High Performance Liquid

Chromatography
[ HPLC ]
 HPLC

 Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan

cara melewatkan senyawa melalui fase diam
(stationary phase)

 Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi

dengan fase gerak (mobile phase)

 Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom

atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga
akan mempengaruhi kekuatan interaksi senya-
wa dengan fase diam dan fase gerak
HPLC-2011 2
 HPLC
 Senyawa yang keluar dari kolom akan
dideteksi dengan detektor yang sesuai dan
dilaporkan sebagai kromatogram

 kromatogram

HPLC-2011 3
  Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu
retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak

 Untuk:
- analisis kualitatif digunakan informasi tR,
- analisis kuantitatif digunakan informasi luas
area/tinggi puncak

HPLC-2011 4
 Kualitatif vs Kuantitatif

HPLC-2011 5
 Waktu tambat (tR)

 Waktu tambat atau retention time (tR)

adalah periode waktu yang dilalui dari
penyuntikkan sampel hingga diperoleh
rekaman signal maksimum. Waktu tambat
suatu zat selalu konstan pada kondisi
kromatografi yang sama.
 Dasar analisis kualitatif

HPLC-2011 6
  Suatu puncak kromatografi dapat
diidentifikasi dengan membandingkan
waktu tambatnya terhadap senyawa
baku (Meyer, 2004).
 Sebuah puncak memiliki tinggi puncak
(h) dan lebar puncak (Wb). Lebar
puncak yang diukur biasanya
merupakan lebar pada 5% tinggi
puncak (W0,05).
HPLC-2011 7
  Tinggi dan luas puncak berkaitan
secara proporsional atas kadar ataupun
jumlah analit tertentu yang terdapat
dalam sampel (memiliki informasi
kuantitatif). Namun demikian, luas
puncak lebih umum digunakan dalam
proses analisis, karena lebih akurat dan
lebih cermat daripada perhitungan
menggunakan tinggi puncak (Ornaf and
HPLC-2011 Dong, 2005). 8
 Faktor kapasitas (k’)
 Menurut Ornaf and Dong (2005), faktor
kapasitas ( k’) merupakan suatu ukuran
derajat tambatan dari analit yang tidak
dipengaruhi laju alir dan panjang kolom.
Faktor kapasitas dihitung dengan
membagi waktu tambat bersih (tR ) dengan
waktu hampa (to )
 seperti yang dapat dilihat pada rumus
berikut ini:
HPLC-2011 9
 t 'R t t
k'   R 0
t0 t0

Efisiensi kolom (N)

 Ukuran kuantitatif dari efisiensi kolom
disebut sebagai nilai lempeng (plate
number) atau N (Ornaf and Dong, 2005).
Menurut Kazakevich and LoBrutto (2007),
efisiensi adalah ukuran tingkat penyebaran
puncak dalam kolom. Efisiensi kolom
ditunjukkan dari jumlah lempeng teoritikal
atau theoretical plates (N), yang dapat
dihitung dengan rumus:
HPLC-2011 10
  Menurut Snyder et al. (1997), kolom
yang efisien adalah kolom yang mampu
menghasilkan pita sempit dan
memisahkan dengan baik setiap analit
dalam campuran (sampel). Nilai
lempeng akan semakin tinggi jika
ukuran kolom semakin panjang, hal ini
berarti proses pemisahan yang terjadi
semakin baik.
HPLC-2011 11
  Hubungan yang proporsional antara
nilai lempeng dengan panjang kolom
disebut sebagai tinggi setara dengan
lempeng teoritikal (Height Equivalent of
a Theoritical Plate atau HETP atau H)
dan dapat dihitung dengan
menggunakan rumus:

HPLC-2011 12
  Tujuan utama analisis KCKT secara
praktik adalah untuk mendapatkan nilai
lempeng teoritis yang maksimum, tinggi
setara dengan lempeng teoritikal yang
minimum dan efisiensi kolom yang
tertinggi (Snyder et al., 1997).

