SPEKTROFOTOMETRI

• Spektrofotometri merupakan salah satu

metode dalam kimia analisis yang digunakan
untuk menentukan komposisi suatu sampel
baik secara kuantitatif maupun kualitatif yang
didasarkan pada interaksi antara materi
dengan cahaya.
• Pada analisis kualitatif misalnya digunakan untuk memperoleh
informasi adanya gugus fungsional tertentu dalam suatu molekul
atau senyawa berdasarkan serapan panjang gelombangnya.

• Pada analisis kuantitatif misalnya digunakan untuk menentukan

kandungan atau kadar suatu zat dalam suatu bahan alam.

• Cahaya yang digunakan dapat berupa cahaya visibel, UV dan

inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom maupun
molekul.

• Sinar atau cahaya yang digunakan disebut sebagai radiasi

elektromagnetik.
Jenis metode analisis spektrofotometri
Berdasarkan jenis materi yang berinteraksi dengan radiasi
elektromagnetik, dibedakan :
• Spektrometri molekul : radiasi elektromagnetik berinteraksi
dengan molekul
Contoh : NMR, IR, UV-Vis, XRD

• Spektrometri atom : radiasi elektromagnetik berinteraksi dengan

atom
Contoh : AAS (Atomic Absorbtion Spectroscopy)

Berdasarkan radiasinya, dibedakan menjadi “Spektrometri Absorbsi”

dan “Spektrometri Emisi”
Radiasi Elektromagnetik
Apabila cahaya atau radiasi elektromagnetik berinteraksi dengan materi,
maka kemungkinan radiasi elektromagnetik akan dihamburkan,
diabsorbsi atau diemisikan sehingga dikenal ada spektroskopi
hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun spektroskopi emisi.

Sifat Radiasi Elektromagnetik

Radiasi elektromagnetik mempunyai sifat ganda (sifat dualistik cahaya)
yaitu:
1) Sebagai gelombang
Mempunyai parameter berupa kecepatan, panjang gelombang,
frekuensi dan amplitudo
2) Sebagai partikel
Radiasi elektromagnetik sebagai partikel yang bertenaga yang
disebut foton. Tenaga foton berbanding lurus dengan frekuensi
radiasi
Panjang gelombang (λ) didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak.
Hubungan antara panjang gelombang, frekuensi dan kecepatan
cahaya yang dinyatakan dalam persamaan:
c= λ.v
λ = c/v
v = c/λ

Hubungan antara panjang gelombang, frekuensi dan energi foton

dirumuskan oleh Planck, yang dikenal dengan persamaan Planck.
E=h.v
E = h . c/λ
Dimana : E = energi tiap foton
h = tetapan Planck (6,624 x 10-34 J.det),
v = frekuensi sinar
c = kecepatan cahaya (2,9976 x 1010 cm /det).
Dari rumus di atas dapat diketahui bahwa :
• Energi dan frekuensi suatu foton akan berbanding terbalik
dengan panjang gelombang, tetapi energi yang dimiliki suatu
foton akan berbanding lurus dengan frekuensinya.
• Cahaya yang mempunyai panjang gelombang lebih pendek akan
menghasilkan energi yang lebih besar.
Misalnya:
Energi yang dihasilkan cahaya UV lebih besar dari pada energi yang
dihasilkan sinar tampak. Hal ini disebabkan UV memiliki panjang
gelombang (λ) yang lebih pendek (100–400 nm) dibanding panjang
gelombang yang dimiliki sinar tampak (400–800 nm).
 Interaksi Radiasi Elektromagnetik dengan Materi
Jika cayaha dikenakan pada suatu senyawa, maka sebagian dari cahaya
tersebut diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari
molekul tersebut. Setiap senyawa mempunyai tingkatan energi yang
spesifik.
E3
E2 Tingkat tereksitasi
E1

Cahaya (E=hc/λ1) Cahaya ( E=hc/λ2)

Tingkat dasar
• Bila cahaya mempunyai energi yang sama dengan selisih energi
antara tingkatan dasar (G) dan tingkatan tereksitasi (E1, E2 dst.) jatuh
mengenai suatu senyawa, maka elektrron-elektron pada tingkatan
dasar akan tereksitasi ke tingkatan energi yang lebih tinggi (tingkatan
tereksitasi), dan sebagian energi cahaya yang panjang gelombangnya
sesuai akan diserap. Elektron-elektron yang tereksitasi akan
melepaskan energi dengan proses radiasi panas/emisi dan kembali ke
tingkatan energi dasar.

