MARKER BIOKIMIA

Deteksi dengan menggunakan marker

Deteksi tidak langsung (gene products):
isozymes, allozymes
Deteksi langsung (DNA sequence):
RFLPs Biochemical
marker
RAPDs Allozyme
AFLPs Traditional
marker
SSRs Non-PCR systems
ISSRs based marker
RFLP, Minisatellite (VNTR)
SNPs
others PCR based PCR
marker generation: in
Microsatellite, RAPD, AFLP, vitro DNA
CAPS (PCR-RFLP), ISSR, SSCP, amplification
SCAR, SNP, etc.
 Isozymes and Allozymes

Mutasi menyebabkan perbedaan pada

komposisi asam dan basa asam
amino, tetapi tidak menyebabkan
perubahan fungsi enzim
Lactate Dehydrogenase
Perubahan kecil pada struktur primer Dym et al 2000: PNAS 97:9413–9418
dapat mengubah struktur sekunder

Isozim adalah enzim-enzim yang memiliki molekul aktif dan

struktur kimia yang berbeda tetapi mengkatalis reaksi kimia
yang sama.
 Isozim/Allozim (marker biokimia)

Bentuk alternatif dari protein tertentu yang divisualisasi

pada gel sebagai band dengan mobilitas yang
berbeda.
Polymorphism karena adanya mutasi sebuah asam
amino diganti, muatan elektrik protein mungkin
berubah

Teknik : Elektroforesis dan pewarnaan enzim

 Allozyme
diversity
DNA …ATG-CTA-GCT…

Protein…Met-Leu-Ala…

mutations
Replacement Silent

…AGG-CTA-GCC…
…Arg-Leu-Ala…
Isozim adalah bentuk yang bermacam-macam dari enzim
tertentu.

Allozymes: Allelic isozymes: bentuk berbeda dari sebuah

enzim yang dikode pada lokus yang sama

Isozim dapat diisolasi dan diidentifikasi dengan elektroforesis

dan pewarnaan tertentu
Konsep dari isozim adalah sebagai berikut:

1.Bentuk molekular enzim yang lebih dari satu (isozim)

adalah umum terdapat pada organisme.

2. Isozim berbagi aktivitas katalitik umum. Tiap isozim

memiliki tugas spesifik dalam lintasan metabolik dan
berfungsi dengan harmonis dengan enzim lain dalam
organisasi sel.

3. Isozim sering menunjukkan sel atau jaringan yang

khusus.

4. Heterogenitas molekular dari isozim confers

flexibility, versatility and precision upon an organism in
terms of metabolic functions.
 Persiapan sampel
Transportasi dan penyimpanan sampel

Penanganan sampel merupakan bagian penting dari metode

untuk mendapatkan ekstrak enzim yang baik.

Koleksi biji harus tetap disimpan dingin dan kering selama di

perjalanan, tetapi biji relatif toleran terhadap fluktuasi suhu.
Jika disimpan, sebaiknya disimpan di refrigerator atau
dibekukan.

Sampel daun sebaiknya tetap dingin, lembab dan teraerasi.

Keadaan basah dan anaerobic menyebabkan tumbuhnya
jamur dan kematian sampel. Sampel daun sebaiknya disimpan
di refrigerator dan tidak dibekukan.
Ekstraksi enzim harus dilakukan segera setelah sampel daun
tiba di lab. Perkecualian untuk pine bud dapat disimpan di -80C
dalam waktu lama atau disimpan dalam liquid nitrogen.
 EKSTRAKSI

FOLIAGE and Pine buds:

0.2M phosphate buffer pH 7.5
0.3% bovine albumin
0.1% dithiothreitol
2.0% sodium ascorbate
10.0% PVP-40
0.1% 2-mercaptoethanol (optional)

ANGIOSPERM FOLIAGE:
Same as conifer foliage, but:
increase PVP-40 to 12%
Sampel daun:

Digerus/dihancurkan X mg sampel daun dengan 2X ul

buffer ekstraksi hingga menjadi serbuk dalam liquid
nitrogen.

Jangan dibiarkan sampai mencair. Simpan microtube

pada -80 sampai siap digunakan.

Pada hari elektroforesis dilakukan, cairkan dan

sentrifuge tabung. Letakkan dalam es sampai sampel
dimasukkan di gel.
 Detection
Dipisahkan melalui elektroforesis pada gel pati
atau pada gel poliakrilamida

Isozim dideteksi berdasarkan aktivitas enzim

Pewarna mengandung substrat untuk enzim,

kofaktor, dan oxidized salt (dye)

Pola-pola yang teramati disebut zymogram

Hillis, D.M., C. Moritz and B. K. Mable. 1996.

Molecular Systematics, 2nd ed.  Sinauer Assoc.
Inc., Sunderland, Mass
Persiapan Gel Elektroforesis

Introduction:
Teknik gel yang berbeda : agarosa, poliacrylamide dan pati
dapat digunakan untuk elektroforesis isozim.

Gel dibuffer secara kimia ke dalam pH spesifik dan menjadi

matriks yang dilalui oleh enzim bermigrasi sebagai respon
terhadap arus listrik.

Gel pati banyak digunakan untuk studi isozim. Gel pati

mudah dipotong sehingga pewarnaan dapat dilakukan untuk
bermacam-macam enzim dalam satu kali runnung
elektroforesis.
Sebelum elektroforesis proteins adalah molekul terpolarisasi
Setelah elektroforesis
 Isozyme Raw Data

PI 599761
PI 599761

PI 599761
A PI 240660
C
allelle 1 B D E
invariant mito. band
allelle 2

l-102
B-4
gel by M. Brothers MDH

Malate Dehydrogenase (MDH1)

sunflower gel
 Aplikasi
Hubungan kekerabatan/hubungan genetik dalam dan
antar populasi, sering berhubungan dengan struktur
geografik.
Keragaman genetik pada spesies tanaman klon
Forestry and agriculture
Conservation biology
Seed bank populations (Cabin 1998, McCue 1998)
Perubahan lingkungan dan heterogenitas habitat (Lehman 1997)

Patologi tumbuhan (Leuchtman 1996)

Koleksi plasma nutfah (Lamboy 1996)

Miroslav Zeidler 2000. ACTA UNIVERSITATIS PALACKIANAE OLOMUCENSIS
FACULTAS RERUM NATURALIUM BIOLOGICA 38: 1-10