HPLC-2011 13
 HPLC

 Metode hplc dipilih bila akan menganalisis

senyawa dalam sampel:
- yang tercampur dengan matriks yang
sangat komplek
- dengan kadar sangat kecil

 Metode hplc dipilih bila akan menganalisis

beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)

HPLC-2011 14
 Tujuan akhir

HPLC

Pemisahan

HPLC-2011 15
 Resolusi

HPLC-2011 16
 Ukuran Daya Pisah

HPLC-2011 17
 Resolusi

HPLC-2011 18
 Instrumen

Instrumen KCKT terdiri atas 6 bagian (dapat

dilihat pada Gambar 8), yakni:
a) wadah fase gerak (reservoir),
b) pompa (pump),
c) tempat injeksi sampel (injector),
d) kolom (column),
e) detektor (detector) dan
f) akuisisi data dan sistem kontrol
HPLC-2011
(Kazakevich and LoBrutto, 2007).19
 Skema HPLC

HPLC-2011 20
HPLC-2011 21
 HPLC

HPLC-2011 22
 WADAH FASE GERAK
 Untuk menyimpan sejumlah fase gerak yang
secara langsung berhubungan dengan sistem.
 Wadah haruslah bersih dan inert, dan tidak
bereaksi dengan komponen fase gerak.
 Gelembung udara dalam fase gerak harus
dihilangkan sebelum digunakan karena adanya
gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor, sehingga akan
mengacaukan analisis (Meyer, 2004).

HPLC-2011 23
 POMPA

 Pompa yang digunakan pada KCKT

haruslah merupakan alat yang kokoh
untuk menghasilkan tekanan tinggi
hingga 350 bar atau bahkan 500 bar.
Tipe pompa yang umum digunakan
adalah pompa piston bersilinder pendek
(short-stroke piston pump).

HPLC-2011 24
  Laju alir dapat bervariasi dari 0,1 mL/menit
hingga 5 mL/menit, atau bahkan 10
mL/menit. Pompa terdiri dari motor, piring
putar (rotating disk/cam), piston dan katup
periksa (check valve).
 Piston dapat terbuat dari batu safir ataupun
keramik, sedangkan bola yang terdapat
didalam katup periksa (check valve) terbuat
dari batu rubi, sedangkan dudukan (seat)
terbuat dari batu safir.

HPLC-2011 25
 Tempat injeksi sampel
 Ada 3 jenis macam tempat injeksi sampel
atau injektor (injector), yakni:
a. Tempat injeksi sampel syringe (syringe
injector),
b. katup sampling (sampling valve) dan
c. Tempat injeksi sampel otomatik (automatic
injector).
Tempat injeksi sampel syringe merupakan
bentuk tempat injeksi sampel atau injektor
yang paling sederhana (Meyer, 2004).
HPLC-2011 26
  Tempat injeksi sampel otomatik (automatic
injector) atau disebut juga autosampler
memiliki prinsip yang mirip, hanya saja
sistem pemasukkan sampelnya bekerja
secara otomatis (Meyer, 2004).

HPLC-2011 27
 Rheodyne Loop Injector

HPLC-2011 28
 Rheodyne Loop Injection

HPLC-2011 29
 wadah untuk sampel yang siap diinjeksikan
[ jumlah kecil ]
HPLC-2011 30
HPLC-2011 31
 Detektor

Bagaimana
Memilih detektor
dan
Apa pertimbangannya

???

HPLC-2011 32
 Detektor
 Bulk property detector :
- mengukur sifat solute dan fase gerak
contoh : detektor indeks bias ( RI )

 Solute property detector :

- hanya mengukur sifat solute
- 1000 kali ≥ sensitif dibanding BPD
Contoh : detektor UV

HPLC-2011
(Settle, 1997; Kellner dkk., 1998; Adamovics, 1997)33
 Detektor

Detektor lain untuk HPLC :

Fluorescen
Elektrokimia
Konduktivitas
Mass spectrometer

(Settle, 1997; Kellner dkk., 1998; Adamovics, 1997)

HPLC-2011 34
HPLC-2011 35
HPLC-2011 36
  Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu
retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak

 Untuk:
- analisis kualitatif digunakan informasi tR,
- analisis kuantitatif digunakan informasi luas
area/tinggi puncak

HPLC-2011 37
 Kualitatif vs Kuantitatif

HPLC-2011 38
 HPLC

 Metode hplc dipilih bila akan menganalisis

senyawa dalam sampel:
- yang tercampur dengan matriks yang
sangat komplek
- dengan kadar sangat kecil

 Metode hplc dipilih bila akan menganalisis

beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)

HPLC-2011 39
 Tujuan akhir

HPLC

Pemisahan

HPLC-2011 40
 Resolusi

HPLC-2011 41
 Ukuran Daya Pisah

HPLC-2011 42
 Resolusi

HPLC-2011 43
 Bagaimana Memilih Kolom ?

