STANDARISASI DAN

PENENTUAN MARKER OBAT

BAHAN ALAM

(metode uji parameter spesifik)

TIM DOSEN STANDARISASI & PENENTUAN MARKER OBA 2020
 PENENTUAN PARAMETER SPESIFIK ADALAH
aspek kandungan kimia (baik kualitatif maupun
kuantitatif) yang bertanggung jawab terhadap aktivitas
farmakologi tertentu
+ flavonoid tertentu
Ginko biloba Ginkolida mencegah kepikunan
sinergisme

terdeteksi lempuyang gajah tidak terdeteksi

(Zingiber zerumbet)
kurkumin
zerumbon
lempuyang pahit gingerol
terdeteksi (Zingiber littorale) terdeteksi

menghambat
sel neoplasma
 Senyawa marker aktivitas farmakologi

kadarnya???

kriterianya: Standarisasi

Senyawa aktif

Senyawa utama (mayor, dominan, >>)

Senyawa identitas (khas, unik, eksklusif)

Senyawa aktual
 Kriteria Senyawa Marker
• Senyawa aktif : senyawa yang langsung bertanggungjawab terhadap aktifitas
misalnya saponin ginsenosida pada tanaman ginseng (Panax ginseng)
• Senyawa utama : atau major compound yakni senyawa yang secara
kuantitatif dominan di dalam suatu tanaman obat. Contohnya kurkuminoid
di dalam rimpang kunyit (C.longa) meskipun bukan yang bertanggung jawab
secara langsung terhadap aktifitas farmakologi
• Senyawa identitas : senyawa yang khas, unik, eksklusif hanya terdapat pada
suatu tanaman obat, misal lunamarin, lunakrin dan lunasin yang terdapt
pada sanrego (Lunasia amara)
• Senyawa aktual : senyawa apapun asalkan terdapat di dalam tanaman yang
di analisis
 Ketentuan umum mutu ekstrak menurut DEPKES-BPOM
(2000, 2004) menyebutkan bahwa aspek yg harus
ditetapkan pada parameter spesifik adalah:

1 Profil KLT
2 Penetapan kadar marker
3 Penetapan kadar total golongan
senyawa metabolit
4 Kelarutan ekstrak dalam
etanol dan air
 Profil KLT
• Tujuan : menunjukkan setidaknya senyawa aktif (marker) betul ada di dalam
ekstrak atau secara kimiawi otentik yakni berasal dari tanaman yang benar.
• Parameter : senyawa marker muncul sebagai bercak terpisah
• Permasalahan :
1. Marker muncul tidak sebagai bercak tunggal meskipun senyawa
pembanding otentik tersedia
2. Tidak tersedia marker yang otentik

Profil KLT ini merupakan analisis kualitatif pendahuluan, kegagalannya

menghentikan dalam upaya kuantitatifnya.
• Keberhasilan memunculkan profil KLT senyawa target dipengaruhi
oleh :
1. Sistem kromatografi (Fase diam dan fase gerak)
2. Jenis pelarut (thdp senyawa target dlm ekstrak)
3. Jumlah penimbangan ekstrak (terlalu kecil, marker tidak terbaca →
jumlah penimbangan hrs ditingkatkan)
4. Pemilihan metode visualisasi → cara fisika (sinar UV 254/366) lalu
cara kimia (reagen spesifik/semprot)
 Sistem kromatografi (fase normal)
• Fase diam : KLT silika gel GF254
• Fase gerak :
1. Normalnya → CHCl3 : MeOH (MeOH <20%)
2. Komposisi lain → heksan : etil asetat ( 7:3, 5:5, 3:7)
3. Untuk memisahkan senyawa inti aromatik → aseton :benzen (benzen >aseton)
4. Untuk golongan alkaloid → metanol, kloroform atau heksan dengan salah satu komopenen yang
bersifat basa (dietilamin atau beberapa tetes amonia)
5. Senyawa yang terlalu polar (polifenol sederhana, glikosida steroid, glikosida flavonoid) →
kloroform:metanol dengan penambahan sedikit air. Jika terlalu polar menggunakan metanol :asam
asetat glasial:air:asam formiat (rasio asam kecil)
6. Untuk mempertajam pemisahan bisa ditambahkan beberapa tetes asam lemah atau basa lemah
 Sistem kromatografi (fase
terbalik)
• fase diam: C18 yang terikat silika
• fase gerak:
1. metanol:asetonitril (1:1, 3:1, 2:1)
2. metanol:asetonitril: air (2:2:1 atau 1:2:1)

