1. Solvent Manager
Solvent manager terdiri dari wadah fase gerak dan pompa fase gerak. Wadah
fase gerak harus bersih dan inert. Pompa yang cocok digunakan untuk KCKUT
adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut
yakni inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 15000 psi. Tujuan penggunaan pompa ini adalah
untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
2. Sample Manager
Sample manager terdiri dari tempat meletakkan vial sampel dan jarum injektor
yang berfungsi untuk menyuntikkan sampel ke dalam kolom. Suhu di dalam
sample manager dapat diatur sesuai kondisi yang diinginkan.
4
3. Kolom
Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen dalam senyawa
yang dianalisis. Untuk menahan tekanan tinggi, kolom dibuat dari bahan yang
kokoh seperti stainless steel atau campuran logam dengan gelas. Penghubung
atau sambungan harus dirancang tanpa ruang kosong. Isi kolom harus homogen
dan stabil secara mekanik. Diameter partikel pengisi kolom pada KCKUT berkisar
pada ukuran 2,0 μm dengan panjang kolom umumnya berkisar antara 5-15 cm.
Fase diam pada kolom yang digunakan untuk KCKUT sudah dikembangkan
dengan menjembatani matriks silika dengan gugus etena yang dikenal juga
bridged ethylene hybrid (BEH) sehingga menghasilkan pemisahan yang lebih baik
dan stabil secara mekanis. Efisiensi suatu kolom harus dinilai berdasarkan jumlah
plat teoritis (N) dan HETP- nya untuk mengetahui kemampuan kolom.
4. Integrator
Integrator berfungsi untuk merekam data hasil analisis. Saat ini integrator bekerja
secara digital menggunakan software komputer yang terintregasikan dengan
sistem yang digunakan.
5
Mass Spectrometry
Komponen spektometer massa terdiri dari sumber pengion, penganalisis massa,
dan detektor.
Sumber pengion adalah bagian dari spektrometer massa yang mengionisasi
bahan-bahan yang akan dianalisis. Ruang ionisasi biasanya juga diisi dengan gas
nebulator sehingga analit yang sebelumnya berupa cairan akan diubah menjadi
molekul gas bermuatan. Molekul gas bermuatan tersebut akan bergerak menuju
penganalisis massa.
Penganalisis massa digunakan untuk memisahkan ion-ion berdasarkan pada
rasio m/z. penganalisis massa tersebut dihubungkan oleh suatu ruang yang akan
dipenuhi oleh gas penumbuk. Ion-ion yang masuk ke dalam ruang tersebut akan
mengalami tumbukan dengan molekul gas penumbuk yang pada umumnya
berupa gas inert seperti argon atau helium. Fragmen yang dihasilkan dari
tumbukan kemudian akan dianalisis massanya pada penganalisis massa ke 2.
Bagian terakhir dari spektrometer massa adalah detektor yang merekam nilai
m/z suatu ion ketika ion tersebut melewati atau menumbuk permukaan
detektor. Sinyal yang dihasilkan oleh ion akan ditangkap detektor dan direkam
6
nilai m/z-nya serta digambarkan ke dalam sebuah spektrum massa.
Sumber Ionisasi
Mass “Filter”
+
+ + + +
+
& Fission
Nebulizing + +
+ + +
Gas +
+ + +
+
++ + +
+++ ++
+ ++
Droplet Formation +
To MS
+
+
Curtain Plate
Curtain Gas
Electrospray Ionization (ESI)
• Tiga langkah dalam ESI : produksi tetesan bermuatan, pengurangan ukuran tetesan
bermuatan dan fase gas pembentukan ion.
• Sampel di pompa menuju pipa kapiler yang sangat sempit dan bertegangan tinggi, terjadi
nebulasi, analit berinteraksi dengan lapisan permukaan pelarut menghasilkan tetesan
bermuatan positif/negatif.
• Tetesan Muatan ini akan mengalami pengurangan ukuran karena menguapnya pelarut,
meningkatnya kerapatan muatan pada partikel sehingga meningkatkan tegangan
permukaan dan tetesan akan pecah menjadi tetesan-tetesan lebih kecil
• Sampai butiran cukup kecil, analit akan terlepas dari butiran dan menuju ke mass analyzer
1. Analit bersama dengan eluen dari LC masuk ke dalam kapiler. Di dalam
kapiler terdapat anoda (kutup negatif) pada Taylor cone dan katoda
(kutup negatif) didekat masukkan analit dan eluen. Kutup ini berfungsi
agar muatan yang berkumpul pada taylor cone adalah muatan positif
sehingga nantinya saat terjadi penyemprotan dan terbentuk droplet
(tetesan) tidak bergabung menjadi droplet yang lebih besar lagi.
