SPEKTROFLUOROMETRI

KRISNA KHARISMA P., M.Sc., Apt.

ANALISIS SEDIAAN FARMASI
INSTITUT ILMU KESEHATAN BHAKTI WIYATA KEDIRI
Prinsip :

Molekul yang mempunyai kromofor dan

struktur yang rigid dapat dieksitasi oleh REM
uv-vis, dan akan mengemisikan REM yang
diabsorpsi pada λ yang lebih panjang.
Radiasi yang diemisikan ini yang diukur
intensitasnya
Penggunaan :

- Penentuan kadar zat yang dapat

berfluoresensi dalam pembawa/matrik yang
tidak berfluoresensi
- Uji batas impurities yang dapat berfluoresensi
- Mempelajari ikatan senyawa dalam reaksi
yang rumit/kompleks
- Mempelajari drug-protein binding (bioanalisis)

Laju dissolusi digoxin tablet (0,25 mg/tablet) : digoxin diderivatisasi

Uji batas : Al sebagai garam dengan 8 hidroksi quinoline dalam air untuk
hemodialisis
Gambar 2. Bagan fluorometer
Bioluminesensi
Kemiluminesensi

Luminol

Larutan
Oksigen
Forensik : luminol + Fe dalam hemoglobin

Luminol
+
2 H2O2 O2 + 2 H2O

Fe sebagai katalis

Luminol teroksidasi + hv
Fotoluminesensi
 JENIS FOTOLUMINESENSI

Radiasi/fluoresensi
resonansi
Fluoresensi Fosforesensi

Pergeseran Stokes
 TERJADINYA LUMINESENSI PADA ANTRASEN

S0 + UV 255 nm S2 (1)
S0 + UV 325 - 375 nm S2 (1)
Keduanya berfluoresensi pd 380, 402 dan 425 nm,
berfosforesensi pada 680 nm

DEAKTIVASI
1. Konversi internal - relaksasi vibrasional
2. Emisi fluoresensi
3. Intersystem crossing
4. Kuensing tumbukan
5. Emisi fosforesensi
 h
E =h =
VR

S2

IC
VR
S1

ISC T1
Transisi VR
S0 → S2 Transisi F
S0 → S1

O2 - Q
So
FF
IC

255 350

Keduanya berfluoresensi pd 380, 402 dan 425 nm,

berfofosresensi pada 680 nm

Gambar 1 Diagram transisi energi molekul antrasen

F = kf Po(1-e-bc) kf Po(2,3 bc)

foton terukur
k=
foton emisi
f = efisiensi kuantum dari fluoresensi
emisi foton /detik
f =
foton terserap/detik

Po = kekuatan radian dari radiasi eksitan

, = serapan molekuler, tergantung pada jenis
analit
b = tebal kuvet
c = kadar analit
Variable yang berpengaruh pada luminesensi
k karena emisi kesemua arah yang masuk dtektor
satu arah

Detektor photomultiplier
EFISIENSI KUANTUM f

 Jenis transisi oleh gugus fungsi, n, * atau , *

efisiensi kuantum , * > n, *
Intensitas fluoresensi relatif Jenis transisi gugus fungsi
Benzena 10 -
Anilina 20 , *
Asam benzoat 3 n, *

 Kekakuan struktur 

Fluorena > Bifenil

Gambar 3. Sumber eksitasi Po
A lampu Hg, Lampu Hg + P, Lampu Xenon
Pengaruh Suhu dan pelarut
Peningkatan suhu, Penurunan kekentalan larutan, solv ent atau solut yang mengandung atom
berat, (CCl4, etil-iodida

menurunkan efisiensi kuantum,

( karena meningkatkan frekuensi tumbukan → memudahkan konv ersi eksternal)

Pengaruh pH
terutama untuk senyawa berfluoresensi yang mempunyai gugus asam atau basa, karena
intensitas dan panjang gelombang emisi bentuk ion berbeda dengan bentuk non-ion. Misalnya
asam 1-naftil-4-sulfonat hanya terlihat dengan mata kalau dalam bentuk ion setelah
penambahan basa
Oksigen terlarut,
menyebabkan peredupan fluoresensi

