PERCOBAAN 4

ISOLASI KAFEIN

A. TUJUAN PRAKTIKUM
Setelah melakukan praktikum diharapkan praktikan dapat memahami prinsip dan
melakukan isolasi kafein beserta analisis kualitatif hasil isolasi dengan metode
kromatografi lapis tipis.

B. DASAR TEORI

Kafein merupakan metabolit sekunder golongan alkaloid yang terdapat secara alami
pada kopi, teh dan coklat. Selain terdapat secara alami, kafein juga sering ditambahkan
kedalam beberapa minuman berenergi serta beberapa obat-obatan. Kafein memiliki
nama lain kafein, tein, dan 1,3,7-trimethylxanthine. Kafein sangat larut didalam air panas,
larut sedikit didalam aseton dan air dingin serta sangat larut di dalam dietil eter. Ekastraksi
dan Isolasi kafein pertama sekali dilakukan tahun 1819 oleh kimiawan Jerman Feriedrich
Ferdinand Runge (Soraya, 2008).
Kopi mengandung alkaloid, salah satu cirinya adalah berasa pahit yang disebabkan
oleh kandungan caffeinnya. Kopi adalah minuman dengan kandungan kimia yang
komplek. Dalam satu cangkir kopi terdapat sekitar 800 senyawa aromatik (Taufik, 2008).
Penelitian-penelitian relevan mengenai isolasi dan identifikasi kadar kafein diantaranya
penelitian oleh Raharjo (2010) penentuan kadar kafein dalam kopi dengan cara
mengisolasi kafein, diperoleh kristal kafein sebanyak 2%.
Soraya (2008) Rendemen kafein sebanyak 1,9% diperoleh dari limbah Teh Hitam
CTC Jenis Powder diisolasi menggunkan ekstraksi bertahap menggunakan air dan pelarut
organik. Di zaman dahulu, genus Camellia dibedakan menjadi beberapa spesies teh yaitu
sinensis, assamica, irrawadiensis. Sejak tahun 1958 semua teh dikenal sebagai suatu
spesies tunggal Camellia sinensis dengan beberapa varietas khusus, yaitu sinensis,
assamica dan irrawadiensis.
Teh Hitam (Black Tea, Theae Nigra Folium, Schwarzer Tee) di dapat dari hasil
peragian daun muda Camellia sinensis (L). Teh berasal dari pegunungan sebelah tenggara
asia, sekarang dibudidayakan di hampir semua negara di daerah lintang utara antara 30
dan 40. Tergantung dari asalnya teh hasil fermentasi mengandung kafein 1-5%(min 2%
menurut Ph.Gall.8) disamping teobromina dan teofilina yang kandunganya sangat kecil.
Tanin dan hasil reaksi berwarna gelap (flobafena) dapat mencapai 25% (Stahl, 1985).

C. ALAT DAN BAHAN

Alat :
 - Waterbath
- Sperangkat reflux
- Alat gelas
o Beaker glass 500 dan 250 mL
o Gelas ukur 250 mL dan 50 mL
o Corong kaca
o Corong pisah
o Erlenmeyer 250 mL
o Pipet tetes
o Batang pengaduk
o Cawan porselen
- Timbangan analitik
- Flakon
- Kain flannel
- Statif dan ring
- Bunsen
- Kaki tiga dan kawat kasa
- Corong buchner dan filtering flash

Bahan :
– Serbuk kering biji kopi
– Serbuk kering daun teh
– Aquadest
– Kloroform
– Pb asetat
– Kertas saring

D. CARA KERJA
Isolasi Kafein
1. Sebanyak 20 – 50 gram serbuk di reflux dengan 350 mL aquades selama 30 menit,
kemudian saring dalam keadaan panas
2. Filtrat ditampung kemudian tetesi dengan Pb asetat setetes demi tetes sampai tidak
terjadi pengendapan sambal diaduk, setelah terjadi endapan larutan disaring dan
didinginkan.
3. Filtrat diekstraksi dengan 25 mL kloroform pada corong pisah dan digojog sampai
terbentuk 2 lapisan.
4. Lapisan II (fase kloroform) yang merupakan larutan caffein dalam kloroform
dikeluarkan dan ditampung dalam cawan penguap.
5. Lapisan I (fase air) pada corong pisah ditambahkan lagi 20 ml kloroform, digojog lagi
sampai terbentuk 2 lapisan. Fase kloroform dikeluarkan dan ditampung jadi satu
dalam cawan penguap.
6. Kloroform diuapkan sampai kering dalam cawan penguap diatas waterbath sampai
terbentuk kristal.
7. Setelah itu, caffein kasar dalam cawan uap disublimasi dengan api kecil dan ditutupi
corong kaca yang dibungkus dengan kertas saring berlubang-lubang.
8. Setelah 15 menit corong diangkat dan kristal caffein yang yang melekat pada kertas
saring diambil dan ditimbang.
Bobot kristal yang diperoleh
Rendemen = x 100%
Bobot simplisia yang digunakan