2. Analit dan eluen disemprotkan (spray) melalui Taylor cone akan terbentuk
droplet-droplet (permukaannya memiliki muatan positif). Mengalami
tahap evaporasi solven untuk mengurangi solven yang menempel di
analit. akibatnya droplet menyusut sampai titik dimana tegangan
permukaan pada droplet tidak dapat menopang muatan dipermukaannya
sehingga terjadi perpecahan dalam droplet tersebut (ledakan coulombic),
menjadi a. Analit dengan satu muatan dan beberapa muatan (analit ion),
b. Satu analit bersama solven yang diliputi muatan positif, c. Beberapa
analit bersama beberapa solven diliputi beberapa analit.
3. Analit ion akan masuk ke dalam cone dimana di sisi kiri dan kanannya
sudah mengalir gas nitrogen, gas ini berfungsi agar analit yang terjadi
stabil dalam bentuknya dan tidak terganggu oleh pengaruh gas oksigen.
droplet tersebut ditransfer melalui lubang kapiler untuk dianalisis.
Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)
Pada APCI, sampel yang berasal dari kromatografi cair diuapkan dengan cara
dipanaskan oleh gas nebulator. Kemudian, komponen polar dari pelarut yang
menguap diionisasi oleh lecutan bertegangan tinggi dari jarum korona sehingga
bermuatan. Molekul pelarut kemudian menransfer muatannya ke molekul analit
yang terionisasi, molekul-molekul tersebut kemudian melewati lubang menuju ke
Mass analiyzer
Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)
Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)
m/z
(MW)
www.agilent.com
Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)
Quadrupole memiliki empat batang logam silinder yang dijepit dalam susunan tabung, batang
logam disusun secara presisis dan mengandung medan listrik yang berlawanan. Medan listrik
berasal dari tegangan radio frekuensi (RF) dan tegangan arus searah (DC), dimana tegangan
RF > DC. Ion difokuskan ke dalam rongga yang dibentuk oleh empat batang tersebut, hanya
ion yang stabil dengan m/z tertentu yang akan sampai ke detektor. Jika m/z dan frekuensi
tidak sesuai dengan kondisi yang diminta, ion akan berosilasi dengan jalur yang lebar yang
menyebabkan ion berbenturan dengan dinding bagian dalam batang analyzer quadrupole
tertarik oleh vakum dan hilang.
Ion Trap
• Ion-ion terjebak pada ruang yang dapat di deteksi oleh elektroda berbentuk seperti
cincin.
• Elektroda dihubungkan dengan potensial RF (Frekuensi Radio) dan DC (arus
searah)
• Tegangan RF diberikan berubah-ubah, apabila RF naik maka orbital ion bermasa
berat akan stabil, sedangan ion yang ringan tidak stabil dan akan terjadi tumbukan
dengan dinding elektroda, kemudian di keluarkan menuju detektor
Linier Ion Trap
• Ion trap ini terbuat dari quadrupole linier yang dihubungkan ujung-
ujungnya sehingga membentuk seperti donat. Jebakan ini dapat
menyimpan ion-ion dalam jumlah yang banyak
• + peningkatan sensitivitas analisis komponen minor dari efluen HPLC
untuk menganalisa metabolit atau fragmen kecil dari sekuensing protein
• Time-of-flight menganalisis ion dengan cara mengumpulkan hasil
kromatografi cair pada sumur pelat spotter, kemudian sampel dicampur
dengan kromofor seperti asam amino krotonat yang akan menyerap
cahaya dari tembakan laser (menggunakan laser UV) intensitas tinggi
dalam sumber ion. Molekul target ini kemudian meledak, menjadi fase
gas sambil mengionisasinya secara kimia. Fragmen-fragmen tersebut
menuju ke flight tube melalui lensa fokus. Flight time dari setiap fragmen
tergantung pada rasio m/z-nya. Fragmen yang lebih ringan tiba di
detektor ion lebih dahulu. Untuk mendeteksi fragmen m/z, setiap elemen
detektor berarus diode diaktifkan hanya untuk m/z tertentu, yang
memungkinkan pemilihan hanya pada massa tunggal per ledakan.
Dengan menggunakan teknik ini, seluruh pola ledakan fragmen dapat
dianalisis untuk setiap aktivitas, yang sangat meningkatkan sensitivitas
sistim. Time-of-Flight biasanya digunakan dalam penentuan struktur
protein di mana sistem LC-TOF digunakan untuk analisis protein, peptida,
dan polinukleotida.
