Uji Antimikroba
Uji Antimikroba
FARMASI – UHAMKA
2013
Priyo Wahyudi
UJI POTENSI ANTIMIKROBA
• Metode Difusi Agar
• Metode Dilusi
Mengapa Antimikroba perlu ditentukan
Potensinya ?
• Penggunaan antimikroba yg meningkat kadarnya,
menyebabkan meningkat pula resistensi berbagai
mikroba patogen terhadapnya
• Efektivitas antimikroba sangat tergantung pada kadar
dan kekuatan zat aktifnya
• Kadar jumlah per satuan berat/volume
• Potensi ukuran kekuatan atau daya bunuh zat aktif
terhadap mikroba
• Respons mikroba thd antimikroba berbeda-beda,
umumnya bersifat SPESIFIK dan SENSITIF
Prinsip Uji Potensi Antimikroba
(berdasar FI IV 1995)
18
Baku Pembanding (Biological Reference)
• Baku pembanding (biological reference) ;
Digunakan antibiotik yg telah diketahui kemurnian dan
potensinya secara pasti. Baku pembanding ini
direkomendasikan oleh WHO dan di Indonesia seperti BPOM,
SPI, SPN, SBL (S=standar, B=baku, P=pembanding, L=lab,
I=intern)
Media Pertumbuhan
Media yang digunakan harus mendukung pertumbuhan
mikroba uji dgn baik, tidak boleh mengandung zat yg
bersifat antagonis ataupun yg mempengaruhi aktivitas
antimikroba dari antibiotik yg diperiksa
Larutan Dapar
Digunakan untuk melarutkan antibiotik yang akan
diperiksa baik baku pembanding maupun sampel uji.
Pemilihan larutan dapar yang digunakan disesuaikan
dengan sifat dan stabilitas bahan yabg akan diuji.
Metode difusi agar
• Metode analisis potensi antibiotik secara difusi agar merupakan cara
yang sederhana dan hasil yg diperoleh cukup teliti.
• Cara ini mrp cara terpilih dan direkomendasikan oleh International
Collabotrative Study di Swedia dan FDA di AS untuk pengujian mutu
antibiotik
• Prinsip penetapannya yaitu mengukur luas hambatan pertumbuhan
mikroba uji yg disebabkan oleh zat baku standar dan zat yg di uji
• Dlm range konsentrasi tt terdapat hub yg linear antara peningkatan
konsentarsi dgn luas daerah hambatan pertumbuhan mikroba uji
Faktor yang mempengaruhi luas daerah
hambatan dengan cara difusi agar
• Ingredien / komposisi medium pertumbuhan
• Pemilihan medium pertumbuhan
• Pengaruh pH
• Ukuran inokulum
• Stabilitas mikroba uji
• Aktivitas antibiotika
• Waktu inkubasi
Ingredien medium pertumbuhan
• Komposisi ingredien yg umum tdp pada komposisi
pertumbuhan mo adalh ; pepton, tripton, ekstrak
ragi, agar, dan mineral (Ca, Mg, Fe, NaCl, KH)
• NaCl mengurangi aktivitas antibiotik gol
aminoglikosida dan menahan aktivitas ferosidin
• KH pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas
nitrofurantoin atau ampisilin
Pemilihan medium
• Diperlukan persiapan medium yg cocok bagi
pertumbuhan mo demikian pula ketebalan dan
konstituen harus merata pada medium agar
• Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan
disebabkan oleh aktivitas antibiotik yg tergantung
pada pH medium. Misalnya aktivitas aminoglikosida
diperkuat dalam suasana asam sedangkan tetrasiklin
dalam suasana basa
• Jika dalam melarutkan media ; pH yg tinggi
diturunkan dgn menambahkan HCl 0,1N, pH yg
rendah dinaikkan dgn penambahan NaOH 0,1N
Ukuran inokulum
• Inokulum adalah campuran antara suspensi dan
media.
• Luas daerah hambatan akan semakin kecil jika
inokulum semakin besar kandungan
mikroorganismenya.
• Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan
mikroorganismenya homogen, misal 1-10%
• Apabila pertumbuhan yg rapat, dapat menyebabkan
terjadinya penumpukan pada tempat tt
Stabilitas mikroba uji
Resistensi mikroba uji terhadap suatu antibiotik dapat
terjadi dalam kondisi pertumbuhan tertentu. Oleh
sebab itu regenerasi mikroba perlu dilakukan secara
periodik dan sewaktu-waktu diuji kemurnian dan
kepekaannya.
Aktivitas antibiotik
Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik pada
suatu penetapan, terlebih dahulu perlu ditentukan
kadar hambat minimum (KHM) dari antibiotik yang
diuji. Pengaruh predifusi larutan antibiotik yangg terjadi
sebelum inkubasi harus dihilangkan atau dikurangi
dengan cara pengisian larutan antibiotik ke dalam
medium agar
Waktu Inkubasi
Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang
optimal, sehingga keseimbangan antara aktivitas
antibiotik dengan daya tumbuh mikroba dapat
menghasilkan daerah hambatan yang baik untuk
pengukuran zona bening yang muncul sebagai daerah
penghambatan pertumbuhan mikroba, biasanya antara
18-24 jam
Reservoir
• Resevoir pada Teknik difusi agar dapat berupa:
– Silinder gelas / logam
– Cakram kertas (paper disc)
– Cetak lobang (punched holes)
• Cakram : tempat meletakkan sampel antimikroba
yang akan diuji potensinya pada medium agar yang
telah memadat
Uji Difusi Agar
The standard procedure that assesses antimicrobial activity
is called the Kirby–Bauer method (Figure 24.8).
• Agar media are inoculated by evenly spreading a
defined density of a suspension of the pure
culture on the agar surface. Filter paper disks
containing a defined quantity of the antimicrobial
agents are then placed on the inoculated agar.
• After a specified period of incubation, the
diameter of the inhibition zone around each disk
is measured. Table 24.4 presents zone sizes for
several antibiotics.
• Antibiograms are periodic reports that
indicate the susceptibility of clinically isolated
organisms to the antibiotics in current local
use.
Prepare inoculum
suspension
Select colonies
Mix well
Standardize inoculum
suspension
Swab plate
Remove sample
Incubate overnight
Add disks
Measure Zones
Inoculate
purity plate
Read MICs
Examining purity plate
>64 >64
Epsilo-meter test
• It’s a new technique for direct detection of MIC, a
graduated increasing concentration of the antibiotic
is fixed along a rectangular plastic test strip which is
applied to the surface of an inoculated agar plate,
after over night incubation a tear drop shaped
inhibition zone is seen.
Cawan Petri
Goresan silang
Fungi Uji
Kertas filter
mengandung
antibiotik uji
Koloni
Zona hambat
Fungi
pertumbuhan fungi
Uji