. Biomedical and Life Sciences. 1: 7-9.