 Untuk memilih kolom (fase diam), perhatikan

beberapa sifat senyawa seperti:
- kelarutan
- kepolaran

 Dengan memperhatikan sifat-sifat tersebut,

kolom dapat dipilih dengan petunjuk berikut ini

HPLC-2011 44
 Memilih Kolom HPLC

HPLC-2011 45
HPLC-2011 46
 Stationary Phase

HPLC-2011 47
HPLC-2011 48
HPLC-2011 49
HPLC-2011 50
 Polar

HPLC-2011 51
HPLC-2011 52
HPLC-2011 53
HPLC-2011 54
HPLC-2011 55
 Kolom (fase diam)

HPLC-2011 56
HPLC-2011 57
 Particle Size

HPLC-2011 58
 Beda Ukuran Partikel

HPLC-2011 59
 Kolom

 Performance kolom menurun seiring dengan

lamanya waktu penggunaan, yang ditandai
dengan peningkatan “backpressure” dan lebar
puncak kromatogram

HPLC-2011 60
 Pengoperasian Kolom

 Untuk kolom “Reversed-Phase” [C8, C18, fenil,

dll], gunakan petunjuk berikut:
- simpan kolom dalam asetonitril atau metanol
atau campuran air dan pelarut organik

- jangan mengoperasikan kolom melebihi pH

yang diperbolehkan (untuk kolom berbasis
silika, disarankan pH 2,5 – 8).
pH > 8  silika terlarut
pH < 2  bonded silika terhidrolisis
HPLC-2011 61
 Pengoperasian Kolom

 Jangan mengoperasikan kolom melebihi batas

suhu yang diijinkan, biasanya 60 – 80 0C (tanpa
konsultasi penjual kolom)

 Prosedur regenerasi atau “back-flushing”

mungkin dapat memperbaiki sebagian
performance kolom.

 Ingat bahwa, TIDAK semua kolom dapat di

back-flushed, karena “the inlet frits” memiliki
ukuran pori yang lebih besar untuk meminimal-
kan masalah penyumbatan
HPLC-2011 62
 Pengoperasian Kolom

 Selalu flush (aliri) kolom dengan pelarut kuat

(strong solvent) seperti metanol sebelum
digunakan untuk mengeliminasi setiap anlit
yang tertahan kuat

 Jangan pernah biarkan komponen bufer

tertinggal dalam dalam pompa atau kolom,
karena komponen bufer dapat mengendap dan
menimbulkan kerusakan

HPLC-2011 63
 Column Cleaning

HPLC-2011 64
 Column Cleaning

HPLC-2011 65
 Pencucian Kolom

 Bersihkan kolom dengan solven yang kuat.

- Untuk kolom Reversed-phase:
gunakan campuran 96% diklorometan dan 4%
metanol dengan 0,1% amonium hidroksida

- Untuk kolom Normal-phase:

gunakan metanol
Pada keadaan yang sulit:
- lakukan “back-flushing” kolom dengan kece-
patan alir rendah [ bila diperbolehkan !!! ]
HPLC-2011 66
 Fase Gerak

 Fase gerak pada pemisahan secara HPLC

dapat dipilih dengan mengkombinasikan dua
(2) atau lebih pelarut untuk mendapatkan
kepolaran tertentu agar terjadi pemisahan
dengan baik

 Perhatikan teknik pencampuran fase gerak

yang akan diginakan pada pemisahan

 Pencampuran fase gerak bisa dilakukan

manual atau dengan sistem pompa pada hplc
HPLC-2011 67
 Solvent Index Eluotropic Values UV Cut
Polarity Alumina C18 Silica off
(nm)
Hexane 0,1 0,01 - 0,00 195
Cyclohexane 0,2 0,04 - - 200
Toluene 2,4 0,29 - 0,22 284
Tetrahydrofuram 4,0 0,45 3,7 0,53 212
Chloroform 4,1 0,40 - 0,26 245
Ethyl acetate 4,4 0,58 - 0,48 256
Acetone 5,1 0,56 8,8 0,53 330
Methanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205
Acetonitrile 5,8 0,65 3,1 0,52 190
Dimethylformamide 6,4 - 7,6 - 268
Dimethylsulfoxide 7,2 0,62 - - 268
Water 10,2 - - - 190
HPLC-2011 Snyder dkk., 1997 68
 Kepolaran Campuran

