ISOLASI ASAM KLOROGENAT

DARI DAUN UBI JALAR

Kelompok SN-4:
Andrian Hartanto 10715077
Nita Sapitri 10715015
Saffana Haniyya 10715099
Syifa Dina Az- Zahra 10715069
Carissa Lesley Tjahjadi 10715096
Jovita Aileen Ramadhani 10715095
 Asam
Klorogenat

Daun Ipomoea batatas mengandung asam

klorogenat yang merupakan asam fenolik.
Struktur kimianya terdiri dari gugus asam kafeat
dan asam quinat
PENAPISAN FITOKIMIA
 Metode
Kandungan Kimia Hasil Keterangan
Pengujian
Berwarna
Kertas saring -
cokelat
Tidak
Alkaloid Mayer -
berwarna
Tidak
Dragendorff -
berwarna
Berwarna
Mayer Dragendorff
kuning
pada
Flavonoid Cyanidin test +
lapisan
amil
alkohol
 Busa tidak
Pengocokan -
Saponin stabil
+ HCl Busa hilang -
+ FeCl3 5% Biru kehitaman +
Tidak ada
+ Gelatin - Pengocokan +HCl + FeCl3 5%
Tanin endapan

+ Stiasny Tidak dilakukan Tidak dilakukan

Kuinon + NaOH Merah +

Steroid/Triterpe Liebermen-
Hijau-biru +
noid Burchard
Gelatin +NaOH LB
Tidak
Visualisasi UV
Kumarin berfluorosensi −
366 nm
Keterangan: + = ada; − = tidak ada kuning-hijau
UV 366 nm
EKSTRASI DAN PEMANTAUAN EKSTRAK
 Pemilihan Metode Ekstraksi

Asam klorogenat
stabil terhadap
panas
Metode
Refluks yang
efektif dalam
mengekstraksi
daun ubi jalar
Waktu ekstraksi
relatif lebih cepat
 Pemilihan Pelarut

Digunakan etanol 95%

Asam klorogenat sebagai pelarut
merupakan ekstrak karena dapat
senyawa polar melarutkan sebagian
besar polar.
 Simplisia 100 gram direndam
dengan etanol 95% dalam labu
refluks hingga ekstrak terendam
(500 mL)

kondensor
Aliran air dan penangas
dinyalakan

Simplisia

Pelarut : Ekstraksi dilakukan 2 jam setelah

etanol 95% pelarut mendidih

Penangas
Ekstrak disaring dan dipekatkan
dengan water bath
Pemantauan ekstrak

Eluen yang dipilih

Asam asetat : etil asetat : air
(1 : 8 : 1,5)

Fase diam
Silika gel GF 254
 Hasil Pemantauan ekstrak

(a) (b) (c) (d)

• (a) Hasil pemantauan di bawah sinar UV 254 nm. (b) Hasil pemantauan di
bawah sinar UV 366 nm. (c) Hasil pemantauan dengan penampak bercak
FeCl3 (d) Hasil pemantauan dengan penampak bercak H2SO4 dan
dipanaskan.
FRAKSINASI I
 Fraksinasi

Metode : Ekraksi Cair-Cair (mampu memisahkan senyawa

berdasarkan kepolarannya, sederhana dan cost effective)
Extraktan: Air, n-Hexana, Etil asetat
 Prosedur ECC (1)
Sejumlah ekstrak kental daun ubi jalar
dimasukkan ke dalam gelas kimia, kemudian
ditambahkan air panas dan disaring

Filtrat dimasukkan ke dalam corong pisah.

ditambahkan n-hexana (perbandingan fase

air dan n-hexana adalah 1:1)

Dilakukan pengocokan perlahan

Fasa air dan fasa n-hexana dipisahkan pada

wadah yang berbeda
 Prosedur ECC (2)
• Fasa air kembali di masukan kedalam corong pisah
1
• Ditambahkan etil-asetat (perbandingan fase air dan etil
2 asetat adalah 1:1)

• Dilakukan Pengocokan perlahan dan teratur

3
• Fasa air dan fasa etil asetat dipisahkan pada wadah
4 yang berbeda

• Fasa air dipekatkan menggunakan rotary evaporator

5
 Pembahasan

• ECC didasarkan pada koefisien partisi, senyawa yang polar akan

cenderung tertarik pada ekstraktan yang polar.
• Sebelum dilakukan ECC ekstrak dimasukan ke dalam air panas
dan disaring untuk menghilangkan klorofil
• Etil asetat menarik pengotor yang bersifat semipolar
• N-hexana  menarik senyawa non-polar
• Pemekatan fraksi dengan menguapkannya diatas penangas
(Asam klorogenat: termostabil).
• Banyak rendemen dipengaruhi oleh metode yang dipilih dan
jumlah senyawa target dalam ekstrak
Hasil Perhitungan Rendemen Fraksi
Bobot ekstrak yang digunakan: 5 gram