Analisis Kualitatif
Fase gerak : Kloroform : etanol (96:4)
Fase diam : Pelat silika gel GF 254
Sampel : sampel kafein 10% dalam CHCl3
Pembanding : standar kafein 10% dalam CHCl3
Deteksi : 1. Sinar UV 254 nm (bercak berwarna biru keunguan)
2. Pereasi Dragendrof (bercak berwarna jingga)
 PERCOBAAN 5
ISOLASI PIPERIN

A. TUJUAN PRAKTIKUM
Setelah melakukan praktikum diharapkan praktikan dapat memahami prinsip dan
melakukan isolasi piperin dari Fructus Piperis nigri atau Piperis albi beserta analisis
kualitatif hasil isolasi dengan metode kromatografi lapis tipis.

B. DASAR TEORI
Piperin terdapat dalam buah yang belum masak (lada hitam) dan dalam kulit buah
yang sudah masak (lada putih). Piper ningrum dan dalam buah Aschanti (Piperclussi).
Piperin juga terdapat dalam lada panjang (Piper longum) dan dalam biji Cubeba censii.
Piperin juga telah dapat diisolasi dari Piper famechuni dan Piper chaba.
Piperin merupakan senyawa amida basa lemah yang dapat membentuk garam
dengan asam mineral kuat. Piperin bila dihidrolisis dengan KOH-etanolik akan
menghasilkan kalium piperinat dan piperidin. Oleh karena itu pada proses isolasi,
pemberian KOH-etanolik tidak boleh berlebihan dan harus dalam keadaan tidak panas.
Tumbuhan yang termasuk jenis piper selain mengandung 5 – 9 % piperin juga
mengandung minyak atsiri berwarna kuning (berbau amis), senyawa berasa pedas
(kavisin), amilum, resin, protein. Senyawa amida (piperin) berupa kristal berbentuk jarum
berwarna kuning, tak berbau, tak berasa lama kelamaan pedas, larut dalam etanol, asam
cuka, benzen dan kloroform.
Prinsip pada isolasi piperin yaitu piperin disari dari buah piper dengan etanol 96%,
dipisahkan dari senyawa resin dengan penambahan KOH-etanolik 10% b/v. Kristalisasi
dilakukan dengan etanol.

C. ALAT DAN BAHAN

Alat :
Tahap I
– Perangkat penyari soxhlet
– Heating mantle
– Alat gelas
o Gelas ukur 10 dan 100 mL
o Pipet tetes
o Beaker glass 25 mL
o Erlenmeyer 100 mL
o Cawan porselen
o Spatula logam
 o Batang pengaduk
o Botol timbang
– Almari es
– Batu didih

Tahap II
– Oven
– Desikator
– Melting Point Apparatus
– UV kabinet
– Timbangan analitik
– Alat gelas
o Pipa kapiler
o Chamber
o Gelas ukur 10 mL
o Corong kaca
o Beaker glass 25 dan 50 mL
o Labu ukur 10 mL
o Vial
o Alat penyemprot reagen

Bahan :
- Serbuk buah Piperis nigri atau Piperis albi
- Etanol 96%
- KOH
- Etanol 70%
- Lempeng KLT (Silika gel GF254)
- Toluol
- Etil aetat
- Anisaldehid – asam sulfat
- Piperin pembanding
- Glass wool
- Kertas saring

