LAPORAN RESMI PRAKTIKUM FITOKIMIA

ISOLASI KAFEIN DARI DAUN TEH HIJAU (C amelli a sine

si nensi
nsiss)

DENGAN METODE REFLUKS DAN IDENTIFIKASI DENGAN

METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

Disusun Oleh :
 Nama : Cicillia Dian 16.0564

Riska Putri S 16.0558

Hari/Tanggal : Kamis, 4 Mei 2018

Dosen Pembimbing : Margareta Retno P, M.Sc., Apt

LABORATORIUM FITOKIMIA LANJUTAN

AKADEMI FARMASI THERESIANA

SEMARANG

2018
 LAPORAN RESMI PRAKTIKUM FITOKIMIA
ISOLASI KAFEIN DARI DAUN TEH HIJAU (Camelli a sinensis)
DENGAN METODE REFLUKS DAN IDENTIFIKASI DENGAN
METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

I. TUJUAN
1. Mahasiswa mampu memahami prinsip dan mengisolasi senyawa
kafein dari daun teh hijau (Camellia sinensis) dengan metode refluks.
2. Mahasiswa mampu melakukan evaluasi kafein dari teh hijau (Camellia
 sinensis) dengan uji organoleptis meliputi bentuk, warna, rasa dan
menghitung rendemen hasil senyawa kafein dari ekstraksi teh hija u
3. Mahasiswa mampu melakukan identifikasi kafein dari teh hijau
(Camellia sinensis) dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
dengan menghitung nilai retardasi solut (Rf)

II. PRINSIP
a. Ekstraksi
Prinsip kerja refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperature
titik didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang
relative konstan dengan adanya pendingin balik.
 b. Pemisahan
Prinsip pemisahan corong pisah yaitu memisahkan senyawa tertentu
dalam sampel berdasarkan kelarutan dalam pelarut tertentu yang
memiliki perbedaan bobot jenis.
c. Mikrosublimasi
Pemisahan zat dari simplisia nabati yang dilakukan pada zat-zat yang
mudah menguap. Penguapan zat-zat hingga menguap lalu dikristalkan
dalam permukaan yang diinginkan sehingga zat-zat yang dapat
menyublim akan membentuk kristal.
 d. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip absorbsi dan partisi,
yaitu ditentukan oleh fase diam (adsorbsi) dan fase gerak (eluen).
Komponen kimia bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya
serap absorben terhadap komponen-komponen kimia tidak sama
sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang
 berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya.

III. TINJAUAN PUSTAKA

Teh digunakan sebagai obat luar untuk beberapa penyakit, seperti
 penyembuhan luka atau mencegah penyakit kulit dan penyakit kaki karena kutu
air (Dewi, 2008).  Kandungan dalam teh beraneka ragam antara lain kafein,
teofilin, vitamin K, vitamin C, vitamin A, vitamin B (B1, B2, B6), K, Na,
Mn, Cu, F, flavonoid, dan tannin. Kadar kafein dalam daun teh sekitar 2%
(Nersyanti, 2006). Kafein adalah sejenis senyawa alkaloid yang termasuk
golongan metilxantine (1,3,7-trimethylxantine). Kristal kafein dalam air
 berupa jarum-jarum bercahaya. Bila tidak mengandung air, kafein meleleh
 pada suhu 234°C  –   239°C dan menyublim pada suhu yang lebih rendah.
Kafein mudah larut dalam air panas dan kloroform, tetapi sedikit larut dalam
air dingin dan alkohol (Abraham, 2010).
Kafein dapat di isolasi dengan metoda refluks. Refluks adalah ekstraksi
dengan pelarut pada temperatur dan titik didihnya selama waktu tertentu dan
 jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali
sehingga proses ekstraksi sempurna (Voight,1971). Untuk tujuan ini, pelarut
yang sesuai adalah kloroform, diklorometana, etil asetat, karbondioksida
super kritik, dan lain-lain. Diklorometana digunakan untuk dekafeinasi bagian
yang besar dari teh konvensional. Pelarut ini juga relatif tidak toksik dan
sering digantikan dengan kloroform. Etil asetat juga menarik kafein dari daun
teh secara efektif, juga dapat mengekstrak komponen kimia lain dengan baik.
Studi pada teh hijau dengan dekafeinasi menggunakan etil asetat telah
menunjukkan potensi di atas 30% dari epigalokatekin galat (dianggap sebagai
komponen yang sangat bermanfaat dalam teh hijau) dan lainnya bermanfaat
sebagai komponen yang bersifat antioksidan yang diekstrak bersama kafein
(Atomssa dan Gholap, 2011).
Kafein merupakan alkaloid yang banyak ditemukan pada daun teh, biji
kopi dan biji coklat. Kebanyakan alkaloid yang telah diisolasi berupa padatan
kristal dengan titik lebur tertentu atau mempunyai kisaran dekomposisi.
Sedikit alkaloid berbentuk amorf dan beberapa seperti nikotin dan koiini
 berupa cairan. Kebanyakan alkaloid tidak berwarna, tetapi beberapa senyawa
yang kompleks,spesies aromatis, berwarna contoh berberin berwarna kuning
dan betanin merah (Pranata,1997)
Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas
komponen-komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-
masing komponen di antara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak.
Perbedaan kecepatan perpindahan tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan
kemampuan masing-masing komponen untuk diserap (adsorpsi) atau
 perbedaan distribusi di antara dua fasa yang tidak bercampur (partisi). (Tim
Dosen Kimia Organik, 2012). Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pada dasarnya
sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara melakukannya.
Perbedaan nyata terlihat pada media pemisahnya, yakni diguankannya lapisan
tipis adsorben halus yang tersangga pada papan kaca, aluminium atau plastik
sebagai pengganti kertas. Lapisan tipis adsorben ini pada proses pemisahan
 berlaku sebagai fasa diam (Soebagio, 2000).
IV. ALAT DAN BAHAN
ALAT BAHAN

