LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA ISOLASI KAFEIN DARI DAUN TEH ( Camelia sinensis)

Disusun Oleh:
Andhika Hery I. Febry Puji Astutik Ferani Cendrianti Putri Wulandari Retno Yuliani A. Charolina Ayu W. Endah Syahriah A. Mayasari Kurnia N.D Ajendra Anjar K. : 092210101025 : 092210101042 : 092210101043 : 092210101050 : 092210101052 : 092210101053 : 092210101054 : 092210101055 : 092210101056

BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2011

1. TUJUAN Mahasiswa mengetahui langkah-langkah isolasi, mampu melakukan isolasi kafein dari daun the dan mengidentifikasi isolat yang diperoleh. 2. DASAR TEORI Keanekaan dan jumlah struktur molekul yang dihasikan oleh tumbuhan banyak sekali, demikian juga laju kemajuan pengetahuan tentang hal itu saat ini. Maka masalah utama dalam penelitian fitokimia ialah menyusun data yang ada mengenai setiap golongan senyawa khusus. Untuk analisis fitokimia, harus digunakan jaringan tumbuhan segar. Alur pencarian bahan aktif tumbuhan:

Analisis fitokimia menggunakan jaringan tumbuhan yang segar. Kemudian bahan harus dikeringkan secepat-cepatnya, tanpa menggunakan suhu tinggi, lebih baik dengan aliran udara yang baik. Setelah betul-betul kering, tumbuhan dapat disimpan untuk jangka waktu lama sebelum digunakan untuk analisis pada tahap ini pencemaran tumbuhan yang telah diteliti, oleh tumbuhan lain, harus diperhatikan kita harus menggunakan tumbuhan yang tidak tercemar atau tidak berpenyakit, yaitu yang tidak dijangkiti oleh infeksi virus, bakteri, atau jamur. Bukan saja

hasil sintesis mikroba yang mungkin terdeteksi, tetapi infeksipun mungkin mengubah metabolisme tumbuhan secara serius dan membentuk hasil yang tidk di harapkan. Pencemaran dapat terjadi sewaktu mengumpulkan tumbuhan rendah, bila jamur yang tumbuh secara parasit pada pohon yang dikumpulkan, harus diperhatikan agar jaringan pohon terpisah dari cuplikan. Pada beberapa kasus yang lain , lumut sering tumbuh bersekutu erat dengan tumbuhan tinggi dalam cemaran. Oleh karena itu identitas bahan harus tidak dapat diragukan lagi atau harus ada kemungkinan bagi seorang ahli taksonomi untuk menentukan identitasnya. Karena alasan itu sekarang sudah menjadi kebiasaan umum pada penelitian fitokimia untuk menyimpan contoh bukti tumbuhan yang diperiksa di herbarium yang dikenal, sehingga bila diperlukan dapat diajukan kembali. Ragam ekstraksi bergantung pada tekstur dan kandungan air bahan yang diekstraksi dan pada jenis senyawa yang diisolasi. Umumnya kita perlu membunuh jaringan tumbuhan untuk mencegah terjadinya oksidasi enzim atau hidrolisis. Alkohol, merupakan pelarut serba guna yang baik untuk ekstraksi pendahulu. Selanjutnya, bahan dapat dimaserasi lalu disaring. Bila mengisolasi senyawa dari jaringan hijau, keberhasilan ekstraksi dengan alkohol berkaitan langsung dengan seberapa jauh klorofil tertarik oleh pelarut itu. Bila ampas jaringan, pada ekstraksi ulang sama sekali tidak berwarna hiujau dianggap bahwa semua senyawa berbobot moekul rendah telah terekstraksi.

2.1 Isolasi: Isolasi adalah sebuah proses pemisahan dimana menghasilkan suatu senyawa yang murni yang disebut dengan isolat. Pada praktikum ini teknik isolasi yang digunakan adalah kristalisasi. Prinsipnya adalah komponen yang kita inginkan dapat dikristalkan sedang pengotor lainnya tidak mengkristal. Pemisahan ini berdasarkan pada perbedaan kelarutan. Cara ini cukup sederhana dilakukan dengan cara melarutkan campuran komponen pada pelarut yang sesuai kemudian didinginkan hingga terbentuk kristal, kristal kemudian dipisahkan dari campuran tersebut.

