Liquid chromatography-

tandem mass spectrometry

 Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Merupakan instrumen analisis kombinasi dari kromatografi cair sebagai pemisah

komponen-komponen analit dalam sampel, dengan spektrometri massa yang
akan menganalisis analit berdasarkan rasio masa terhadap muatan (m/z).
Aplikasi LC-MS/MS lebih luas dibandingkan dengan kromatografi gas-tandem
spektrometri massa karena tidak terbatas pada molekul volatil saja (biasanya
dengan berat molekul di bawah 500 Da), namun mampu mengukur analit yang
sangat polar dan persiapan sampel cukup sederhana tanpa adanya teknik
derivatisasi.
Kolom LC dapat memisahkan hampir semua campuran yang bisa dilarutkan,
sedangkan spektrometri massa akan mengionisasi peak yang dipisahkan dan
menghasilkan berat molekul untuk setiap komponen dari peak tersebut.
sistem LC-MS/MS dapat menghasilkan pola fragmentasi yang khas dari ion
parent dan dapat memisahkan ion daughter untuk proses identifikasi dan
kuantifikasi. 3
Skema Instrumentasi LCMS/MS

Kontrol
Injektor Sample Spektrometri massa
Manager
Interface
Sumber Penganalisis Detekto Sistim
Solvent Kolom Ion Massa
r Data
Manager
Detektor
Sekunder Vakum

KCKUT
 Liquid chromatography

1. Solvent Manager
Solvent manager terdiri dari wadah fase gerak dan pompa fase gerak. Wadah
fase gerak harus bersih dan inert. Pompa yang cocok digunakan untuk KCKUT
adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut
yakni inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 15000 psi. Tujuan penggunaan pompa ini adalah
untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.

2. Sample Manager
Sample manager terdiri dari tempat meletakkan vial sampel dan jarum injektor
yang berfungsi untuk menyuntikkan sampel ke dalam kolom. Suhu di dalam
sample manager dapat diatur sesuai kondisi yang diinginkan.
5
3. Kolom
Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen dalam senyawa
yang dianalisis. Untuk menahan tekanan tinggi, kolom dibuat dari bahan yang
kokoh seperti stainless steel atau campuran logam dengan gelas. Penghubung
atau sambungan harus dirancang tanpa ruang kosong. Isi kolom harus homogen
dan stabil secara mekanik. Diameter partikel pengisi kolom pada KCKUT berkisar
pada ukuran 2,0 μm dengan panjang kolom umumnya berkisar antara 5-15 cm.
Fase diam pada kolom yang digunakan untuk KCKUT sudah dikembangkan
dengan menjembatani matriks silika dengan gugus etena yang dikenal juga
bridged ethylene hybrid (BEH) sehingga menghasilkan pemisahan yang lebih baik
dan stabil secara mekanis. Efisiensi suatu kolom harus dinilai berdasarkan jumlah
plat teoritis (N) dan HETP- nya untuk mengetahui kemampuan kolom.

4. Integrator
Integrator berfungsi untuk merekam data hasil analisis. Saat ini integrator bekerja
secara digital menggunakan software komputer yang terintregasikan dengan
sistem yang digunakan.
6
 Mass Spectrometry
Komponen spektometer massa terdiri dari sumber pengion, penganalisis massa,
dan detektor.
Sumber pengion adalah bagian dari spektrometer massa yang mengionisasi
bahan-bahan yang akan dianalisis. Ruang ionisasi biasanya juga diisi dengan gas
nebulator sehingga analit yang sebelumnya berupa cairan akan diubah menjadi
molekul gas bermuatan. Molekul gas bermuatan tersebut akan bergerak menuju
penganalisis massa.
Penganalisis massa digunakan untuk memisahkan ion-ion berdasarkan pada
rasio m/z. penganalisis massa tersebut dihubungkan oleh suatu ruang yang akan
dipenuhi oleh gas penumbuk. Ion-ion yang masuk ke dalam ruang tersebut akan
mengalami tumbukan dengan molekul gas penumbuk yang pada umumnya
berupa gas inert seperti argon atau helium. Fragmen yang dihasilkan dari
tumbukan kemudian akan dianalisis massanya pada penganalisis massa ke 2.
Bagian terakhir dari spektrometer massa adalah detektor yang merekam nilai
m/z suatu ion ketika ion tersebut melewati atau menumbuk permukaan
detektor. Sinyal yang dihasilkan oleh ion akan ditangkap detektor dan direkam
7
nilai m/z-nya serta digambarkan ke dalam sebuah spektrum massa.
 Sumber Ionisasi