Labu alas bulat leher satu Teh hijau (Camellia sinensis)

Pendingin bola Baku sekunder kafein

Corong pisah Aquadest

Klem dan statif Kloroform

Batu didih Larutan Pb Asetat

Gelas ukur Etil Asetat

Cawan penguap Metanol

Batang pengaduk Vaselin

Beaker glass Iodium kalium iodida-asam

klorida
Lampu spiritus Plat KLT

Pipet Kertas saring

Bejana KLT Kapas

Silica Gel GF 254 Kain katun

 Neraca analitik

Erlenmeyer

Lampu UV 254 nm

Corong kaca

Kaca arloji
V. CARA KERJA
1. Proses Isolasi senyawa kafein dari daun teh
Dirangkai rangkaian alat refluks terlebih dahulu

Ditimbang 40 g daun teh hijau

Dimasukkan ke dalam labu alas bulat 250 ml

Ditambahkan aquadest 200 ml dan batu didih

Dilakukan refluks selama 25 menit diatas lampu siritus

Disaring cairan teh tersebut (dalam keadaan panas) dengan menggunakan

kain katun

Dituangkan filtrat kedalam bekerglass dan diberi larutan Pb Asetat tetes

demi tetes ± 25 ml sampai filtrat tidak terbentuk endapan

Disaring campuran tersebut dengan corong betingkat yang telah diberi

kertas saring diatasnya, hingga benar-benar jernih

Diimasukan filtrat hasil penyaringan ke dalam corong pisah

Ditambahkan dengan kloroform 25 ml

Digojog sampai terjadi pemisahan

Ditampung lapisan bawah Dilakukan ekstraksi sekali lagi

(hasil ekstraksi kafein ) dengan menggunakan corong
lapisan I pisah
 Ditambahkan kloroform 20 ml
lapisan II

Disatukan lapisan I dan II, pelarut kloroform dipisahkan dengan cara destil asi
sederhana hingga pada labu alas bulat larutan terse but tinggal lebih kurang 5 ml

Sisa hasil destilasi dituang ke dalam cawan peguap, kemudian dengan api
kecil dipanaskan hingga hampir kering

2. Pemurnian kafein dengan cara mikrosublimasi

Dimasukan kafein dengan pengotor (kafein yang belum jernih) ke
dalam cawan penguap

Ditutup dengan kertas saring yang dilubangi

Diatas kertas saring diletakkan corong kaca yang pada bagian

lubangnya ditutup dengan kapas basah
Panaskan dengan nyala api kecil

Dibuka corong tersebut

Diamati apakah kristal kafein sudah terbentuk

Dihitung rendemen kafein dengan rumus


R= x 100%

3. Identifikasi Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Disiapkan lempeng KLT, dipanaskan dalam oven selama 5 menit dengan
suhu 105°C