• Karena perbedaan energi antara tingkatan dasar dan tingkatan

tereksitasi spesifik untuk setiap senyawa, maka freksuensi yang
diserap juga spesifik.

• Gambar hubungan intensitas radiasi (absorbansi) sebagai fungsi

panjang gelombang atau frekuensi disebut sebagai spektrum
serapan. Hal ini yang digunakan sebagai dasar dalam analisis
spektrofotometri.
Analisis Spektrofotometri
• Interaksi antara materi dengan cahaya terjadi penyerapan cahaya,
baik cahaya Uv, Vis, UV-Vis maupun IR oleh materi sehingga
spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi.

• Pada spektrofotometri UV, Vis, UV-Vis dan IR memiliki prinsip kerja

yang sama yaitu adanya “ interaksi antara materi dengan cahaya
yang memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya terletak
pada panjang gelombang yang digunakan.
 Spektrofotometri UV
Dasar analisis:
senyawa harus memiliki kromofor dan
auksokrom yang memadai

KROMOFOR
bagian molekul yang bertanggung jawab
pada penyerapan cahaya

AUKSOKROM
gugus fungsi yang memiliki hetero atom
dan menempel langsung pada sistem
kromofor
 Spektrofotometri Visibel
Dasar analisis:
- Senyawa asli/asal harus berwarna
- Bila senyawa asli tidak berwarna,
dapat diubah menjadi senyawa
berwarna dengan cara:
a. pembentukan senyawa komplek
b. memperpanjang kromofor
Instrumen (Spektrofotometer)
Fungsi tiap komponen:
1. Sumber sinar polikromatis
sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai
macam rentang panjang gelombang.

2. Monokromator
sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya
yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya
monokromatis.

3.Sel sampel
sebagai tempat meletakan sampel

4. Detektor
sebagai penangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan
mengubahnya menjadi arus listrik
Cara Kerja:
• Tempatkan larutan pembanding (misalnya blanko) pada sel pertama
dan larutan sampel pada sel ke dua.
• Pilih fotosel yang sesuai agar panjang gelombang yang dibutuhkan
dapat terpenuhi.
• Pilih panjang gelombang yang diinginkan .
• Lewatkan berkas cahaya pada larutan.
• Skala absorbansi menunjukkan absorbansi dari larutan.

 Zat yang akan dianalisis harus memiliki kromofor yang mencukupi

[ Amati dari nilai koefisien ekstingsi Molar-nya (  ) harus lebih dari
1000 M-1.cm-1].
 Larutan akhir sebelum diukur absorbannya harus jernih. Bila tidak
jernih  terjadi penghamburan sinar oleh partikel yang tidak larut
tersebut.
Analisis Kuantitatif
• Analisis kuantitatif digunakan untuk menentukan kandungan atau
kadar suatu zat dalam suatu bahan alam.

• Dalam melakukan analisis kuantitatif secara spektrofotometri, berkas

cahaya dengan berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis)
dikenakan pada suatu cuplikan dan cahaya dengan panjang
gelombang tertentu saja yang akan diserap.

• Radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas cahaya yang masuk (I0) dengan intensitas
cahaya yang ditransmisikan (It).
• Intensitas radiasi dari berkas cahaya sebanding dengan jumlah foton
per detik yang melalui satu satuan luas penampang.
Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat :
• Dari gambar terlihat bahwa zat sebelum melewati sel sampel lebih
terang atau lebih banyak di banding cahaya setelah melewati sel
sampel. Hal ini menunjukkan bahwa sebagian cahaya diserap oleh
zat yang ada dalam sampel.