Sumber ion fase Cair

1. Atmospheric Pressure Ionization
Electrospray Ionization (ESI),
Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI), dan
Atmospheric Pressure Photoionization (APPI)
Sumber ion fase Padat
1. Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)
Metode Electrospray Ionozation (ESI)
Orifice
Plate
LC 5kV
+ +
+ +
++
+
+ +
+
+
Desolvation
+ + + +++

+
+ + + +
+
& Fission
Nebulizing + +
+ + +
Gas +
+ + +
+
++ + +
+++ ++
+ ++
Droplet Formation +
To MS
+
+

Gas Phase Ion

Generation
Drying Gas

Curtain Plate

Optimasi : Tegangan saat Ionisasi, pada lubang

Curtain Gas
masuk (cone/orifice), Collison.
suhu dan laju alir gas desolvasi
 Electrospray Ionization (ESI)

• Tiga langkah dalam ESI : produksi tetesan bermuatan, pengurangan ukuran

tetesan bermuatan dan fase gas pembentukan ion.
• Sampel di pompa menuju pipa kapiler yang sangat sempit dan bertegangan
tinggi, terjadi nebulasi, analit berinteraksi dengan lapisan permukaan pelarut
menghasilkan tetesan bermuatan positif/negatif.
• Tetesan Muatan ini akan mengalami pengurangan ukuran karena menguapnya
pelarut, meningkatnya kerapatan muatan pada partikel sehingga
meningkatkan tegangan permukaan dan tetesan akan pecah menjadi tetesan-
tetesan lebih kecil
• Sampai butiran cukup kecil, analit akan terlepas dari butiran dan menuju ke
mass analyzer
1. Analit bersama dengan eluen dari LC masuk ke dalam kapiler. Di dalam
kapiler terdapat anoda (kutup negatif) pada Taylor cone dan katoda
(kutup negatif) didekat masukkan analit dan eluen. Kutup ini berfungsi
agar muatan yang berkumpul pada taylor cone adalah muatan positif
sehingga nantinya saat terjadi penyemprotan dan terbentuk droplet
(tetesan) tidak bergabung menjadi droplet yang lebih besar lagi.
2. Analit dan eluen disemprotkan (spray) melalui Taylor cone akan terbentuk
droplet-droplet (permukaannya memiliki muatan positif). Mengalami
tahap evaporasi solven untuk mengurangi solven yang menempel di
analit. akibatnya droplet menyusut sampai titik dimana tegangan
permukaan pada droplet tidak dapat menopang muatan dipermukaannya
sehingga terjadi perpecahan dalam droplet tersebut (ledakan coulombic),
menjadi a. Analit dengan satu muatan dan beberapa muatan (analit ion),
b. Satu analit bersama solven yang diliputi muatan positif, c. Beberapa
analit bersama beberapa solven diliputi beberapa analit.
3. Analit ion akan masuk ke dalam cone dimana di sisi kiri dan kanannya
sudah mengalir gas nitrogen, gas ini berfungsi agar analit yang terjadi
stabil dalam bentuknya dan tidak terganggu oleh pengaruh gas oksigen.
droplet tersebut ditransfer melalui lubang kapiler untuk dianalisis.
Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)
Pada APCI, sampel yang berasal dari kromatografi
cair diuapkan dengan cara dipanaskan oleh gas
nebulator. Kemudian, komponen polar dari pelarut
yang menguap diionisasi oleh lecutan bertegangan
tinggi dari jarum korona sehingga bermuatan.
Molekul pelarut kemudian menransfer muatannya
ke molekul analit yang terionisasi, molekul-molekul
tersebut kemudian melewati lubang menuju ke
Mass analiyzer
Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)
 Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)