HPLC-2011 69
 Penyiapan Fase Gerak

 Pada penyiapan fase gerak:

- ukur volume masing-masing pelarut secara
terpisah, kemudian campurkan dalam wadah
penampung

 Hal tersebut penting karena ada negatif V

pencampuran untuk beberapa pelarut

HPLC-2011 70
 Penyiapan 1 liter Metanol/Air
(50 : 50)

Cara Penyiapan:
Ukur 500 mL metanol dan 500 mL air secara
terpisah dalam gelas ukur, kemudian campur-
kan dalam wadah.

Jangan lakukan sbb:

Tuangkan 500 mL metanol ke dalam labu takar
1 liter, kemmudian adkan sampai tanda dengan
air.
Ahuja dan Dong, 2005, Hanbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, p.256.

HPLC-2011 71
 Penyiapan fase gerak

HPLC-2011 72
 Fase Gerak Yang Mengandung
Bufer

 Dipersiapkan sbb:

1. Gabungkan bahan-bahan bufer dengan

akuades untuk mendapatkan aqueous
buffer (larutan A)
2. Pastikan atau atur pH larutan A mengguna-
kan pH meter
3. Gabungkan volume pelarut organik (larutan
B, misal 200 mL) dengan larutan A tahap 2
misal 800 mL) untuk mendapatkan larutan
akhir fase gerak.
HPLC-2011 73
 Lanjutan….
 Pengukuran pH fase gerak yang mengandung
senyawa organik tidak dapat dipercaya karena
pH meter mengalami drift.

 Pendekatan yang biasa dikerjakan (tahap 1)

adalah:
- Melarutkan bahan komponen bufer dalam
akuades yang memiliki pH berbeda, kemudian
menggabungkan kedua larutan tersebut
dengan perbandingan yang sesuai untuk
mendapatkan larutan dengan nilai pH yang
dikehendaki.
HPLC-2011 74
 Lanjutan…
 Bila pH diatur pada tahap 2), dua larutan yang
sama seperti disebutkan di atas dapat
digunakan untuk menitrasi larutan akhir bufer
hingga nilai pH yang diinginkan, menggunakan
bantuan pH meter.

 Ketelitian pengukuran pH pada kebanyakan

laboratorium tidak lebih baik dari + 0,05 hingga
0,10 unit, yang dapat menyebabkan perubahan
resolusi pada beberapa sampel.

HPLC-2011 75
 HPLC BUFFER

HPLC-2011 76
HPLC-2011 77
 Larutan Bufer

HPLC-2011 78
 lanjutan

HPLC-2011 79
 Penggunaan Bufer

HPLC-2011 80
 Teknik Elusi

Isokratik:
- teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak tetap (polaritas tetap) selama proses
kromatografi berlangsung

Gradien:
- teknik elusi menggunakan komposisi fase
yang berubah-ubah (polaritas berubah) selama
proses kromatografi berlangsung
HPLC-2011 81
 Teknik Isokratik

HPLC-2011 82
 Eluen= campuran A + B

50 % B

40 % B

HPLC-2011 83
 30 % B

35 % B

HPLC-2011 84
 Teknik Gradien
Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas,
kemudian dilakukan
teknik elusi gradien

HPLC-2011 85
 Hasilnya

HPLC-2011 86
 Normal-Phase HPLC
[ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]

 Senyawa polar:
- terelusi belakangan (tR panjang)
- semakin non-polar fase gerak, tR senyawa
polar makin panjang

 Solven:
- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform

 Eluent strength:
- dimodifikasi dengan n-heksan
HPLC-2011 87
 Reversed-Phase HPLC
Reversed-Phase HPLC
[ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]

 Senyawa polar:
- terelusi lebih dahulu
 Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar
lebih kuat tertahan

 Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra-

hidrofuran
 Eluent strength:
- dimodifikasi dengan air
(Kellner dkk., 1998)
HPLC-2011 88
HPLC-2011 89
 HPLC-UV Detection
 Untuk keperluan analisis komponen utama
dalam sampel secara HPLC-UV diperlukan
minimal nilai  senyawa harus ≥ 10 M-1. cm-1
pada  ≥ 185 nm.