• Cahaya yang diserap oleh materi diukur sebagai absorbansi (A,)

sedangkan cahaya yang dihamburkan diukur sebagai transmitansi
(T).

Hukum lambert-beer atau Hukum Beer :

“jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan
sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan
merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal
larutan”.
• Berdasarkan hukum Lambert-Beer, untuk menghitung banyaknya
cahaya yang dihamburkan (transmitansi) menggunakan rumus:

Absorbansi (A) dinyatakan dengan rumus:

dimana :
A : absorbansi
I0 : intensitas cahaya masuk
It : intensitas cahaya setelah melewati zat.
Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:

A = a.b.c atau A = ε. b. c

dimana:
A = absorbansi
b ( l ) = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)
c = konsentrasi larutan yang diukur
ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur
dalam molar)
a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam
ppm).

 Makin tinggi konsentrasi akan menghasilkan absorbansi yang

semakin tinggi, atau sebaliknya.
Dalam penurunan hukum Lambert-beer harus memenuhi kriteria :
1. Radiasi yang masuk merupakan sinar monokromatis (panjang
gelombang tunggal ).
2. Dalam proses penyerapan, spesies penyerap tidak dipengaruhi oleh
molekul lain yang ada bersama dalam satu larutan
3. Penyerapan terjadi dalam volume larutan yang mempunyai luas
penampang (tebal kuvet) yang sama.
4. Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran fluoresensi
( pemancaran radiasi harus berlangsung cepat), artinya larutan yang
diukur harus benar-benar jernih agar tidak terjadi hamburan
cahaya oleh partikel-partikel koloid atau suspensi yang ada di dalam
larutan.
5. Konsentrasi analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan
menggangu kelinearan grafik absorbansi versus konsntrasi.
Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan
spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit (kurva
absorbansi vs konsentrasi tidak linear ):
1. Adanya serapan oleh pelarut.
Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blanko, yaitu larutan yang
berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk
warna.
2. Serapan oleh kuvet.
Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet
dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi
sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan
pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat
yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).
• Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah
panjang gelombang dimana suatu zat memberikan penyerapan paling
tinggi yang disebut λmaks. Hal ini disebabkan jika pengukuran
dilakukan pada panjang gelombang yang sama, maka data yang
diperoleh makin akurat atau kesalahan yang muncul makin kecil.

• Hubungan antara absorbansi terhadap konsentrasi akan linear (A≈C)

apabila nilai absorbansi larutan antara 0,2-0,8 (0,2 ≤ A ≥ 0,8) atau
sering disebut sebagai daerah berlaku hukum Lambert-Beer. Jika
absorbansi yang diperoleh lebih besar maka hubungan absorbansi
tidak linear lagi.
• Kurva kalibarasi hubungan antara absorbansi versus konsentrasi
dapat dilihat pada Gambar :
• Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar
tampak adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut harus
tampak berwarna, sehingga analisis yang didasarkan pada
pembentukan larutan berwarna disebut juga metode kolorimetri.

• Jika tidak berwarna maka larutan tersebut harus dijadikan berwarna

dengan cara memberi reagen tertentu yang spesifik. Dikatakan
spesifik karena hanya bereaksi dengan spesi yang akan dianalisis.
Reagen ini disebut reagen pembentuk warna (chromogenik reagent).
Menentukan konsentrasi sampel dengan cara kurva kalibrasi

Untuk menentukan konsentrasi suatu spesi yang ada dalam suatu

larutan, selain dengan menggunakan rumus yang diturunkan dari
hukum Lambert- Beer (A= a . b . c atau A = ε . b . c), dapat juga
menggunakan cara kurva kalibarasi. Cara ini sebenarnya masih tetap
didasarkan pada hukum Lambert-Beer yakni absorbansi berbanding
lurus dengan konsentrasi.