• Sampel dalam larutan diuapkan dengan pemanasan nebulizer mirip

dengan metode pada APCI. Setelah penguapan, analit berinteraksi
dengan foton yang dipancarkan oleh lampu pemancar. Foton ini
memicu rangkaian reaksi fase gas yang mengarah pada proses ionisasi
molekul sampel.
• Perbedaan dari metode APCI adalah adanya penggunaan lampu
pemancar foton. Manfaat dari metode ini adalah metode ini
mempunyai potensi untuk mengionisasi senyawa yang tidak dapat
diionisasi oleh APCI dan ESI, yakni senyawa yang non-polar. Analit
dalam proses APPI mode positif diionisasi dengan fotoionisasi
langsung atau pertukaran muatan atau transfer proton. Ionisasi
langsung dan pertukaran muatan memungkinkan ionisasi non polar
tersebut dimana pada APCI dan ESI tidak dapat dilakukan.
• Lampu UV pada umumnya digunakan untuk menghasilkan foton pada
energi yang lebih tinggi dibandingkan potensial ionisasi dari analit
namun lebih rendah dari gas atmosferik dan pelarut yang digunakan
Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)

S + Pelarut organik, keringkan, letakkan pada plat sampel

Tembakkan oleh sinar laser (kondisi vakum)
Matriks menjadi fase gas
Photoionisasi fase gas ----terbentuk ion
Ion diakselerasi oleh medan magnet menuju penganalisis massa
 1. senyawa yang akan dianalisis, dilarutkan dalam pelarut organik dengan
molekul kecil. Molekul tersebut harus memiliki absorbsi yang kuat terhadap
panjang gelombang laser. Campuran ini dikeringkan sebelum analisis Hasilnya
adalah deposit larutan padat dari matriks kristal analit. Molekul analit tertanam
disepanjang matriks sehingga molekul tersebut terisolasi satu sama lain.
2. dilakukan dalam kondisi vakum, yaitu pengikisan dari larutan padat
dengan gelombang laser yang intens dalam jangka waktu singkat. irradiasi oleh
laser memicu peningkatan suhu Kristal secara cepat oleh akumulasi energi dalam
fase terkondensasi melalui eksitasi matriks molekul. Pemanasan secara cepat
tersebut menyebabkan sublimasi secara lokal pada matriks Kristal, dan penguapan
matriks menjadi fase gas. Terjadi photoionization fase gas sehingga terjadi
pembentukan ion. Ion dari fase gas kemudian akan diakselerasi oleh medan
elektrostatik menuju mass analyzer
Mode Ionisasi yang digunakan berdasarkan struktur dasar molekul
• Basa => Mode Positif (ES +)

Asam => Mode Negatif

Contoh
 Aplikasi macam-macam teknis
ionisasi LC/MS

m/z
(MW)

www.agilent.com
 Mass Analyzer

Mass “Filter”
Tipe Analyser Lambang Prinsip Pemisahan

Quadrupole Q m/z (stabilitas tranjektor)

Ion trap IT m/z (resonansi frekuensi)

Time-of-light TOF Velocity

Fourier Transform ion cyclotron resonance FTICR m/z (resonansi frekuensi)

Fourier Transform orbitrap FT-OT m/z (resonansi frekuensi)

 Quadrupole

Quadrupole memiliki empat batang logam silinder yang dijepit dalam susunan tabung, batang
logam disusun secara presisis dan mengandung medan listrik yang berlawanan. Medan listrik
berasal dari tegangan radio frekuensi (RF) dan tegangan arus searah (DC), dimana tegangan
RF > DC. Ion difokuskan ke dalam rongga yang dibentuk oleh empat batang tersebut, hanya
ion yang stabil dengan m/z tertentu yang akan sampai ke detektor. Jika m/z dan frekuensi
tidak sesuai dengan kondisi yang diminta, ion akan berosilasi dengan jalur yang lebar yang
menyebabkan ion berbenturan dengan dinding bagian dalam batang analyzer quadrupole
tertarik oleh vakum dan hilang.
 Ion Trap

• Ion-ion terjebak pada ruang yang dapat di deteksi oleh elektroda berbentuk seperti
cincin.
• Elektroda dihubungkan dengan potensial RF (Frekuensi Radio) dan DC (arus
searah)
• Tegangan RF diberikan berubah-ubah, apabila RF naik maka orbital ion bermasa
berat akan stabil, sedangan ion yang ringan tidak stabil dan akan terjadi tumbukan
dengan dinding elektroda, kemudian di keluarkan menuju detektor
Linier Ion Trap