 Untuk keperluan trace analisis secara HPLC-

UV diperlukan minimal nilai  senyawa harus ≥
1000 M-1. cm-1

 Untuk trace analisis secara HPLC deteksi UV,

senyawa dengan nilai  senyawa  100 M-1.
cm-1 tidak mungkin dilakukan
HPLC-2011 Snyder dkk., 1997, p.63 90
 Kromofor UV-HPLC

HPLC-2011 91
 Kromofor UV-HPLC


HPLC-2011 92
 220
nm

254
nm

HPLC-2011 93
HPLC-2011 94
 Contoh Pengaturan Sensitivitas
( AUFs )
pada kromatogram hplc

HPLC-2011 95
HPLC-2011 96
 Mengapa HPLC-UV
Lebih Sensitif Dibanding
Spektrofotometri UV

HPLC-2011 97
 HPLC
Acetaminophen, Phenylephrine, and
Carbinoxamine.

HPLC-2011 98
HPLC-2011 99
HPLC-2011 100
 A B

HPLC-2011 101
 Luminescence

Bagaimana terjadinya fluorescensi ???

Fluorescensi

HPLC-2011 102
 Detektor UV vs Fluorescen

UV

Fluorescen

HPLC-2011 103
 Derivatisasi

Apa arti derivatisasi … ?

Apa tujuannya … ?
Bagaimana caranya … ?
Derivatisasi Post-/Pre-column … ?

HPLC-2011 104
 Tujuan Derivatisasi

 Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa

dengan pereaksi (agen) penderivat untuk
menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs

 Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa

dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-
kromofor  senyawa berkromofor)

 Meningkatkan daya deteksinya (senyawa

berkromofor UV  senyawa berkromofor
fluorescensi)
HPLC-2011 105
 Captopril
HS CH3
O

N COOH

Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC

dengan detektor UV ?
HPLC-2011 106
 Derivatisasi dg p-Br fenacylbromide

HS CH3
O
O
N COOH + Br C-CH2-Br

E
t
i
Captopril l p -Br fenacylbromide
a
m
i
n
HPLC-2011 107
 Hasil derivatisasi :
Captopril + p -Br Fenacylbromide

HS CH3
O
O O
N C-O-CH2-C Br

Dapat dideteksi secara UV

HPLC-2011 108
 PK. Captopril (HPLC)
 Parameter HPLC : (J.Pharm.Biomed.Anal., 1995, 13:
655-660)
- Column : 250 x 4.6 mm, Kontron Analytical S5
ODS2
- Mobile phase : MeCN: 1% Acetic acid (60:4)
- Flow rate : 1.3 mL/min.
- Detector : UV 260 nm
- Retention time : 4.0 min
- Limit of detection : 15 ng/mL
- Limit of quantitation : 30 ng/mL

HPLC-2011 109
 Gabapentin

O
H2N C
OH

R-NH2

Dapatkah Gabapentin dianalisis secara HPLC dengan

detektor UV atau Fluorescen ?
HPLC-2011 110
Derivatisasi dg Dansilklorid

H3 C CH3 H3C CH3

N N

+ R-NH2

- HCl

O=S=O O=S=O

Cl NH

R
HPLC-2011 111
Dansil klorid Fluorescent derivative
 Catecholamine

Catecholamine

HPLC-2011 112
Contoh Senyawa

Asli
Yang
Berfluorescensi
 Kunang-kunang

HPLC-2011 114
 Fluorescensi

HPLC-2011 115
Asam Salisilat

O
C
OH

H
O
As.Salisilat - Fluorescensi

O
C
OH

H
O
 Papaverin HCl

H3CO

OCH3
N
H3CO .HCl
CH2 OCH3
 Riboflavin
OH OH OH
CH2-CH-CH-CH-CH2OH

H3C N N O

NH
H3 C N
O
HPLC-2011 120
 Bentuk Kromatogram

 Bentuk kromatogram (peak) ada berma-

cam-macam, a.l:
- tailing, fronting (leading)
- asimetri, simetri
- pecah
- lainnya