Fraksi Bobot fraksi (Gram) Rendemen (%)

Air 2,8641 57,282

Etil asetat 0,2343 4,686

N-hexana 0, 1251 3,902

 Pemantauan Fraksi

• Metode: Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

• Tujuan: Memastikan adanya asam klorogenat dalam
fraksi yang didapat (fraksi air)
• Fasa diam: Silika gel GF254 (Sukohar et al., 2011)
• Fasa gerak: asam asetat: etil asetat: air (1: 8: 1,5)
• Penampak bercak: Sinar UV 254nm, 366nm, H2SO4, FeCl3
HASIL PEMANTAUAN FRAKSINASI I

UV 254 nm UV 366 nm H2SO4 FeCl3

P: Pembanding; Fa: Fraksi air; Fe: Fraksi etil asetat; Fh: Fraksi heksana; E: Ekstrak
 Perhitungan Rf
Pada UV 254nm, 366nm dan H2SO4
• Jarak elusi eluen: 5,5 cm
• Jarak elusi pembanding: 1,9 cm
• Jarak elusi bercak pada Fa: 1,8 cm
• Jarak elusi bercak pada Fe: 1,8 cm
• Jarak elusi bercak pada E:1,8 cm
• Rf pembanding: 0,345
• Rf fa: 0,327
• Rf fe: 0,327
• Rf E: 0,327
• Tidak terdapat bercak pada Fraksi
n-hexana
Pada FeCl3:
Jarak elusi eluen: 5 cm
Jarak elusi pembanding: 1,8 cm
Jarak elusi bercak pada Fa: 1,9 cm
Jarak elusi bercak pada Fe: 1,8 cm
Jarak elusi bercak pada E:1,8 cm
Rf pembanding: 0,36
Rf fa: 0,38
Rf fe: 0,36
Rf E: 0,36
Tidak terdapat bercak pada Fraksi
n-hexana
 Pembahasan
• Kromatografi merupakan metode pemisahan fisikokimia senyawa
berdasarkan waktu huni.
• Prinsip KLT  adsorpsi, desorpsi dan elusi. Senyawa akan terpisah
berdasarkan kepolarannya
• Penyangga pada KLT kaca, plastik dan alumunium
• Adsorben  silika gel, alumina, kiselghur, dan selulosa
• Fasa gerak pada KLT  single solvent ataupun mix solvent (tergantung pada
senyawa dan polaritasnya)
• Metode elusi  isokratik dan gradien
• Penampak bercak spesifik dan universal
• KLT silika gel GF 254  mengandung gypsum dan indikator florosensi
 Pembahasan
• Penjenuhan chamber  untuk menyeragamkan tekanan uap dalam chamber
sehingga nantinya fasa gerak akan bergerak dalam jarak elusi yang sama pada
plat
• Penampak bercak universal  Mampu memvisualisasikan keberadaan
senyawa target dan pengotor dalam fraksi,
• Penampak bercak spesifik  mengetahui keberadaan senyawa target karena
mampu memberikan bercak yang spesifik hanya pada senyawa target
• Pemantauan: UV 254nm (Silica gel GF 254 memiliki indikator florosensi),
366nm (asam klorogenat berpendar ungu), H2SO4 (Mendeteksi keberadaan
senyawa organik), FeCl3 (Membentuk kompleks dengan senyawa fenolik)
• Fraksi yang kemudian dipilih untuk subfraksinasi adalah fraksi air 
Pertimbangan: intensitas bercak dan sifat fisikokimia senyawa target
FRAKSINASI II
 Fraksinasi II

Metode Kromatografi Cair Vakum

• Mekanisme : Adsorpsi, Desorpsi, Elusi, Perbedaan Tekanan
• Alasan:
Efisiensi metode dalam pemisahan senyawa dalam
campuran
Waktu relatif lebih cepat dibandingkan Kromatografi kolom
klasik
 Nomor Kloroform Etil asetat Metanol
1. 10 0 0
2. 9 1 0
3. 8 2 0
Fase diam : Silika gel H 4. 7 3 0
5. 6 4 0
6. 5 5 0
Fase gerak : eluen dengan tingkat 7. 4 6 0
8. 3 7 0
kepolaran yang meningkat 9. 2 8 0
(kloroform:etilasetat:metanol) 10. 1 9 0
11. 0 10 0
12. 0 9 1
13. 0 8 2
14. 0 7 3
15. 0 6 4
16. 0 5 5
17. 0 4 6
18. 0 3 7
19. 0 2 8
20. 0 1 9
21. 0 0 10
CARA KERJA
Semua alat dan bahan disiapkan.