• Ion trap ini terbuat dari quadrupole linier yang dihubungkan ujung-
ujungnya sehingga membentuk seperti donat. Jebakan ini dapat
menyimpan ion-ion dalam jumlah yang banyak
• + peningkatan sensitivitas analisis komponen minor dari efluen HPLC
untuk menganalisa metabolit atau fragmen kecil dari sekuensing protein
Time-of-Flight
• Time-of-flight menganalisis ion dengan cara mengumpulkan hasil
kromatografi cair pada sumur pelat spotter, kemudian sampel dicampur
dengan kromofor seperti asam amino krotonat yang akan menyerap
cahaya dari tembakan laser (menggunakan laser UV) intensitas tinggi
dalam sumber ion. Molekul target ini kemudian meledak, menjadi fase
gas sambil mengionisasinya secara kimia. Fragmen-fragmen tersebut
menuju ke flight tube melalui lensa fokus. Flight time dari setiap fragmen
tergantung pada rasio m/z-nya. Fragmen yang lebih ringan tiba di
detektor ion lebih dahulu. Untuk mendeteksi fragmen m/z, setiap elemen
detektor berarus diode diaktifkan hanya untuk m/z tertentu, yang
memungkinkan pemilihan hanya pada massa tunggal per ledakan.
Dengan menggunakan teknik ini, seluruh pola ledakan fragmen dapat
dianalisis untuk setiap aktivitas, yang sangat meningkatkan sensitivitas
sistim. Time-of-Flight biasanya digunakan dalam penentuan struktur
protein di mana sistem LC-TOF digunakan untuk analisis protein, peptida,
dan polinukleotida.
 Fourier Transform Analyser

Sistem penganalisis massa Fourier transform menghasilkan spektrum massa

menggunakan resonansi ion siklotron. Sampel terionisasi dan pelarut
dihilangkan oleh interface penyemprot ion dan menuju ke dalam sel analisis,
yang terjadi pada medan magnet konstan pada sepasang pelat perangkap.
Setiap fragmen akan mengikuti orbit melingkar dengan karakteristik frekuensi
siklotron nilai m/z-nya.
 Detektor

• Detektor berfungsi untuk merekam muatan yang diinduksi

atau arus yang dihasilka ketika ion lewat atau mengenai
permukaan yang akhirnya akan menghasilkan spektrum
massa. Jenis detektor yang sering digunakan yaitu,
Electron Multiplier (EM), Channel Electron Multiplier Array
(CEMA), dan Array detector
 photomultiplier tube
• Ion akan menumbuk/berbenturan dengan photo katoda
menghasilkan electron.
• Elektron diarahkan pada dynode pertama an diubah menjadi
electron-electron sekunder
• Dynode selanjutnya (multiplier) akan melipatgandakan
electron
• Dynode terakhir dengan adanya kapasitor, elektron2 diubah
menjadi arus listrik, selanjutnya mnjadi spectrum massa
 Multipliers Elektron

• Detektor ion yang paling banyak digunakan dalam spektrometri massa.

• Pada detektor ini, ion dari analyser dipercepat menjadi kecepatan tinggi
untuk meningkatkan efisiensi deteksi. Hal ini dicapai dengan menahan
elektroda yang disebut dynode konversi pada potensi tinggi dari ± 3 sampai
± 30 kV, berlawanan dengan muatan ion terdeteksi.
• Sebuah ion positif atau negatif menumbuk dynode konversi menyebabkan
emisi beberapa partikel sekunder. Partikel sekunder dapat mencakup ion
positif, ion negatif, elektron dan netral.
• Ketika ion positif menyerang konversi dynode tegangan tinggi negatif,
partikel sekunder yang diinginkan adalah ion negatif dan elektron.
• Ketika ion negatif menyerang konversi dynode tegangan tinggi positif,
partikel sekunder yang diinginkan adalah ion positif.
• Partikel-partikel sekunder dikonversi menjadi elektron pada dynode
pertama, kemudian diperkuat oleh efek kaskade pada multiplier elektron
untuk menghasilkan arus listrik.
• Pengganda elektron dapat berupa dynode diskrit atau kontinyu dynode
(channeltron, pelat microchannel atau pelat microsphere).
• Multiplier dynode elektron diskrit terdiri dari 12 hingga 20
dynode yang memiliki sifat emisi sekunder yang baik.
• Aliran akhir elektron memberikan arus listrik pada akhir
multiplier elektron yang kemudian meningkat amplifikasi
elektronik konvensional
Channel Electron Multiplier Array (CEMA)