2.2 Identifikasi: Tehnik pemisahan kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan dipisahkan. Pada praktikum kali ini, identifikasi yang dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). KLT digunakan terutama untuk kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam lipid, yaitu: steroid, karotenoid, kuinon sewderhana, klorofil Bila KLT dibandingkan dengan KKt, kelebihan khas KLT ialah: 1. Keserbangunan disebabkan oleh kenyataan bahwa di samping selulosa, sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada plat kaca atau penyangga yang lain dan digunakan untuk kromatografi. 2. Kecepatan KLT lebih besar, disebabkan karena sifat penjerap yang lebih padat bila disaputkan pada plat dan merupakan keuntungan bila kita menelaah senyawa yang labil. 3. Kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila diperlukan dapat dipisahkan bahan yang jumlahnya lebih sedikit dari ukuran g.

3. ALAT 1. Beaker glass 2. Corong gelas 3. Kertas saring 4. Lemari es 5. Tabung + Rak tabung reaksi 6. Spatel kecil 7. Rutavapour 8. Cawan porselen kecil 9. Corong gelas 10. Silika Gel GF 254 11. Uv-254 12. Pinset 13. Corong pisah 14. Lampu spritus

4. BAHAN 1. Simplisa Camelia sinensis 2. Air 240 mL 3. Natrium Karbonat 4. Larutan Asam Sulfat 10% 5. Kloroform 6. Air panas

5. CARA KERJA a. Isolasi Kafein dari daun Teh

100ml aquadest dalam beaker glass 500ml + 5ml Na karbonat

Masukkan 10 kantong teh,panaskan 20 menit diatas hot plate, bila air berkurang tambah air

Filtrat dibiarkan dingin, + asam sulfat 10% hingga Ph netral

Filtrat netral dimasukkan ke dalam corong pisah + kloroform sama banyak (2 x 100 ml)

Kocok, diamkan hingga diperoleh 2 fase

Fase kloroform dikumpulkan, fase air + kloroform sama banyak (ulangi langkah)

Fase kloroform total dikumpulkan, diuapkan demgan Rutavapour hingga V = 10 ml

Hasil Rutavapour + air panas 1ml

Simpan dalm lemari es sampai terbentuk kristal kafein ( 1minggu)

b. Pemurnian ( Cara Sublimasi) Sumbat corong gelas dengan kapas basah

Lapisi bagian dalam dengan kertas saring berbentuk kerucut

Masukkan kafein ke cawan porselen kecil

Tutup dengan kertas saring yang diberi lubang

Tutup cawan denagn corong gelas secara terbalik

Panaskan cawan diatas bunsen dengan api kecil selam 10 menit

Dinginkan selama 15 menit pada suhu ruang

Buka corong, kristal kafein berbentuk jarum menempel dibawah kertas saring dalam cawan

Timbang hasil

Identifikasi dengan KLT

c. Uji KLT Ekstrak dilarutkan dalm kloroform, ditotolkan pada lempeng KLT

Fase diam Fase gerak Cuplikan Deteksi

: Silika Gel Gf-254 : CHCl3 : Etanol (9,5 : 0,5) : Larutan sampel dan pembanding larutan kafein dalam metanol : UV-254

6. HASIL PENGAMATAN Isolasi Kafein dari daun Teh ( Camelia sinensis) Setelah dilakukan isolasi selama 1 minggu, diperoleh gumpalan seperti minyak simplisia. Gumpalan minyak tersebut dimasuukan ke cawan untuk dipanaskan agar memperoleh kristal simplisia yang diinginkan selama 10-15 menit. Kristal yang dihasilkan kemudian dilarutkan dengan larutan standart kefein. Lalu dilakukan identifikasi dengan mengunakan kromatografi lapis tipis (KLT). a. b. c. d. Fase diam: Silika gel GF 254 Fase gerak: CHCl3 : Etanol ( 9,5 : 0,5) Cuplikan: larutan sampel dan pembanding larutan kafein dalam metanol Deteksi: UV254

Penotolan dilakukan 2 larutan yaitu: larutan standart dan larutan sampel. Hasil yang diperoleh dari kromatografi lapis tipis adalah positif, terdapat bercak/ noda pada lempeng KLT denagn jarak noda antara standart dan sampel berbanding sedikit.