Langkah-langkah yang dilakukan dalam penentuan konsentrasi dengan

kurva kalibarasi:
1. Matching kuvet
Mencari dua buah kuvet yang memiliki absorbansi atau transmitansi
sama atau hampir sama. Dua buah kuvet inilah yang akan digunakan
untuk analisis, satu untuk blanko, satu untuk sampel. Dalam melakukan
analisis, Matching kuvet harus dilakukan agar kesalahannya makin kecil.
2. Membuat larutan standar pada berbagai konsentrasi. Larutan standar yaitu
larutan yang konsentrasinya telah diketahui secara pasti. Konsentrasi larutan
standar dibuat dari yang lebih kecil sampai lebih besar dari konsentrasi analit
yang diperkirakan.

3. Ambilah salah satu larutan standar, kemudian ukur pada berbagai panjang
gelombang. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pada panjang gelombang
berapa, absorbansi yang dihasilkan paling besar. Panjang gelombang yang
menghasilkan absorbansi paling besar atau paling tinggi disebut panjang
gelombang maksimum (lmaks).

4. Ukurlah absorbansi semua larutan standar yang telah dibuat pada panjang
gelombang maksimum.

5. Catat absorbansi yang dihasilkan dari semua larutan standar, kemudian

alurkan pada grafik absorbansi vs konsentrasi sehingga diperoleh suatu kurva
yang disebut, kurva kalibarasi. Dari hukum Lambart-Beer jika absorbansi yang
dihasilkan berkisar antara 0,2-0,8 maka grafik akan berbentuk garis lurus,
namun hal ini tidak dapat dipastikan.
Misalkan absorbansi yang dihasilkan dari larutan standar yang telah
dibuat adalah
Konsentrasi 2 4 6 8 10 12 14 16
(ppm)
Absorbansi 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

Maka grafiknya adalah

6. Ukurlah absorbansi larutan yang belum diketahui konsentrasinya.
Setelah diperoleh absorbansinya, masukan nilai tersebut pada grafik
yang diperoleh pada langkah 5. Misalkan absorbansi yang diperoleh
0,6. Maka jika ditarik garis lurus konsentrasi sampel akan sama
dengan konsentrasi larutan standar 10 ppm.

Grafik:
• Selain dengan cara kurva kalibrasi, konsentrasi sampel dapat
dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear:
Y=bX +a

Y = Variabel dependen (nilai yang diprediksikan)

X = Variabel independen
a = nilai Y jika X = 0 (harganya konstanta)
b = Koefisien regresi (nilai peningkatan atau penurunan)

Dengan bantuan kalkulator atau komputer persamaan di atas dapat

ditentukan.
Setelah diperoleh persamaan di atas, absorbansi sampel yang diperoleh
dimasukan sebagai nila Y sehingga diperoleh nila X. Nilai X yang
diperoleh merupakan konsentrasi sampel yang dianalisis
100 mg sampel yang mengandung Parasetamol
dilarutkan dengan etanol hingga 100 ml. diambil 10
ml diencerkan hingga 100 ml. dari larutan yang
sudah dilarutkan diukur Absorbansinya
ternyata A = 0,465. hitunglah % kadar parasetamol
dalam sampel tersebut ? Diketahui seri larutan baku
parasetamol sebagai berikut:
No. Konsentrasi Parasetamol Absorbansi
1 10 ppm 0,25
2 20 ppm 0,36
3 30 ppm 0,45
4 40 ppm 0,58
5 50 ppm 0,79

y = 0,013 x + 0,096
Menghitung kadar parasetamol dalam sampel
• Pembuatan Larutan Sampel:
• Berat sampel = 100 mg
• Vol larutan = 100 ml
• Konsentrasi sampel = 100 mg / 0,1 L = 1000 ppm
• Pengenceran yang dilakukan 10 ml menjadi 100 ml : 10 x
• Absorbansi sampel : 0,465
Persamaan garis regresi y = 0,013 x + 0,096