• CEMA terdiri dari susunan kumparan dari banyak saluran hingga beberapa ratus
per inci persegi, dimungkinkan dengan serat optik menggunakan kaca logam.
• Perbedaan potensial diterapkan ujung-ujung saluran atas dan bawah dari
kumparan tersebut dan menciptakan gradien listrik.
• Ion-ion memasuki saluran sehingga mereka menabrak dinding saluran. Ion
bertabrakan dengan permukaan untuk meninggalkan elektron.
• Elektron sekunder yang dihasilkan dari tabrakan dingding terus memantul ke
bawah saluran, memproduksi lebih electron sekunder sehingga memperkuat sinar
ion asli.
Detektor Array

Detektor array adalah detektor yang terdiri dari beberapa elemen koleksi
ion, diatur dalam baris/kotak di mana setiap elemen adalah detektor individu.
Detektor array secara spasial mendeteksi ion sesuai dengan m/z yang berbeda,
digunakan pada analisa massa magnetik. Ion tertentu dapat dideteksi secara
bersamaan oleh detector array. Keuntungan utama dari pendekatan ini adalah
sensitivitas yang yang dapat ditingkatkan walaupun dengan kisaran massa kecil.
 Mode Analisis

1. Full Scan atau MS Scan.

• MS Scan berfungsi untuk mencari/menentukan ion parent/precusor ion.

• Q1: berfungsi hanya memfokuskan ion yang masuk, pada Collision sel tidak ada fragmentasi
(sebab tidak ada gas collision dan tidak ada tegangan voltase/kecil).
• Q2: berfungsi menscan ion dari ma sampai mz dan kemudian Ion dilanjutkan ke detektor.
• MS scan akan menghasilkan kromatogram dan memberikan puncak-puncak pada tiap waktu
retensi dan nilai S/N
 +Q1: 5 MCA scans from sulfasalazine_FinalQ1_Pos.wiff Max. 7.4e6 cps.

7.4e6 399.0
7.0e6 Full Scan Spectrum
6.5e6

6.0e6

5.5e6

5.0e6

4.5e6
Intensity, cps

4.0e6

3.5e6

3.0e6

2.5e6

2.0e6

1.5e6
400.0

1.0e6
400.9 401.1
5.0e5

0.0
396.5 397.0 397.5 398.0 398.5 399.0 399.5 400.0 400.5 401.0 401.5
m/z, amu
 2. Selective Ion Monitoring
(SIM)

• SIM bekerja dengan cara memilih satu m/z yang diinginkan.

• Q1: ion masuk dan mengunci m/z ion yang diingikan, selanjutnya ion akan dilanjutkan
ke ruang penumbuk, dimana tidak terjadi fragmentasi (tidak ada gas fragmentasi dan
tidak ada tegangan/kecil).
• Q2: ion akan dilanjutkan ke Q2 dimana Q2 berfungsi memfokuskan ion menuju
detektor.
• Nilai S/N pada SIM akan lebih besar dibandingkan dengan MS Scan, karena hanya ion
yang dipilih saja yang dilewatkan ke detektor.
 3. Multiple Reaction Monitoring
(MRM)

• Mode analisis dengan memilih nilai m/z yang spesifik pada kedua penganalisis massa dan
ruang tumbukan diisi dengan gas penumbuk. Mode analisis ini memungkinkan deteksi yang
memiliki kespesifikan dan sensitivitas yang tinggi.
• Q1: ion akan masuk Q1 dan dikunci hanya m/z yang diinginkan ,Q1 berfungsi untuk
mengunci parent ion/prekusor ion.
• Q2: terjadi fragmentasi, gas fragmentasi menyala dan ada nilai tegangan untuk
memfragmentasi ion dari Q1.
• Q3: ion-ion yang telah terfragment di Ruang penumbuk akan masuk ke Q3 dan dikunci ion
fragmentasinya. Ion fragmentasi disebut juga daughter ion/ion Produk.
• Nilai S/N pada MRM akan lebih besar dibandingkan dengan SIR dan MS Scan, karena hanya
ion yang dipilih ke detektor lebih selektif.
Contoh Spektrum MRM