Lempeng KLT :

Keterangan : a. Sampel
5cm 5,3 cm

b. Standart

 Nilai Rf : 1. Sampel = 5cm 8cm = 0,625 2. Standart = 5,3 cm 8 cm = 0,6625 Berat awal kertas saring Kertas + Kristal Kristal Kristal yang ada di cawan Kristal : 0,27 gram : 0,31 gram : 0,049 gram : 0,029 gram : 0,06 gram = 60 mg

% rendemen

60 mg 20.000 mg

100 %

= 0,3 %

7. PEMBAHASAN Pada praktikum kali ini kami melakukan isolasi kafein dari daun teh (Camelia sinensis) Isolasi yang kami lakukan ini menggunakan teknik isolasi langsung. Teknik isolasi langsung adalah teksnik isolasi yang langsung memisahkan senyawa tujuan dari ekstrak. Teknik ini tidak melalui tahapan fraksinasi. Isolasi kafein dari simplisia Camelia sinensis menggunakan teknik isolasi langsung karena senyawa tujuan isolasi (kafein) memiliki jumlah cukup banyak dan dapat membentuk kristal sehingga mudah dipisahkan dari pengotornya. Jadi kafein akan diisolasi dalam bentuk kristal. Pemisahan ini berdasarkan pada perbedaan kelarutan. Cara ini cukup sederhana dilakukan dengan cara melarutkan campuran komponen pada pelarut yang sesuai kemudian didinginkan hingga terbentuk kristal, kristal kemudian dipisahkan dari campuran tersebut. Simplisia yang digunakan sudah dalam bentuk kantong the sehingga memudahkan proses ekstraksi (tidak melakukan penyaringan). 10 kantong the diamsukkan dalam larutan Natrium Karbonat (5 g dalam 100 ml aquadest), kemudian dipanaskan selama 20 menit dan dibiarkan dingin. Filtrat diberi asam sulfat 10% hingga netral, pada proses pemanasan perlu diperhatikan apakah volume ekstrak berkurang atau tidak. Jika volume ekstrak berkurang maka perlu ditambahkan aquadest. Filtrat netral dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian ditambahkan kloroform sama banyak (100 ml). Corong pisah dikocok kemudian didiamkan (digantung pada statif) hingga terjadi pemisahan. Setelah didiamkan akan terbentuk 3 fase pemisahan (atas, tengah, bawah). Fase atas adalah fase air, fase tengah adalah fase kloroform yang hanya mengandung sedikit zat, sedangkan fase bawah adalah fase kloroform dimana zat tujuan isolasi (kafein) larut di dalamnya. Prinsip dasar pemisahan kafein menggunakan kloroform dan air ini adalah sifat kepolaran kafein dan koefisien partisi kafein dalam air dan kloroform. Kafein merupakan senyawa non polar sehingga akan larut dalam kloroform yang juga bersifat nonm polar. Pada saat ekstrak (yang dilarutkan dalam air) digojok bersama kloroform, kafein bersama zat-zat non polar lainnya akan banyak larut dalam kloroform. Fase kloroform ditampung dalam beaker glass. Sedangkan fase tengah dan atas (fase air) ditambah kloroform lagi dan diulangi proses pemisahannya. Fase kloroform total diuapkan menggunakan rotavapour hingga volume 10 ml. Fungsi penguapan dengan rotavapour ini adalah untuk menghilangkan kloroform dan

untuk meningkatkan konsentrasi filtrat. Filtrat kemudian ditambah 1 ml aquadest panas untuk memancing pembentukan kristal kafein. Filtrat disimpan dalam lemari pendingin sampai terbentuk Kristal ( 1 minggu). Kristal yang terbentuk setelah proses pendinginan adalah kristal kafein, tetapi kristal ini belum murni dari pengotor. Oleh karena itu perlu dilakukan proses pemurnian. Proses pemurnian dapat dilakukan dengan berbagai macam metode, antara lain: Rekristalisasi : - sublimasi