21 kombinasi eluen disiapkan

Fraksi daun ubi jalar ditimbang lalu ditambahkan serbuk

adorsorben sedikit demi sedikit hingga terbentuk sampel kering.
Adsorben yang ditambahkan maksimal 1:1 dengan sampe

Ujung kolom disumbat dengan kapas bebas lemak

kemudian ditambahkan adsorben. Kemudian divakum
CARA KERJA
Fraksi daun ubi jalar dimasukkan ke dalam kolom sedikit
demi sedikit di atas permukaan adsorben kemudian
ditambahkan kertas saring di atasnya.

Eluen yang berlebih ditambahkan untuk membasahi

adsorben pada kolom

Ditambahkan eluen sedikit demi sedikit, lalu kran dibuka

sehingga eluen dan senyawa yang difraksinasi akan turun.

Hasil subfraksinasi ditampung dalam vial berdasarkan

volume.

Subfraksi yang diperoleh dipekatkan menggunakan rotary

evaporator atau waterbath, lalu ditimbang dan dihitung
persen rendemen.
 Hasil Perhitungan Rendemen Subfraksi
Diameter kolom = 4 cm
Tinggi adsorben = 6 cm
Volume adsorben = 𝜋 r2 t
= (3,14 x 22 x 6) x 1 cm
= 75,36 cm3
Bobot adsorben = ½ x 75,36 = 37,68 gram
Bobot fraksi air = 1/20 x 37,68 gram = 1,884 gram
Bobot adsorben yang digunakan untuk membentuk serbuk sampel = 0,7078 gram
𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑢𝑏𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑎𝑚𝑏𝑖𝑙 𝑢𝑛𝑡𝑢𝑘 𝑝𝑒𝑚𝑢𝑟𝑛𝑖𝑎𝑛
Rendemen subfraksi = 𝑥 100%
𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝐾𝐶𝑉
0,91 𝑔𝑟𝑎𝑚
= 𝑥 100% = 48,3%
1,884 𝑔𝑟𝑎𝑚
 Pembahasan

• Penggunaan vakum  terdapat perbedaan tekanan dalam kolom

dengan diluar kolom  pemisahan berlangsung lebih cepat
• Adsorben dimasukkan ke dalam kolom  vakum
• Tujuan: menghilangkan udara yang terjerap. Udara yang
terjerap dapat menyebabkan laju elusi tidak merata pada KCV
 pemisahan kurang baik
 Pembahasan

• Elusi dilakukan secara bertahap: dimulai dari fase gerak yang

kurang polar hingga ke fase gerak yang paling polar.
• Jika elusi dimulai dari fase gerak polar, maka semua senyawa
polar akan terelusi sehingga tidak ada atau sedikit senyawa yang
akan terpisahkan oleh fase gerak semipolar  pemisahan
kurang baik
 PEMANTAUAN SUBFRAKSI

Metode Kromatografi Lapis Tipis Analitik

• Fasa diam : silika gel GF254
• Fasa gerak : etil asetat : asam format : asam asetat : air
(100:11:11:26)
 Menggunakan pembanding asam klorogenat
 HASIL

6 20 19 5 4 p

Plat KLT dibawah Plat KLT dibawah Plat KLT dengan Plat KLT dengan
UV 254 nm UV 366 nm penampak bercak penampak bercak
FeCl3 H2SO4
 𝑱𝒂𝒓𝒂𝒌 𝒎𝒊𝒈𝒓𝒂𝒔𝒊 𝒔𝒆𝒏𝒚𝒂𝒘𝒂
Rf =
𝑱𝒂𝒓𝒂𝒌 𝒆𝒍𝒖𝒔𝒊 𝒇𝒂𝒔𝒆 𝒈𝒆𝒓𝒂𝒌

𝟏,𝟓 𝒄𝒎
Rf = = 𝟎, 𝟐𝟕𝟑
𝟓,𝟓 𝒄𝒎
 Pembahasan
• Subfraksi 4,5,6,19,dan 20 memiliki bercak yang sejajar dengan
asam klorogenat pembanding.
• Subfraksi 4,5  terdapat bercak lain yang tidak sejajar dengan
asam klorogenat pembanding. Bercak lain diduga merupakan
senyawa pengotor
• Subfraksi 19, 20  memberi satu bercak yang sejajar dengan
asam klorogenat pembanding
Oleh karena itu, subfraksi 19 dan 20 dilanjutkan dengan
pemurnian.
PEMURNIAN DAN UJI KEMURNIAN
 PEMURNIAN