Ion Induk

Ion Produk
 Ion Induk

Ion Produk

Ion Produk
 4. Product/ daughter ion scan

• Q1: ion masuk dan dikunci hanya m/z yang diinginkan, Q1 berfungsi untuk mengunci
parent ion/precusor ion.
• Selanjutnya pada ruang penumbuk akan terjadi fragmentasi, Gas fragmentasi menyala
dan ada nilai tegangan untuk memfragmentasi ion dari Q1. Ion-ion yang telah
terfragment di ruang penumbuk akan masuk ke Q2 dan akan di scan pada Q2 ion
fragmentasinya. (fungsi MS Scan pada Q2 untuk scanning ion fragmentasi).
 Product Ion Spectrum

BMS-724296 D 18 (0.339) Cm (8:18) Daughters of 492ES+

336.11 1.25e7
100

140.06 233.95
120.38
0 m/z
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
 +Product (399.0): Experiment 3, 0.345 to 1.047 min from 049-IS Sulfasalazine MSMS.wiff Max. 9.3e5 cps.

223.2 m/z 119

9.0e5 O
8.5e5 Product Ion Spectrum m/z 94
C OH
8.0e5 H
7.5e5
N N
S N N OH
7.0e5
O O
6.5e5 m/z 165 m/z 137
6.0e5 m/z 223
I n t e n s it y , c p s

5.5e5

5.0e5

4.5e5
119.0
4.0e5

3.5e5
213.1
3.0e5
94.0 147.1
2.5e5 239.0

2.0e5 165.3

1.5e5 137.1 381.1

240.8
1.0e5 316.9
91.0 157.1 169.0 185.3 224.3 257.0 287.2
5.0e4 333.2
111.1 121.1
0.0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z, amu
 Analisa Kuantitatif
Metode: Internal Standard
1. Menentukan Deteksi Massa rasio m/z dari senyawa dan baku dalam yang
akan dianalisis (Tunning), menggunakan mode analisa yang sesuai (contoh
mode MRM). Koonsentrasi standar yang digunakan untuk Tunning 500 –
1000 ng/mL.
2. Optimasi kondisi analisis untuk kromatografi (fase gerak, waktu alir, suhu
kolom, kolom, dll)
3. Buat kurva kalibrasi, antara konsentrasi analit dengan rasio area analit
terhadap baku dalam (Internal standard)
4. Tentukan sampel
 Optimasi deteksi m/z pada spektrometri massa
Senyawa BM ion Ion Cone Collision Mode ion area
induk produk voltage energy
(m/z) (m/z)

      126,00 44 20 ESI + 4,412 e^6

6-MP 152 153,03
Hasil optimasi deteksi m/z pada spektrometri massa
119,10 44 20 ESI + 4,412 e^6

92,05 44 28 ESI + 1,781 e^6

6-MMP 166 167,17 152,03 38 22 ESI + 2,968 e^6
126,03 38 18 ESI + 7,198 e^6

119,07 38 22 ESI + 2,968 e^6

5-FU 130 131,10 57,57 38 24 ESI + 1,902 e^5
129,15 42,05 28 14 ESI - 2,423 e^6
 Kromatogram Hasil Analisis

Kondisi analisis: kolom C18 BEH (2,1 x 100 mm) 1,7 µm; laju alir 0,2 mL/menit; volume
penyuntikan 10 µL; deteksi MS nilai m/z 153,03 -> 119,10 untuk 6-MP, 167,17 -> 126,03 untuk
6-MMP, dan 129,15 -> 42,05 untuk 5-FU
 Konsentrasi Area PAR Konsentrasi %diff
sesunguhnya 6-MP 5-FU terukur
(ng/mL) (ng/mL)

0,0 0 7001 0 0 0
26,0 711 8798 0,0808 25,80 -0,77
52,0 1345 8968 0,1499 48,83 -6,09
104,0 2785 8929 0,3119 102,83 -1,12
208,0 6181 8894 0.6949 230,50 10,82
520,0 13684 8990 1,5221 506,23 -2,65
832,0 21345 8689 2,4565 817,70 -1,72
1040,0 28001 8757 3,1975 1064,70 2,37
 Konsentrasi Area PAR Konsentrasi % diff
sesunguhnya 6-MMP 5-FU terukur
(ng/mL) (ng/mL)