HPLC-2011 121
 Peak asymmetry - tailing

USP

HPLC-2011 122
 Peak
Asymmetry vs Tailing

Baca:
HPLC-2011
Snyder dkk., 1997 123
 Kriteria Peak

HPLC-2011 124
 Pengatasan Peak Tailing
Tambahkan 30 mM:
- Trietilamin (utk seny. basa)
- Amonium asetat (utk seny. asam)

 Bila Tailing masih tetap ada, gantilah trietil-

amin dengan:
10 mM dimetiloktilamin atau dimetiloktil-
amin asetat

 Kurangi jumlah sampel hingga < 1 g

Bagaimana mekanisme kerja

TEA mencegah tailing ?
HPLC-2011 125
 Tailing Senyawa Basa
 Pada RP-HPLC, residu silanol [ Si-OH ] dalam
kolom yang bersifat asam, akan berikatan kuat
dengan senyawa basa [ R-NH2 ] yang melewati
kolom tersebut.

 Agar tidak terjadi tailing, ditambahkan amin

modifier ke dalam campuran fase gerak, misal:
trietilamin [ TEA ].

 TEA akan memasking residu Si-OH, sehingga

saat senyawa basa melewati kolom tidak
terjadi ikatan yang terlalu kuat, hingga
akhirnya dapat memperkecil terjadinya tailing.
HPLC-2011 126
 Penggunaan TEA
 Perhatikan jumlahnya, jangan terlalu banyak.
Bila terlalu banyak akan menghilangkan fungsi
residu silanol pada kolom RP-18.

 Untuk hal tersebut, lakukan optimasi !

Perhatikan:
pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan

fase gerak yang mengandung TEA

HPLC-2011 127
 Pencucian Kolom
 Jika kolom selesai dioperasikan menggunakan
fase gerak yang mengandung:
- trietilamin
- tetrabutilamonium

Maka lakukan:
- pencucian kolom dengan campuran antara
metanol dan 0,05% asam fosfat (50 : 50), baru
kemudian dengan metanol

Jangan aliri kolom hanya dengan air !

HPLC-2011 128
 Column Cleaning

HPLC-2011 129
 Column Cleaning

HPLC-2011 130
Kolom Terkontaminasi Metal
a

Baca:
Kromidas, S., 2000.

HPLC-2011 131
HPLC-2011 132
HPLC-2011 133
 Baca:
Kromidas, S., 2000.
HPLC-2011 134
HPLC-2011 135
HPLC-2011 136
 CTM

Cl O

H OH

.
CH3 OH
N CH(CH2)2N H
CH3
O

HPLC-2011 137
HPLC-2011 138
 Pelarut untuk Sampel
Acetonitrile Mobile phase
Baca:
Snyder dkk., 1997
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

HPLC-2011 139
 Efek Temperatur

Baca:
Snyder dkk., 1997

HPLC-2011 140
 Manufacturer

a b
a. Hypersil
b.Spherisorb
HPLC-2011 141
 Noise and Drift

HPLC-2011 142
 Pengaturan pH pada pemisahan
senyawa basa

HPLC-2011 143
HPLC-2011 144
145 HPLC-2011
 Amitriptilin

- H = Nortriptilin
146 HPLC-2011
147 HPLC-2011
 Contoh Lain
Ion Pairing Reagents

HPLC-2011 148
 ION PAIRING
[ pada hplc ]
 Adrenalin dapat dianalisis dengan kromato-
grafi fase normal (fase diam: silika gel,
unmodified silica gel).

 Umumnya membutuhkan kondisi basa kuat,

namun pada kondisi tersebut gugus katekol
pada adrenalin tidak stabil [ masalah ]

 Sementara, pada hplc fase terbalik, adrenalin

tidak ditahan pada kolom dan terelusi pada
void volume.
HPLC-2011 149
 Ion Pair Chromatography
 Metode yang umum digunakan untuk menga-
nalisis adrenalin dan senyawa-senyawa basa
yang sangat mudah larut air adalah dengan
Teknik:
“ kromatografi pasangan ion ”

 Hal tersebut secara mendasar dapat dipan-

dang sebagai pembentukan kolom penukar ion
in situ.
 Proses tersebut diilustrasikan pada Gbr.12.14

HPLC-2011 150
 Adreanalin - Ion Pair
 Parameter HPLC:
Kolom : Oktadesil silan (ODS)
Fase gerak : Sodium phosphate buffer 0.1 M,
Methanol ( 9 : 1 ) mengandung
0.02% sodium octane sulfonic acid (SOSA).
[ SOSA terpartisi ke ODS dan menjenuhinya ]

 Selanjutnya, fase diam tersebut mampu mena-

han adrenalin dg interaksi elektrostatis.