sistem ini digunakan jika sistem fase normal tidak memberikan hasil
yang baik
 Penetapan kadar marker
• Tujuan : menunjukkkan secara kuantitatif kadar dari senyawa marker yang
ada di dalam ekstrak sehingga bisa ditentukan berapa jumlah senyawa yang
bertanggung jawab terhadap aktifitas farmakologi di dalam ekstrak
• Parameter : terbacanya senyawa target pada kadar tertentu
• Permasalahan :
1. Senyawa target tidak berwarna
2. Senyawa marker tersedia dalam jumlah terbatas
3. Bentuk peak pada pembacaan densitometer maupun HPLC tidak terbatas
4. Linearitas dan reprodusibilitas rendah
 Penetapan kadar total golongan metaboli
• Tujuan : menetapakan kadar total golongan metabolit sekunder
tertentu , misal : fenolat, flavonoid, alkaloid, antrakinon, kumarin,
saponin
• Parameter : kadar metabolit sekunder pada range tertentu
• Permasalahan :
1. Golongan senyawa tidak ada/terdeteksi
2. Beberapa metode standar tidak aplikatif
3. Tidak semua instrumen bisa diterapkan untuk analisis kadar total
4. kadar yang diperoleh tidak spesifik (>50%)
1. Golongan fenolat
2. Golongan flavonoid Golongan metabolit
3. Golongan saponin sekunder yang harus
4. Golongan minyak atsiri ditetapkan
5. Golongan tannin
6. Golongan alkaloid
(dalam parameter mutu
7. Golongan steroid ekstrak Indonesia )
8. Golongan kumarin
 Kadar fenolat total
• uji pendahuluan: FeCl3 → warna hijau sampai hitam
• Kadar fenolat total dinyatakan dalam mg fenolat yang setara dengan
asam galat (gallic acid equivalent) dalam gram ekstrak
• ekstrak dibuat dlm konsentrasi 1%
• pembanding: asam galat
• pereaksi: folin ciocalteu dan Na2CO3 7%
• Ukur absorbansinya dengan spektrofotometri dengan panjang
gelombang 749,5 nm
 Kadar Flavonoid total

• Uji pendahuluan: sitroborat → floresensi kuning dibawah UV366

• penetapan kadar:
1. Metode Chang : pereaksinya → AlCl3 dan kalium asetat. absorbansi
diukur menggunakan spektrofotometer pada 437 nm. Kandungan total
dinyatakan dengan quersetin equivalent (%)
2. Metode Zhou : pereaksinya → NaNO2, AlCl3 dan NaOH. absorbansi
diukur menggunakan spektrofotometer pada 510,5 nm Kandungan
total dinyatakan dengan rutin equivalent (%).
 Cara lain utk uji Kuantitatif
Flavonoid:
1. KCKT / HPLC
2. GC: Flavonoid dirubah menjadi turunan termetilasi
atau tertrimetisilisasi dan pembuatan turunan ini
memungkinkan juga pengukuran spectrum massa.
 lanjutan...
Penentuan secara Kuantitatif : KADAR FLAVONOID
MeOH, air,
saring
Serbuk Simplisia Eks. MetOH

+ camp. AlCl3 dan As. Asetat

diamkan 30 menit

Catatan:
- Lakukan percobaan blanko
- Perlu pembanding umumnya Quersetin/Rutin Abs ukur 415 nm
 Saponin total
• Uji pendahuluan: penggojogan larutan ekstrak dengan solven semula,
membentuk buih stabil lebih dari 15 menit
• penetapan kadar:
1. darah sapi segar + Na sitrat + dapar fosfat + larutan ekstrak.
2. Hemolisis darah ditandai dengan perubahan warna larutan menjadi
jernih/transparan
• Hasil pembacaan dinyatakan dengan indeks saponin yaitu
perbandingan antara kadar ekstrak terkecil yang memberikan hemolisis
dengan saponin standar terendah yang memberikan hemolisis
 Penetapan Alkaloid (Kuantitatif)
Gravimetri
Titrimetri Spektrometri

Ekstraksi
Ekstraksi

Ekstraksi

Timbang Pengendapan Asam basa TBA

Ukur Absorban

Timbang

KCKT / HPLC
 Alkaloid total
• Uji pendahuluan: Mayer/Dragendorff → endapan
• penetapan kadar:
larutan ekstrak + asam asetat 10%, kocok, saring dgn kertas saring yg
sudah ditimbang → filtrat dipekatkan + ammoium hidroksida → terbentuk
endapan → endapan dicuci lagi dgn ammoium hidroksida → endapan
dikeringkan pada 60 C, 30 menit, dinginkan → endapan ditimbang ad
bobot konstan → hitung rendemen alkaloid
• Kelemahan: senyawa non alkaloid berunsur Nitrogen akan turut
mengendap
 Penetapan Kadar Alkaloid