- melarutkan dalam pelarut yang cocok lalu di kristalkan kembali - disaring panas menggunakan norit kemudian dikristalkan kembali Kromatografi (KLT preparatif) Filtrasi Destilasi

Pemilihan metode didasarkan pada sifat zat yang akan dimurnikan. Kafein dapat membentuk kristal dan mudah menyublim. Karena itu dipilih pemurnina zat rekristalisasi metode sublimasi. Sublimasi merupakan metode pemisahan campuran dengan menguapkan zat padat tanpa melalui fasa cair terlebih dahulu sehingga kotoran yang tidak menyublim akan tertinggal. Setelah dilakukan sublimasi akan didapatkan kristal kafein berbentuk jarum yang diharapkan bersih dari pengotor. Kristal dikumpulkan kemudian ditimbang. Berat kristal adalah 60 mg. Kristal ini didapat dari sampel simplisia Camelia sinensis sebanyak 20 g sehingga diperoleh rendemen sebesar 0,3%. The memiliki kandungan kafein antara 25-28 mg/g, berarti nilai rendemennya adalah 2,8%. Kesalahan-kesalahan yang mungkin terjadi sehingga menyebabkan rendemen yang didapat terlalu sedikit adalah: 1. wadah lain. 2. 3. wadah lain. Setelah proses isolasi dilakukan proses identifikasi yaitu analisis kualitatif golongan senyawa kafein dengan metode KLT. Kristal hasil isolasi diambil sedikit dengan ujung spatel kecil, dilarutkan dalam kloroform hingga tepat larut. Penambahan kloroform sebagai pelarut dilakukan sesedikit mungkin (tepat larut) agar konsentrasi sampel yang akan dianalisis tidak Hilangnya masa ekstrak saat ekstraksi air-kloroform. Hilangnya masa kristal saat pemindahan kristal dari satu wadah ke Hilangnya masa ekstrak karena pemindahan ekstrak dari satu wadah ke

terlalu kecil. Sampel lalu dianalisis secara kualitatif dengan metode kromatografi lapis tipis pada kondisi sebagai berikut: Fase diam Fase gerak Cuplikan Deteksi : Silika Gel GF 254 : CHCL3 : Etanol (9,5 : 0,5) : Larutan sampel dan pembanding larutan kafein dalam metanol : UV 254 nm

Lempeng yang telah tereluasi dikeringkan dengan cara dianginkan. Lempeng kemudian didieteksi nodanya di bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm. Tampak noda sampel dan standar. Noda yang terlihat diberi tanda menggunakan pensil. Noda sampel dan standar dihitung harga Rf nya. Nilai Rf sampel adalah 0,625, dan Rf standar adalah 0,6625. Nilai Rf berbeda tetapi masih bisa dikatakan bahwa sampel kemungkinan adalah zat yang sama dengan standar yaitu kafein.

KESIMPULAN 1. Proses isolasi kafein dari simplisia daun the (Camelia sinensis) dilakukan dengan teknik kristalisasi. 2. Prinsip dari kristalisasi adalah komponen yang kita inginkan dapat dikristalkan sedang pengotor lainnya tidak mengkristal. Pemisahan ini berdasarkan pada perbedaan kelarutan. 3. Pemurnian dilakukan dengan cara rekristalisasi metode sublimasi karena kafein mudah menyublim. 4. Rendemen yang didapatkan sangat sedikit yaitu 0,3% dibandingkan dengan standar yaitu 2,52,8%. 5. Uji KLT menunjukkan zat hasil isolasi kemungkinan adalah kafein.

LAMPIRAN : 1. Hasil gumpalan minyak yang diperoleh selama 1 minggu

Gumpalan minyak

2. dipanaskan

Kristal yang didapat setelah

Kristal di cawan porselen

3. Hasil pemisahan KLT

Standart : 5,3 cm

Sampel : 5cm

DAFTAR PUSTAKA

Harborne, J.B. 1994. Metode Fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. Bandung: Penerbit ITB Anonim. 1977. Materia Medika Indonesia. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Khokar, S. dan Magnusdottir, G. M. Tanpa tahun. Total Phenol, Catechin, and Caffeine Contents of Teas Commonly Consumed in the United Kingdom. Leeds: Procter Department of Food Sciences.