Time-of-Flight
Fourier Transform Analyser
• terbuat dari kaca berlapis timbal dengan tabung melengkung yang memiliki
sifat emisi sekunder yang baik. Sebagai dinding tabung memiliki daya listrik
seragam, tegangan diterapkan antara dua ekstremitas dari tabung karena itu
akan menghasilkan medan percepatan terus menerus.
• Partikel sekunder dari dynode konversi bertabrakan dengan dinding bagian
melengkung di pintu masuk detektor dan menghasilkan elektron sekunder,
yang kemudian dipercepat oleh medan menuju pintu keluar dari tabung.
• Elektron melewati multiplier elektron, menumbuk dinding kembali,
menyebabkan emisi lebih dan lebih elektron. Jadi cascade elektron terbentuk
dan akhirnya anoda logam mengumpulkan aliran elektron sekunder di pintu
keluar detektor dan arus terukur.
Pelat microsphere
• Multiplier elektron ini terdiri dari beads gelas dengan diameter 20-100
μm yang disinter untuk membentuk pelat tipis dengan ketebalan 0,7
mm. Pelat ini berpori dengan saluran berbentuk tidak teratur antara
permukaan planar. Permukaan beads ditutupi dengan bahan yang
dapat melepaskan elektron dan dua sisi pelat dilapisi untuk
membuatnya menjadi konduktif.
• Perbedaan potensial antara 1,5 dan 3,5 kV diterapkan pada pelat,
dengan bagian output dari pelat memiliki potensial lebih positif. Ketika
partikel menghantam bagian input dari pelat microsphere, dihasilkan
elektron sekunder. Elektron ini kemudian dipercepat oleh medan listrik
melalui pelat berpori dan bertabrakan dengan beads lainnya.
Multiplikasi elektron sekunder terbentuk dan akhirnya sejumlah besar
elektron sekunder yang dilepaskan dari bagian output pelat.
• Arus listrik dapat diukur.
Faraday Cup
• Ion mencapai bagian dalam silinder dan dinetralkan dengan menerima atau
menyumbangkan elektron saat menumbuk dinding. Hal ini menyebabkan arus
melalui resistor. Arus yang tak bermuatan kemudian diperkuat dan terdeteksi.
• Muatan pada elektron yang meninggalkan dinding detektor identik dengan
kedatangan ion positif pada detektor ini.
• Cup dilapisi dengan karbon karena menghasilkan beberapa ion sekunder.
• Bentuk cangkir dan penggunaan medan magnet yang lemah mencegah juga
setiap elektron sekunder yang dihasilkan tidak keluar.
Electro-Optical Ion (The daly detector)
Modifikasi spektrometer massa untuk mendeteksi ion negatif bukan ion positif dengan
membalik arus magnet dan mempercepat tegangan. Ion negatif memiliki energi kinetik cukup
tinggi, meskipun memiliki bias negatif pada dynode pertama elektron sekunder akan
mengalami gradien positif secara keseluruhan. Dalam spektrometer massa yang menggunakan
medan quadrupole, dilakukan perubahan di bagian analisa dari instrumen yaitu transmisi,
repeller dan percepatan tegangan harus diubah dari positif ke negatif .
Channel Electron Multiplier Array (CEMA)
• CEMA terdiri dari susunan kumparan dari banyak saluran hingga beberapa ratus
per inci persegi, dimungkinkan dengan serat optik menggunakan kaca logam.
• Perbedaan potensial diterapkan ujung-ujung saluran atas dan bawah dari
kumparan tersebut dan menciptakan gradien listrik.
• Ion-ion memasuki saluran sehingga mereka menabrak dinding saluran. Ion
bertabrakan dengan permukaan untuk meninggalkan elektron.
• Elektron sekunder yang dihasilkan dari tabrakan dingding terus memantul ke
bawah saluran, memproduksi lebih electron sekunder sehingga memperkuat sinar
ion asli.
Photomultiplier conversion dynode
Detektor array adalah detektor yang terdiri dari beberapa elemen koleksi
ion, diatur dalam baris/kotak di mana setiap elemen adalah detektor individu.
Detektor array secara spasial mendeteksi ion sesuai dengan m/z yang berbeda,
digunakan pada analisa massa magnetik. Ion tertentu dapat dideteksi secara
bersamaan oleh detector array. Keuntungan utama dari pendekatan ini adalah
sensitivitas yang yang dapat ditingkatkan walaupun dengan kisaran massa kecil.
Tandem Spektrometri Massa
Tandem-in space adalah manifestasi dari MS/MS, di mana tiga langkah analisis (seleksi
prekursor-ion, prekursor-ion disosiasi, dan produk-ion analisis) pada ruang yang berbeda.
penganalisis massa selektif digunakan untuk memilih ion prekursor untuk proses pemisahan dan
penganalisis massa selektif kedua digunakan untuk menganalisis produk yang dihasilkan dari
disosiasi. Kedua penganalisismassa selektif ditempatkan di sisi berbeda.