D. CARA KERJA
Tahap I

1. Timbang 30,0 gram serbuk merica.

2. Masukkan kedalam alat penyari soxhlet yang telah dipasang kertas saring, kemudian
tambahkan etanol 96% paling sedikit sebanyak dua kali sirkulasi.
3. Jangan lupa untuk menambahkan batu didih
 4. Penyarian dilakukan selama 2 jam dengan kecepatan 6 – 8 sirkulasi per jam.
5. Setelah dingin, pisahkan sari dari bagian yang tidak terlarut dengan penyaringan
melalui kertas saring.
6. Sisihkan sari jernih yang didapatkan sebanyak 3 mL dalam flakon dan tutup.
7. Sisanya diuapkan diatas penangas air sampai kering atau konsistensi kental.
8. Kemudian tambahkan 10 mL KOH-etanolik 10% sambil diaduk – aduk sehingga timbul
endapan.
9. Setelah mengendap, pisahkan sari dari bagian yang tak larut melalui glass wool.
10. Sari jernih yang didapat didiamkan dalam almari es sampai hari praktikum yang akan
datang, atau sampai pembentukan kristal optimal.

Tahap II
1. Kristal yang timbul dipisahkan, dicuci dengan etanol 96% (dingin) dan dikeringkan
dalam almari pengering pada suhu 400C selama 30 – 45 menit kemudian disimpan
dalam desikator.
2. Hitung rendemen hasil percobaan

Bobot kristal yang terbentuk

Rendemen = x 100%
Bobot serbuk merica yang digunakan

3. Lakukan percobaan KLT terhadap larutan kristal dalam etanol dan sari hasil
penyeringan dengan soxhlet, dengan kondisi :
a. Fase gerak : Toluol : Etil asetat (70 : 30)
b. Fase diam : Silika gel GF254
c. Pembanding : Piperin standar
4. Amati warna bercak yang timbul pada kromatogram
a. Dalam sinar tampak
b. Dalam sinar UV 254 dan 366 nm
c. Setelah disemprot dengan pereaksi anisaldehi – asam sulfat dan dipanaskan 1100C
selama 10 menit
5. Hitung harga Rf bercak
6. Lakukan pengamatan organoleptik terhadap kristal yang didapat (bau, warna,
rasa)
7. Tentukan titik lebur kristal yang didapat
8. Serahkan kristal yang diperoleh kepada petugas laboratorium.
 PERCOBAAN 6
ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID

A. TUJUAN PRAKTIKUM
Setelah melakukan praktikum diharapkan praktikan dapat memahami dan dapat
melakukan isolasi glikosida flavonoid berikut analisis kualitatif golongan senyawa tersebut
dengan metode kromatografi lapis tipis.

B. DASAR TEORI
Flavonoid sebagai suatu senyawa fenolik dalam dunia tumbuhan dapat berbentuk
glikosida maupun aglikon dan dapat dideteksi dengan berbagai pereaksi dan
fluoresensinya dibawah sinar ultra violet. Pereaksi yang banyak digunakan adalah amonia
atau basa lain yang akan mempengaruhi gugus fenol yang bersifat asam dan memberikan
warna kuning. Selain itu pereaksi pembentuk kompleks juga banyak digunakan seperti
AlCl3 dan pereaksi sitroborat yang juga memberikan warna kuning. Isolasi flavonoid
tergantung dari polaritasnya dan hal ini menentukan pelarut yang digunakan.
Prinsip isolasi yang dilkaukan yaitu flavonoid didalam bahan yang diisolasi bersifat
polar sehingga dapat disari dengan air panas dan dikristalkan dengan pendinginan,
sedangkan pemisahan aglikon dari glikosidanya dapat dilakukan dengan hidrolisis asam.

C. ALAT DAN BAHAN

Alat :
Tahap I
– Panci infus
– Hot plate
– Almari es
– Vakum
– Alat gelas
o Corong Buncher dan filtering flash
o Erlenmeyer 250 mL
Tahap II
– Oven
– Timbangan analitik
– Penangas air
– Spatula logam
– UV kabinet
– Alat gelas
 o Pipet tetes
o Corong kaca
o Beaker glass 25 dan 250 mL
o Gelas ukur 5 dan 10 mL
o Rak dan Tabung reaksi
o Corong pisah 250 mL
o Cawan porselen
o Chamber (2)
o Alat penyemprot reagen (2)
o Labu ukur 10 mL (2)
o Vial (3)

Bahan :
- Daun Ketela Pohon (Manihot utilissima Pohl)
- Akuades
- Kertas saring
- Air es
- Metanol
- HCl 2N
- Kapas
- Dietil eter
- Natrium sulfat anhidrat
- Lempeng selulosa
- Asam asetat 15%
- Rutin standar
- Ammonia
- Pereaksi sitroborat
- N-butanol
- Asam asetat
- Larutan glukosa 1%
- Larutan ramnosa 1%
- Larutan kalium permanganat basa