Contoh: Penetapan Kadar Kulit delima

Simplisia Erlenmeyer
Filtrat masuk corong pisah
tutup Eter, NaOH
Kocok, saring

1 mL HCl 0,025 N Lap. Eter

3, 675 mg alkaloid Metil jingga, ad 50 mL
Titer dgn HCl 0,025 N
 Minyak atsiri total

• Uji pendahuluan: secara organoleptis → bau khas atau ekstrak diteteskan

pada kertas perkamen → komponen terpisah, tidak tampak noda
• Penentuan Secara Kuantitatif: Destilasi uap dan Stahl (air) pelarut air
dinyatakan sebagai % V/b.
• penetapan kadar: ekstrak + air suling → labu dipanaskan → penyulingan
selesai, dinginkan >15 menit → volume atsiri dlm buret dicatat. kadar atsiri
dihitung dalam %.
• Kadar minyak atsiri tidak boleh lebih dari 1% v/b (jika komponen non volatil
yg diutamakan dlm ekstrak)
 Kumarin total

• Uji pendahuluan: larutan ekstrak diidentifikasi di bawah UV 366 →

adanya fluoresensi kuning kebiruan
• Penetapan kumarin total dgn metode fluorometri yg dimodifikasi
menjadi spektrofotometri UV:
larutan ekstrak 1% + NaOH → ukur absorbansi 331 nm. pembanding
yg digunakan adalah kumarin 0,1%.
 Steroid (triterpen) total

• Penetapan kadar total steroid/triterpen tidak dilakukan

tetapi sebaiknya penetapan dilakukan berdasarkan
marker sterol tertentu dengan metode densitometer
atau GC
 Antrakinon

Cara penetapan kadar:

• Ekstrak + air panas, diamkan 5 menit, didinginkan → ekstraksi dgn benzen
→ Lapisan benzen dipisahkan→ Lapisan air + FeCl3 dan HCl → panaskan
di penangas air selama 10 menit, dinginkan→ diekstraksi dengan benzen
3x → Lapisan benzen diuapkan→ residu + KOH 5% → Absorbansi diukur
pada panjang gelombang 506 nm
• pembanding: aloin
• Kadar antrakinon total dinyatakan sebagai aloin equivalent
 ANTRAKUINON (lanjutan)

Penentuan Secara Kuantitatif: KADAR ANTRAKUINON

Benzena
Simplisia Eks. Benzen

Uapkan
Pakai pembanding + Lart. KOH

Ukur abs
pada 515 nm Lart. warna
 Kadar tanin total

• Ditetapkan kadarnya secara titrimetri (titrasi)

• uji pendahuluan: FeCl3 → Tanin terhidrolisis (tanin galat), warna larutan
biru kehitaman; Tanin terkondensasi (proantosianidin), warna hijau
kehitaman
• penetapan kadar: Titrasi dilakukan dengan kalium permanganate (KMnO4)
dengan ditambahkan indigo sulfonat, larutan dititrasi sampai warna kuning
emas (pembanding: asam galat)
• cara lain dgn metode spektrofotometri: Vanilin/EtOH, Ukur pada 530 nm
• Kadar fenol total + Folin Ciocalteu  Ukur ada 765 nm
 Lanjutan ....

Filtrat kumpulkan
Serbuk Simplisia
Didihkan, saring dalam labu takar
Penyarian sempurna
Cek dengan lart.Fe(III)

Kadar tanin: 10 mL Filtrat

1 mL KM04 0,1N Indigosulfonat lart.
Titrasi dengan KMO4 0,1N
0,004157 g tanin Berwarna biru
TA: kuning emas
 Kadar ekstrak larut dalam air dan etanol

tujuan: mengkalkulasi persentase senyawa polar, semipolar-nonpolar

yang terkait aktivitas farmakologi
1. Metode penetapan kadar sari larut air
ekstrak dimaserasi dengan air:kloroform selama 24 jam sambil
dikocok pada 6 jam pertama→ diamkan 18 jam dan disaring → Filtrat
air diuapkan dalam cawan yg telah ditara→residu dipanaskan pada
suhu 105 C hingga bobot tetap.

Kadar sari larut air dihitung dalam persen terhadap ekstrak awal
2. Penetapan kadar sari larut etanol
cara: ekstrak dimaserasi dengan etanol 96% selama 24 jam sambil 6
jam pertama dikocok → Didiamkan selama 18 jam dan disaring
cepat → Filtrat diuapkan pada cawan porselen → residu dipanaskan
pada suhu 105 C sampai bobot tetap.

Kadar sari larut etanol dihitung dalam persen terhadap ekstrak awal
 TERIMAKASIH

www.uhamka.ac.id info@uhamka.ac.id (021)73944451 uhamkaid Uhamka @UhamkaI

D