Mengapa demikian ?
HPLC-2011 151
 Adrenalin - Ion Pair RP-HPLC

HPLC-2011 152
 Adreanlin-Ion Pair

 Mekanisme pemisahan:
Proses elusi terjadi melalui kombinasi antara:
penggantian adrenalin dari pasangan ionnya
oleh ion Na+ dan dengan perpindahan
pasangan ion itu sendiri dalam fase gerak.

HPLC-2011 153
 Vitamin C
 Vitamin C merupakan senyawa yang sangat
polar, dan tidak ditahan dalam kolom fase
terbalik.

 Salah satu teknik untuk menahannya pada

kolom fase terbalik adalah penggunaan rea-
gen pasangan ion.

 Pada Gbr. 12.15, digunakan cetrimide sebagai

reagen pasangan ion dalam fase gerak.

HPLC-2011 154
 Vitamin C - Ion Pair
 Parameter HPLC adalah:
 Kolom : Oktadesil silan (ODS)
 Fase gerak : 0.1 M sodium acetate buffer pH
4.2 / acetonitrile 95 : 5 , mengandung
0.03 M cetrimide

 Dengan jumlah kecil pelarut organik dalam

fase gerak, memungkinkan kita memonitor dgn
detektor elektrokimia.

HPLC-2011 155
 Vitamin C

HPLC-2011 156
 Vitamin C - Ion Pair
 Selektivitas merupakan hal yang penting pada
penentuan Vitamin C karena:

vitamin C tersebut sering dijumpai dalam

sediaan multivitamin dan sebagai pengawet
dalam sediaan farmasi yang mengandung
komponen-komponen lain dalam jumlah besar.
[ berfungsi sebagai antioksidan ]

Watson, 2003: 265-266.

HPLC-2011 157
 Literatur

 Watson, D.G., 2003, Pharmaceutical Analysis, A Text-

book for Pharmacy Students and Pharma-
ceutical Chemists, Churchill Livingstone,
Edinburgh.

HPLC-2011 158
 Ion Pairing in HPLC
 Penggunaan pasangan ion menjadikan
kromatografi fase terbalik dapat untuk
memisahkan solute yang terion, yang
umumnya tidak dapat ditahan oleh fase diam
hidrofobik.

 Counterion hidrofobik, seperti oktil sulfonat

atau ion tetrabutil amonium, ditambahkan ke
larutan dan membentuk pasangan ion
Coulombic dengan solute yang muatannya
berlawanan.

HPLC-2011 159
 lanjutan…

 Hidrofobik counter ion umumnya adalah

surface active dan teradsorbsi pada fase diam.

Ohannesian, L. and Streeter, A.J., 2002, Handbook of

Pharmaceutical Analysis, Drug and The Pharma-
ceutical Sciences, volume 117, Marcel Dekker
Inc., New York.

HPLC-2011 160
 Acidic Mobile Phase
 Fase gerak pada kondisi asam dengan nilai pH
2,5 - 3 adalah kondisi yang baik untuk awal
aplikasi pada sediaan farmasi karena pH
rendah tersebut dapat menekan ionisasi
kebanyakkn analit yang bersifat asam dan
menghasilkan waktu retensi yang panjang.

 Jenis asam yang biasa digunakan pada

penyiapan fase gerak adalah:
- asam fosfat, asam format, dan asam
asetat.
Mengapa demikian ?
HPLC-2011 161
 lanjutan…
 pH rendah juga dapat meminimalkan interaksi
antara senyawa basa (analit) dengan
permukaan silanol pada packing silika (karena
silanol tidak terionisasi pH asam).

 pH rendah juga menjadikan umur kebanyakkan

kolom yang berbasis silika paling baik (lama)
pada pH 2-8.