Maka setelah harga absorbansi sampel dimasukkan ke dalam

persamaan garis regresi :
y = 0,013 x + 0,096
0,465 = 0,013 x + 0,096
0,013 x = 0,369
x = 28,38 ppm
• Kadar parasetamol dalam sampel sebenarnya
= pengenceran x konsentrasi
= 10 x 28,38 ppm = 283,8 ppm
• Konsentrasi sampel = 1000 ppm
• Kadar parasetamol dalam sampel = (283,8 / 1000) x 100%
= 28,38 %
• Artinya dalam 100 mg sampel mengandung 28,38 mg parasetamol.
Analisis Kualitatif
• Analisis kualitatif digunakan untuk memperoleh informasi gugus
fungsional atau struktur suatu molekul atau senyawa berdasarkan
serapan panjang gelombangnya.
• Metode spektrofotometri UV-VIS dalam analisis kualitatif dapat
digunakan untuk memperoleh keterangan ada atau tidaknya gugus
fungsional tertentu dalam suatu molekul organik.
Berikut adalah tabel gugus-gugus penyerap cahaya pada panjang
gelombang UV-VIS:
Spektrofotometri Inframerah
• Bila molekul menyerap radiasi inframerah, energi yang diserap
menyebabkan molekul berada dalam keadaan vibrasi tereksitasi
(excited vibrational state)
• Energi yang diserap akan dilepaskan bila molekul kembali ke
keadaan dasar.
• Panjang gelombang absorbsi oleh suatu jenis ikatan tertentu,
bergantung pada macam getaran dari ikatan tersebut.
• Tipe ikatan yang berlainan (C-H, C-C, O-H dsb.) menyerap radiasi infra
merah pada panjang gelombang yang berlainan. Vibrasi suatu gugus
fungsi spesifik pada bilangan gelombang tertentu.
Contoh:
Jika diketahui bahwa vibrasi ikatan C–H dari metilena dalam cincin siklo
pentana berada pada daerah bilangan gelombang 1455 cm-1, maka jika
suatu senyawa spektrum senyawa X menunjukkan pita absorbsi pada
bilangan gelombang tersebut maka dapat disimpulkan bahwa senyawa
X tersebut mengandung gugus siklo pentana.
Spektrofotometri NMR (Nuclear Magnetic Resonance )
• Spektrofotometri Nuclear Magnetic Resonance (NMR) merupakan
salah satu metode analisis untuk menentukan struktur dari
komponen alami dan sintetik yang baru, kemurnian dari komponen,
dan arah reaksi kimia.
• Spektrofotometri NMR pada dasarnya merupakan spektrofotometri
absorbsi. Suatu plot dari frekuensi puncak-puncak absorbsi versus
intensitas puncak memberikan suatu spektrum NMR.
• Spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) memberikan
gambaran mengenai jenis atom, jumlah, maupun lingkungan atom
hidrogen (1H NMR) maupun karbon (13C NMR).
• Spektroskopi NMR didasarkan pada penyerapan gelombang radio
(dari 0,1 sampai dengan 100 MHz) oleh inti-inti tertentu dalam
molekul organik, apabila molekul tersebut berada dalam medan
magnet yang kuat.
• Inti proton (atom hidrogen) dan karbon (karbon 13) mempunyai sifat-
sifat magnet. Bila suatu senyawa mengandung hidrogen atau karbon
diletakkan dalam bidang magnet yang sangat kuat dan diradiasi
dengan radiasi elektromagnetik maka inti atom hidrogen dan karbon
dari senyawa tersebut akan menyerap energi melalui suatu proses
absorpsi yang dikenal dengan resonansi magnetik
• Kegunaan yang besar dari resonansi magnet inti adalah karena tidak
setiap proton dalam molekul beresonansi pada frekuensi yang identik
sama.
• Setiap proton dalam molekul dikelilingi elektron, sehingga
menimbulkan sedikit perbedaan lingkungan elektronik dari satu
proton dengan proton lainnya.
• Setiap inti atau proton dalam molekul mempunyai lingkungan kimia
yang berbeda.