Contoh; triple quadrupole, Q-TOF, TOF-TOF
Konsep tandem-in time adalah bahwa semua tiga langkah (seleksi prekursor-ion, prekursor-
ion disosiasi, dan produk-ion analisis) berlangsung di posisi yang sama, tetapi pada waktu
yang berbeda.
Tidak seperti tandem-in-space, di mana ion terus lewat dari satu langkah operasional untuk
berikutnya, tandem-in-time hanya berlaku proses tunggal (seleksi, disosiasi, atau analisis)
untuk ion dalam interval waktu tertentu
Contoh; siklotron ion resonansi (Ftms), Orbitrap (perangkat perangkap lain mampu kekuatan
menyelesaikan tinggi), dan quadrupole ion trap (QIT)
Mode Analisis
7.4e6 399.0
7.0e6 Full Scan Spectrum
6.5e6
6.0e6
5.5e6
5.0e6
4.5e6
Intensity, cps
4.0e6
3.5e6
3.0e6
2.5e6
2.0e6
1.5e6
400.0
1.0e6
400.9 401.1
5.0e5
0.0
396.5 397.0 397.5 398.0 398.5 399.0 399.5 400.0 400.5 401.0 401.5
m/z, amu
Full Scan Spectrum
BMS-724296 13 (0.247) Cm (9:15) Scan ES+
492.37 Precursor Ion 5.00e6
100
336.28
% 494.25
377.27
220.23 524.49
387.01 565.11 690.86
299.07 647.04
245.13 732.56
0 m/z
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
2. Selective Ion Reactiom
(SIR)
Plasma Extract SIM: m/z 617 Plasma Extract MRM: m/z 617-> m/z 483
3. Multiple Reaction Monitoring
(MRM)
• Mode analisis dengan memilih nilai m/z yang spesifik pada kedua penganalisis massa dan
ruang tumbukan diisi dengan gas penumbuk. Mode analisis ini memungkinkan deteksi yang
memiliki kespesifikan dan sensitivitas yang tinggi.
• Q1: ion akan masuk Q1 dan dikunci hanya m/z yang diinginkan ,Q1 berfungsi untuk
mengunci parent ion/prekusor ion.
• Q2: terjadi fragmentasi, gas fragmentasi menyala dan ada nilai tegangan untuk
memfragmentasi ion dari Q1.
• Q3: ion-ion yang telah terfragment di Ruang penumbuk akan masuk ke Q3 dan dikunci ion
fragmentasinya. Ion fragmentasi disebut juga daughter ion/ion Produk.
• Nilai S/N pada MRM akan lebih besar dibandingkan dengan SIR dan MS Scan, karena hanya
ion yang dipilih ke detektor lebih selektif.
XIC of +MRM (1 pair): 399.1/223.0 amu from Sample 35 (z020923a035) of Linearity_ISTD.wiff, Sm... Max. 2.5e4 cps.
2.7e4
2.6e4 1.22
2.4e4
Multiple Reaction Monitoring:
2.2e4 specific precursor / product ion pair
399 m/z -> 223 m/z
2.0e4
1.8e4
Intensity (cps)
I n te n s it y , c p s
1.6e4
1.4e4
1.2e4
1.0e4
8000.0
6000.0
4000.0
2000.0
0.0
0.85 0.90 0.95 1.00 1.05 1.10 1.15 1.20 1.25 1.30 1.35 1.40 1.45 1.50 1.55 1.60 1.65 1.70 1.75
Time, min
Time (min)
4. Product/ daughter ion scan
• Q1: ion masuk dan dikunci hanya m/z yang diinginkan, Q1 berfungsi untuk mengunci
parent ion/precusor ion.
• Selanjutnya pada ruang penumbuk akan terjadi fragmentasi, Gas fragmentasi menyala
dan ada nilai tegangan untuk memfragmentasi ion dari Q1. Ion-ion yang telah
terfragment di ruang penumbuk akan masuk ke Q2 dan akan di scan pada Q2 ion
fragmentasinya. (fungsi MS Scan pada Q2 untuk scanning ion fragmentasi).
Product Ion Spectrum
140.06 233.95
120.38
0 m/z
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
+Product (399.0): Experiment 3, 0.345 to 1.047 min from 049-IS Sulfasalazine MSMS.wiff Max. 9.3e5 cps.
5.5e5
5.0e5
4.5e5
119.0
4.0e5
3.5e5
213.1
3.0e5
94.0 147.1
2.5e5 239.0
2.0e5 165.3
Perbandingan
70-30