 Akan tetapi, senyawa basa (analit) akan

mengalami ionisasi pada pH rendah dan
mungkin tidak akan tertahan dalam kolom
kecuali digunakan reagen pasangan ion
HPLC-2011 162
 Ion-pairing Reagents
 Reagen-reagen pasangan ion adalah molekul-
molekul yang mirip deterjen yang ditambahkan
ke fase gerak untuk menyediakan retensi
tambahan atau selektivitas pada analit dengan
muatan yang berlawanan.

 Alkil sulfonat rantai panjang umumnya

digunakan untuk pemisahan analit basa yang
larut dalam air, seperti terlihat pada Gbr.16
[ analisis vitamin-vitamin yang larut air, WSV ]
yang menggunakan Heksansulfonat.

HPLC-2011 163
 Vitamin C

HPLC-2011 164
 Tiamin HCl [ Vit. B1 ]

HPLC-2011 165
 Riboflavin [ Vit.B2 ]

HPLC-2011 166
 Piridoksin.HCl [ Vit.B6 ]

HPLC-2011 167
 Pemisahan Vitamin-Vitamin Yang Larut Air
[ ion-pairing reagents ]

HPLC-2011 168
  Heksansulfonat berikatan dengan analit-analit
basa seperti piridoksin dan tiamin membentuk
pasangan ion.

 Pasangan ion yang bersifat netral tersebut

bersifat lebih hidrofobik dibanding bentuk
unassociated protonated amines  meng-
hasilkan waktu retensi yang lebih lama.

 Reagen pasangan ion memfasilitasi parameter

tambahan yang sangat berguna bagi pemi-
sahan analit basa dari senyawa lain dalam
sampel.
HPLC-2011 169
 Ion-pairing Reagent
 Selain ion-pairing reagent, amines modifier
seperti trietil amin sering ditambahkan ke fase
gerak untuk mengurangi peak tailing akibat
interaksi kuat analit basa dengan permukaan
silanol yang bersifat asam.

 Untuk analit yang bersifat asam, sering

ditambahkan ion-pairing reagent seperti garam
tetraalkilamonium.

HPLC-2011 170
 Answer :
Ionization of Silanols

Seny. Basa
HPLC-2011 171
 Amitriptilin

HPLC-2011 172
 Pada pH < 3
 Residu silanol (--Si-OH) pada kolom C-18 atau
kolom yang lain, akan tetap sebagai Si-OH.

 Sementara senyawa basa [ R-NH2 ] yang

melewati kolom akan terprotonasi menjadi R-
NH3+ sehingga tetap dapat berikatan dg Si-OH
tetapi tidak terlalu kuat  peak bagus
(ramping) [ gambar 1: kiri ].

HPLC-2011 173
HPLC-2011 174
 Gambar: 1
HPLC-2011 175
 Pada pH > 3

 Residu silanol (--Si-OH) pada kolom C-18 atau

kolom yang lain, akan terion menjadi Si-O-.

 Sementara senyawa basa [ R-NH2 ] yang

melewati kolom akan terprotonasi menjadi
R-NH3+ sehingga akan berikatan kuat dg Si-O-
dan peak tailing [ gambar 1: kanan ].

Bagaimana mengatasi tailing tersebut ???

HPLC-2011 176
 Pengatasan Tailing Senyawa Basa
 Gunakan ion pairing reagent, seperti alkil
sulfonat rantai panjang, misal: sodium hexane
sulfonat [ SHS ].

 SHS akan membentuk pasangan ion dengan

senyawa basa yang terprotonasi [ R-NH3+ ] ,
menghasilkan pasangan ion yang netral dan
lebih hidrofobik.

 Akhirnya akan dihasilkan waktu retensi yang

lebih panjang (senyawa basa dapat lebih
terpisah dari senyawa yang lain).
HPLC-2011 177
 Ion Pair Reagent
Alkylamines Alkylsulfonates

HPLC-2011 178
 Ion pairing Reagent

Mekanisme kerja pada pemisahan beberapa

vitamin dan senyawa lain, silahkan dibaca
dalam buku:

Ahuja, S. and Dong, M.W., 2005,

Hanbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC

HPLC-2011 179
 Terima Kasih
E-mail: sudib_kekes@yahoo.co.id

HPLC-2011 180
HPLC-2011 181