D. CARA KERJA
Tahap I
1. Timbang 40 gram serbuk bahan, masukkan dalam panci infus dan tambahkan 240 mL
air
2. Didihkan selama 30 menit.
 3. Saring campuran melalui corong Buchner sehingga diperoleh filtrat yang jernih dan
dipindahkan kedalam erlenmeyer 250 mL yang bersih.
4. Simpan dalam almari es selama satu minggu sehingga terbentuk kristal amorf putih
kekuningan.
Tahap II
1. Tuangkan sebagian besar larutan jernih dengan hati – hati agar kristal tidak ikut
tertuang, kemudian saring kristal yang ada pada dasar erlenmeyer melalui kertas
saring yang telah ditara.
2. Jika masih ada kristal yang menempel pada dasar erlenmeyer bilas dengan air suling
dan tuangkan bilasan ke kertas saring.
3. Cuci kristal dengan 10 mL air es
4. Keringkan kertas saring bersama endapan pada suhu 50 0C, sampai kering kemudian
ditimbang untuk memperoleh rendemen dari hasil yang didapat.

Bobot kristal yang diperoleh

Rendemen = x 100%
Bobot simplisia yang digunakan

5. Ambil sedikit padatan dengan ujung spatel kecil, larutkan dalam 2 mL campuran
metanol – air sama banyak (Sari I)
6. Ambil sisa padatan masukan kedalam tabung reaksi dan tambahkan 10 mL HCl 2N.
7. Taruh corong kecil berisi kapas diatas tabung untuk mengurangi penguapan.
8. Lakukan refluks pada penangas air mendidih selama 1 jam.
9. Jika cairan dalam tabung terlalu banyak yang menguap, tambahkan 5 mL air suling
yang panas kedalamnya.
10. Tuangkan cairan hasil hidrolisis yang telah dingin dari tabung kedalam corong pisah.
Tambahkan 10 mL dietil eter, kocok hati – hati.
11. Pisahkan kedua lapisan terbentuk.
12. Kocok kembali lapisan air asamnya dengan 10 mL dietil eter yang baru dalam corong
pisah.
13. Pisahkan dan campur lapisan eternya dengan yang pertama.
14. Saring sari eter melalui kertas saring yang berisi satu gram natrium sulfat anhidrat
kedalam cawan porselen, uapkan eternya tanpa pemanasan dal larutkan residu yang
diperoleh dalam 2 mL metanol (Sari II).
15. Uapkan lapisan air asam hasil hidrolisis pada cawan porselen diatas penangas air
dengan hembusan angin sehingga cairan tinggal kira – kira 1 mL (Sari III)
16. Lakukan analisis kualitatif dengan kromatografi lapis tipis.

Analisis kualitatif I
a. Fase diam : selulosa
b. Fase gerak : asam asetat 15%
 c. Cuplikan : sari I : II : III dan pembanding larutan rutin dalam metanol 50% masing
– masing sebanyak 10 totolan
d. Deteksi : 1. Sinar UV 366 nm
2. Uap amonia, dibawah sinar tampak dan UV 366 nm
3. Pereaksi sitroborat, panaskan 1100C selama 5 menit, amati dibawah
UV 366 nm.
Setiap kali deteksi, tandai bercak flavonoid yang terlihat dengan sebuah titik
disebelah kanan atau kirinya. Catat harga Rf dan warna yang terbentuk.

Analisis kualitatif II
a. Fase diam : selulosa
b. Fase gerak : n-butanol : asam asetat : air = 4 : 1 : 5 v/v (lapisan atas)
c. Cuplikan : sari I, II, III dan pembanding : larutan glukosa dan ramnosa 1% masing
– masing 10 totolan kecuali sari III 30 totolan.
d. Deteksi : sinar UV 366 nm (untuk flavonoid) catat harga Rf dan fluoresensi,
kemudian uapi dengan amoniak, catat harga Rf yang berwarna kuning.
Semprot kromatogram dengan larutan kalium permanganat basa (untuk gula), catat
harga Rf dan warna yang terbentuk.
Bandingkan harga Rf dan warna yang terbentuk dengan data yang ada dalam pustaka
kemudian buatlah pembahasan terhadap cara ekstraksi, pemisahan dan hasil analisis yang
saudara peroleh sehingga dapat menjelaskan hasil praktikum.