0,0 0 7001 0 0 0
13,0 2097 8798 0,2383 12,03 -7,44
26,0 3187 8968 0,3553 24,89 -4,27
52,0 5583 8929 0,6253 54,56 4,92
104,0 10266 8894 1,1543 112,69 8,36
208,0 17589 8990 1,9565 200,85 -3,44
416,0 32778 8689 3,7724 400,39 -3,75
520,0 43605 8757 4,9794 533,03 2,51
 Analisa Sampel

Subyek Area PAR Konsentrasi

        (ng/mL)

  6-MP 6-MMP 5-FU 6-MP 6-MMP 6-MP 6-MMP

1 5,27 14,80 
174 2392 9079 0,0192 0,2635

187 2562 10705 0,0175 0,2393 4,70 12,14

2
270 1321 10884 0,0248 0,1214 7,13 0,81

192 1689 10273 0,0187 0,1644 5,10 3,91

 Efek Matrik
Dalam analisis dengan matriks biologis menggunakan MS, dipersyaratkan
untuk divalidasi adanya pengaruh matrik pada proses Ionisasi.
Efek matriks dinyatakan dengan faktor matriks, diperoleh berdasarkan
persentase area analit dan baku dalam pada matriks setelah proses ekstraksi
terhadap area analit dan baku dalam tanpa matriks
Di tentukan apakah komponen-komponen lain di dalam matriks menghalangi
proses ionisasi analit dan baku dalam pada analisis spektrometri massa
sehingga terjadi penekanan atau peningkatan ionisasi.
Ion suppression adalah terjadinya penekanan ionisasi analit dan baku dalam
selama proses analisis menggunakan spektrometri massa. Penekanan ionisasi
terjadi apabila faktor matriks yang diperoleh kurang dari 100%, sedangkan
peningkatan ionisasi analit dan baku dalam oleh matriks apabila faktor matriks
yang diperoleh lebih dari 100%
Beberapa pendekatan yang dapat dilakukan untuk meminimalkan efek matriks
diantaranya adalah

1. Penggunaan direct electron ionization liquid chromatography-mass

spectrometry (direct-EI LC-MS) pada metode ionisasinya, Prosesnya
didasarkan pada ionisasi electron impact yang terjadi pada fase gas dan tidak
dipengaruhi oleh kelarutan dari senyawa matriks
2. Menggunakan mode analisis multiple monitoring reaction (MRM), pendekatan
ini dengan memfokuskan nilai m/z yang spesifik dari analit pada dua
penganalisis massa, sehingga menggurangi ion bermuatan dari komponen
matriks yang tidak difokuskan pada sekitar lubang ( orifices)menuju detektor.
3. Pendekatan internal standar berlabel isotop (SIL-IS) yang stabil adalah pilihan
terbaik yang tersedia untuk meminimalkan efek matriks , Pendekatan ini
didasarkan pada menyeimbangkan variasi sinyal analit dengangangguan yang
setara pada IS. Untuk alasan ini, IS yang digunakan harus stabil.
• Reference :
Hoffmann, E & Stroobant, V. (2007). Mass spectrometry: principles and application
(3rd Ed.). Chichester: Jhon Wiley & Son Ltd.
Kang, J. (2012). Principles and Applications of LC-MS / MS for the Quantitative
Bioanalysis of Analytes in Various Biological Samples. In Prasain,J.K (Ed.). Tandem
Mass Spectrometry-Applications and Principles Rijeka-Croatia: Intech.
McMaster, M.C. (2005). LC/MS a practical user’s guide. New Jersey: Jhon Wiley & Son
Inc
Skoog, D.A., Holler, F.J., & Crouch, S.R. (2007). Principles of instrumental analysis (6th
ed.). Belmont: Thomson Brook/Cole.
https://www.agilent.com/en/products/mass-spectrometry/lc-ms-instruments
http://
www.waters.com/waters/de_DE/Mass-spectrometer-for-easiest-introduction-of-LC-
MS-MS-in-the-clinical-laboratory/nav.htm