• Metode KLT preparatif

• Larutan pengembang 
Campuran etil asetat : asam asetat : asam format : air
(100 : 11 : 11 : 26)
 Prosedur
Kertas saring Subfraksi dilarutkan
Larutan pengembang dimasukkan ke dalam metanol dan
dimasukkan ke dalam dalam bejana dibuat dalam bentuk
bejana untuk penjenuhan pita pada plat silikia
chamber gel GF254

Pembanding Bercak diamati di •Bagian pita sejajar

ditotolkan pada bawah sinar UV dengan pembanding
sisi kiri dan kanan pada 254 dan 366 dikerok dan dilarutkan
plat nm dalam metanol

•Larutan disaring dengan

kertas saring dan kapas bebas
lemak agar tidak terdapat
partikel silika gel dalam filtrat
 HASIL PEMURNIAN

Perhitungan % Rendemen
254 nm
Bobot subfraksi : 910 mg
Bobot isolat hasil pemurnian : 25,10 mg
% rendemen = 25,10 mg/910 mg × 100%
= 2,758%

Pemurnian

KLT preparatif silika gel GF254

Pengembang
etil asetat : asam asetat : asam format : air
366 nm (100 : 11 : 11 : 26)
 Uji Kemurnian

• KLT 2 Dimensi
• Fase gerak 1 
etil asetat : asam format : air (13 : 1 : 1)
• Fase gerak 2 
etil asetat : asam asetat : air (8 : 1 : 1)
 Prosedur

Sampel ditotolkan pada

Bejana dijenuhkan dengan
plat silika gel GF254 dan
fasa gerak 1
biarkan mengering

Plat dimasukkan ke dalam Plat diputar tegak lurus

bejana (posisi tinggi bercak Hasil KLT divisualisasi di dan pengerjaan diulangi
totolan harus lebih tinggi bawah sinar UV 254 nm dengan fasa gerak yang
daripada fasa gerak) kedua
 Hasil Uji Kemurnian

Uji kemurnian Pengembang

KLT 2 dimensi Fase gerak 1  etil asetat : asam format : air (13 : 1 : 1)

Fase gerak 2  etil asetat : asam asetat : air (8 : 1 : 1)

KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI
 Prosedur
• Spektrofotometri UV-Vis

sampel isolat dan pembanding

Pengukuran absorbansi Pengukuran absorbansi
dilarutkan dalam metanol lalu
terhadap blanko (metanol) dilakukan pada rentang
dimasukkan ke dalam kuvet secara
dilakukan terlebih dahulu sinar UV (200-400 nm)
terpisah dan diukur absorbansinya

Proses karakterisasi dan identifikasi Jika panjang gelombang maksimum

dengan metode spektrofotometri UV-Vis sampel asam klorogenat dengan
berdasarkan pada penyerapan panjang standarnya sama maka sampel
gelombang maksimum oleh sampel yang tersebut mengandung asam
dibandingkan terhadap standar klorogenat
Hasil Karakterisasi dan Identifikasi

Sampel  λ = 324 nm, A = 1,8128

Pembanding  λ = 327 nm, A =
2,8443

Sumber: Dao, 1992

 Daftar Pustaka
• Guang Li, et al. 2011. Study on Extraction Technology for Chlorogenic Acid from Sweet Potato Leaves by
Orthogonal Design. Jurnal. Procedia Environmental Sciences 8 403 – 407
• Milind, Parla dan Monika. (2015). Sweet Potato As Super-Food. Int. J. Res. Ayurveda Pharm. 6(4), 557-562.
• Mu, Taihua, et. al. 2017. Sweet Potato Processing Technology. Academic Press, hal. 357–400.
• Naveed, et al. (2018). Chlorogenic acid (CGA): A pharmacological review and call for further research.
Biomedicine & Pharmacotherapy, 97, 67–74.
• Pamungkas, Diah Daru Asih, et. al. 2016. Alkaloid Fraction from Purple Sweet Potato (Ipomoea batatas var
Ayumurasaki) as α-Glukosidase Inhibitor. Acta Pharmaciae Indonesia, 4(1), 1–6.
• Park, Ji Su, et. al. 2015. Chlorogenic Acid Profiles and Antioxidant Potentials of 17 Sweet Potato Varieties
Cultivated in Korea: Impact of Extraction Condition and Classification by Hierarchical Clustering Analysis.
Journal of Food Chemistry & Nanotechnology, http://dx.doi.org/10.17756/jfcn.2015-001.
• San, Anua, et. al. 2014. Extraction, Characterization and Total Phenolic Content of Local (Malaysian) Green
Sweet Potato (Ipomoea batatas) Leaves. International Journal of Science Commerce and Humanities, 2(5),
175–180.
• Singh, Padda. 2001. PHENOLIC COMPOSITION AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF SWEETPOTATOES [IPOMOEA
BATATAS (L.) LAM]. Disertasi. India : Punjab Agricultural University