( IC dan konversi kepada triplet state)

Kadar senyawa,
bila kadar senyawa besar (A>0,05), kurva baku tidak linier lagi

Logam berat
menyebabkan peredupan fluoresensi

Franck and Condon state,

akibat eksitasi terlalu kuat sehingga mengantarkan pada kedudukan di atas S2.
Pada lev el ini tidak akan terjadi fluoresensi, karena tidak terjadi relaksasi yang
mengantarkan ke kedudukan singlet tereksitasi
 KOMPONEN INSTRUMEN FLUORESENSI DAN
FOSFORESENSI

– SUMBER EKSITASI
Lampu pijar merkuri Lampu Hg + P
Lampu xenon Lampu D2
– MONOKROMATOR
Filter → FLUOROMETER
Grating → SPEKTROFLUOROMETER
– SEL SAMPEL
Kuvet fluorometer
Kuvet putar + labu Dewar → FOSFORIMETER
– DETEKTOR fotomultipler fotodioda
 FILTER
PLASTIK

7-54

Gambar 4. Daerah tapis filter

Gambar 5 Sel wadah fosforimeter
PENGGUNAAN FLUOROMETER

 Analisis kuantitatif senyawa berpendar

 Analisis kuantitatif senyawa berpendar pasca
derivatisasi
 Teknik analisis campuran
A menyerap UV, B tidak menyerap
A dan B menyerap UV, tetapi serapan B
efisiensi B <= 0,01 terhadap A → sinyal B dapat
diabaikan
A dan B menyerap pada daerah yang sama
tetapi daerah emisinya lain
 Diagnosa penyakit
KEUNGGULAN DAN KELEMAHAN

 Keunggulan
Kepekaan tinggi 10-8 – 10-9 M
Selektif, karena hanya beberapa senyawa
yang berpendar
 Kelemahan
Dapat terjadi eksitasi sampingan
Banyak senyawa yang meredupkan pendar
→ pemisahan
Beberapa senyawa peka radiasi UV
Presisi dan akurasi rendah 2 – 10%
 RINGKASAN PENDARAN
• terjadi pada makluq hidup, akibat reaksi kimia / kena REM
• terjadi jika elektron ikatan aras S1 kembali turun ke aras So
• F = kf Po(2,3 bc)
•k tergantung pada kepekaan detektor
•f tergantung pada gugus fungsinya
•Po tergantung pada intensitas sumber REM
• tergantung pada struktur inti senyawa analit
• Monokromator pendarfluor : filter (fluorometer) atau grating
(spektrofluorometer), sedangkan pada pendarfosfor hanya
digunakan grating saja
• Pengukuran dapat dilakukan dengan mengukur intensitas
pendar atau dengan mengukur kuensingnya
• Metode ini peka (dapat mengukur kadar 10-8 – 10-9 M), tetapi
presisi dan akurasinya rendah
Profil spektra absorpsi dan spektra emisi seperti bayangan cermin
 Penentuan kadar etinilestradiol dalam tablet.

Diketahui : Berat 20 tablet = 2,5673 g

Serbuk tablet = 0,5257 g, diekstraksi dengan metanol,
volume total ekstrak = 50,0 ml
diamati dengan λ eksitasi 280 nm, emisi 320 nm
Data fluoresensi ekstrak metanol dan fluoresensi ekstrak metanol
sesudah di beri NaOH 0,1 M (memadamkan fluoressensi etinilestradiol,
dengan mengionisasi gugus fenolnya) tercantum pada tabel berikut.

Fluoresensi sblm di + Fluoresensi ssd di +

Analit 0,1 M NaOH 0,1 M NaOH

Ekstrak metanol 64,1 3,5

Standart etinilestradiol 62,3 4,1

4,85 ppm

Ditanyakan : berapa kadar etinilestradiol ( µg) per tablet ?

SEKIAN