Disiapkan eluen dalam bejana KLT, dilakukan penjenuhan

Disiapkan fase diam

Ditotolkan sampel pada lempeng KLT

Dimasukkan ke dalam bejana KLT yang sudah jenuh

Diamat kenaikan bercak, setelah proses berakhir, dikeringkan, kemudin

diamati di bawah sinar UV 254 nm

Disemprotkan penampang bercak (Iodium kalium iodida-asam klorida)

Dipanaskan dalam oven selama 5 menit dan amati warna noda pada
lempeng KLT

Hitung Rf bandingkan dengan baku primer

4. Pengamatan Organoleptis
Diamati bentuk dan warna kafein

Dicium bau dari kafein

Diambil sedikit sampel kafein dan dicicipi rasanya

VI. GAMBAR RANGKAIAN ALAT
VII. HASIL EVALUASI

1. Organoleptis
a. Bentuk : Serbuk kristal
 b. Warna : Putih
c. Bau : khas teh hijau
d. Rasa : pahit

2. Rendemen
 No. Keterangan Jumlah Perhitungan
1. Berat teh hijau 40 g (A)

2. Berat vial kosong 12,2643 g R =  x 100%

3 Berat vial kosong + kristal 12,2784 g 0,0141
R=  x100%
40 
kafein
R = 0,0353 % b/b
4 Berat kafein 0,0141 g (B)

3. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Eluen ( untuk 10 ml)
Etil asetat : methanol : air ( 100:13,5:10)
Etil asetat = 100/123,5 x 10 ml = 8,1 ml
Metanol = 13,5/123,5 x 10 ml = 1,1 ml
Aquadest = 10/123,5 x 10 ml = 0,8 ml
Baku pembanding = baku kafein
 No Keterangan Panjang Warna Noda Pada Sinar Perhitungan
UV 254 nm
 Noda
Sebelum Sesudah
disemprot disemprot
 penampang  penampang
 bercak  bercak
5,2
1 Kafein 5,2 cm Ungu Ungu Rf =  = 0,65 cm
8

HRf = 0,65 x 100

= 65
5
2 Baku 5 cm Ungu Ungu Rf =  = 0,63 cm
8
Pembanding HRf = 0,63 x 100
= 63

4. Uji mikroskopik
VII. PEMBAHASAN
Isolasi senyawa kafein dari daun teh hijau ini dilakukan dengan metode
reflux, yaitu metode ekstraksi dengan pelarut pada temperature titik didihnya
selama waktu tertentu sehingga terjadi ekstraksi kontinu dan jumlah pelarut
terbatas yang relative konstan dengan adanya pendingin balik. Metode refluks
ini digunakan untuk mengisolasi kafein dari daun teh karena sifat kafein tahan
terhadap adanya pemanasan (titik didih kafein 234°C) serta tekstur bahan
yang kasar.
Prosedur kerja dengan menyiapkan alat reflux, masukan daun teh hijau
kering dan tambahkan air sebanyak 200 ml. Air dipilih sebagai pelarut dalam
 proses isolasi kafein karena melihat sifat kafein yang larut dalam air panas.
Proses refluks ini dilakukan selama 25 menit dihitung sejak tetesan pertama
 proses kondensasi, adanya pendidihan untuk membuka pori-pori pada daun
teh sehingga kafein yang ada dalam daun teh dapat ditarik keluar dan dapat
larut dalam air panas tersebut. Setelah proses refluks berakhir dilakukan
 proses penyaringan yang akan memisahkan sari teh dengan ampasnya. Proses
 penyaringan ini dilakukan dalam keadaan panas karena si fat kafein yang larut
dalam air panas karena apabila penyaringan dilakukan pada keadaan dingin
maka kafein akan mengendap sehingga dapat tertinggal pada kain katun. Kain
katun dipilih sebagai penyaring, karena pori-pori kain katun kecil sehingga
akan memaksimalkan penyaringan tersebut.
Hasil filtrat yang didapat kemudian diendapkan dengan menambahkan
Pb Asetat yng berfungsi untuk mengendapkan senyawa kotoran atau senyawa
lain yang ada pada the contohnya tannin dan zat pengotor lainnya. Pemberian
Pb Asetat perlu diperhatiksn sebaiknya dilakukan tetes demi tetes agar
memudahkan dalam mengamati apakah masih terbentuk endapan atau tidak.
Selanjutnya campuran tersebut disaring menggunakan corong kaca bertingkat
yang telah dilapisi kertas saring sebagai pengganti corong buchner, filtrat
yang didapatkan harus jernih dan tidak terbentuk endapan. Setelah
mendapatkan filtrat yang jernih dimasukan kedalam corong pisah dan
tambahkan kloroform sebanyak 25 ml pertama dan 20 ml pada penambahan
kedua dengan tujuan mengikat kafein dari larutan agar kafein benar-benar
terpisah dari zat-zat lain dalam larutan. Kafein terikat dengan kloroform yang
mana kloroform adalah zat non polar yang dapat terikat oleh zat non polar
yaitu kafein sendiri. Penambahan kloroform akan menyebabkan terbentuknya
dua lapisan pada corong pisah yang diakibatkan karena kloroform berat
 jenisnya lebih besar daripada air sehingga lapisan atas merupakan fase air,
sedangkan lapisan bawah merupakan fase kloroform yang bercampur dengan
kafein. Digunakan kloroform karena kelarutan kafein yang lebih mudah larut
dalam kloroform dibandingkan dengan air serta sifat kloroform yang lebih
mudah menguap sehingga dalam proses penguapan selanjutnya untuk
memperoleh ekstrak kental kafein, kloroform dapat mudah diuapkan guna
 proses mikrosublimasi selanjutnya.
Prinsip mikrosublimasi adalah perubahan wujud zat dari padat ke gas
atau dari gas ke padat. Mikrosublimasi dilakukan dengan tujuan agar
didapatkan kafein dalam bentuk murni. Kafein yang terkandung dalam
ekstrak kental tersebut akan menguap yang membasahi kertas saring dengan
adanya pemanasan dan berubah menjadi uap yang akan menembus celah-
celah yang ada pada kertas saring, kemudia uap tersebut akan berubah
menjadi bentuk padatan kristal dengan adanya pendingin oleh kapas basah
yang ada pada corong kaca. Kristal yang di dapat tersebut akan menempel
 pada kertas saring. Proses mikrosublimasi ini menghasilkan kristal kafein
yang berbentuk kristal jarum, bau khas teh, dan berwarna putih.
Kristal kafein yang didapatkan selanjutnya diidentifikasi menggunakan
metode Kromatografi Lapis Tipis. Kromatografi lapis tipis merupakan salah
satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan
memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran.
Pada proses KLT digunakan dua jenis fase yaitu fase diam dan fase gerak.
Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254 nm. Sedangkan fase
gerak adalah media angkut yang terdiri dari suatu atau beberapa pelarut,
 bergerak di dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Fase gerak yang
digunakan (Etil Asetat : Metanol : Aquadest = 100 : 13,5 : 10).
Langkah pertama yang dilakukan yaitu penjenuhan eluen dengan cara
mencelupkan ujung kertas saring dalam chamber dan ditutup. Tujuan
 penjenuhan ini adalah untuk mempercepat proses eluasi. Tujuan penutupan
chamber adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam chamber
terjenuhkan oleh uap pelarut. Langkah kedua diaktifkan lempeng KLT dalam
oven selama 5-10 menit pada suhu 105 oC. Tujuan pengaktifan lempeng KLT
untuk menghilangkan tapak-tapak air yang terserap pada lempeng KLT
tersebut yang dapat mengganggu proses migrasi dari sampel dan baku
 pembanding dengan eluen serta fase diam. Lalu dilakukan penotolan dengan
ekstrak kafein yang didapat dan baku pembanding kafein pada lempeng KLT.
Hasil penotolan dilihat dibawah sinar UV 254 nm terlihat warna ungu. Fraksi
yang telah ditotolkan tersebut dimasukkan ke dalam chamber yang berisi
eluen. Eluen digunakan sebagai pelarut untuk mendeteksi noda karena ketika
senyawa organik diserap oleh eluen pada lempeng KLT, proses penyerapan
 berhenti dimana semakin kuat senyawa diserap, semakin kurang jarak yang
ditempuh ke atas lempengan. Setelah terlihat kenaikan bercak lempeng KLT
dikeringkan lalu diamati dibawah sinar UV 254 nm dan ditandai noda yang
timbul pada lempeng KLT sesuai bentuk yang diamati agar mempermudah
 perhitungan Rf dan HRf. Noda yang timbul berwarna ungu, s etelah ditandai
noda yang nampak dilakukan penyemprotan penampang bercak iodide kalium
iodide-asam klorida dilanjutkan dengan pengeringan pada oven dengan suhu
1050 C selama 5-10 menit untuk mengintensifkan warna pada lempeng KLT
dan noda yang terbentuk berwarna ungu sama dengan baku pembanding yang
menandakan ekstraksi senyawa kafein berjalan sesuai prosedur.
Dari hasil perhitungan menghasilkan nilai RF 0,65 dan nilai HRf nya
65. Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu.
Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan
senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti
 mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut
dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan
kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Nilai Rf
KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus
dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya
(Gandjar,2007). Serbuk hasil isolasi kafein tersebut akan berbentuk Kristal
 jarum kecil-kecil berwarna transparan memanjang apabila diamati secara
mikroskopik perbesaran 100x.

VIII. KESIMPULAN
1. Mahasiswa mampu memahami prinsip dan mengisolasi senyawa kafein
dari daun teh hijau (Camellia sinensis) dengan metode refluks yaitu
metode ekstraksi dengan pelarut pada temperature titik didihnya selama
waktu tertentu sehingga terjadi ekstraksi kontinu dan jumlah pelarut
terbatas yang relative konstan dengan adanya pendingin balik. Metode
refluks ini digunakan untuk mengisolasi kafein dari daun teh karena sifat
kafein tahan terhadap adanya pemanasan serta te kstur bahan yang kasar.
2. Mahasiswa mampu melakukan evaluasi kafein dari teh hijau (Camellia
 sinensis) dengan uji organoleptis yaitu berbentuk serbuk kristal , warna
 putih, bau khas teh, rasa pahit dan rendemen yang dihasilkan 0,0353% b/b
3. Mahasiswa mampu melakukan identifikasi kafein dari teh hijau (Camellia
 sinensis) dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan prinsip
memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran. Dihasilkan noda warna ungu baik dari hasil senyawa kafein
yang diekstrak maupun baku pembanding kafein pada lempeng KLT. Serta
retardasi solut (Rf) hasil senyawa kafein 0,65 dan baku pembanding kafein
0,63
IX. DAFTAR PUSTAKA
Abraham. 2010.  Penuntun Praktikum Kimia Organik II .
LaboratoriumPengembangan Unit Kimia, Fakultas Keguruan dan Ilmu
Pendidikan. Universitas Haluoleo : Kendari
Atomssa T., A.V. Gholap. 2011. “ Characterization of Caffeine and
 Determination of Caffeine in Tea Leaves  Using UV-Visible
Spectrometer”. African  Journal of Pure and Applied Chemistry. Vol.
V(1).
Dewi, Mainora Rahayu. 2008. “ Penentuan Kandungan Kafein Pada Daun
Teh (Camelia sinensis)”. Tesis. Program Pascasarjana Universitas
Andalas
 Nersyanti, Fenri. 2006. “S pektrofotometri Dervatif Ultraviolet Untuk
Penentuan Kadar Kafein Dalam Minuman Suplemen Dan Ekstrak Teh”.
Skripsi. Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Bogor. Bogor.
Pranata, F. Sinung. 1997. “Isolasi Alkaloid dari Bahan Alam (Alkaloid
Insulation of Natural Materials)”. Biota. Vol. II(2).
Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II. Malang: Universitas Negeri Malang.
Tim Dosen Kimia Organik. 2012. Penuntun Kimia Organik I.  Laboratorium
FMIPA UNM. Makassar
Voight. 1971.  Buku Pembelajran Teknologi Farmasi Edisi 5.  Yogyakarta :
Gadjah Mada University Press
 Semarang, 4 Mei 2018
Mengetahui, Praktikan
Dosen Pengampu

Margareta Retno Priamsari, M.Sc., Apt (Cicilia Dian)

Praktikan

(Riska Putri)
 LAMPIRAN

Reagen yang digunakkan saat KLT

 Eluan yang diperlukan = Etil Asetat : Metanol : Aquadest (100 : 13,5 :
10)
Eluen yang digunakan = 10 ml
100
Etil Asetat = x 10 ml = 8,1 ml
123,5

13,5
Metanol = x 10 ml = 1,1 ml
123,5

10
Aquadest = x 10 ml = 0,8 ml
123,5

Kelompok beasr = Etil asetat: 8,1 ml x 6 = 48,6 ml

Metanol : 1,1 ml x 6 = 6,6 ml
Air 0,8 ml x 6 = 4,8 ml
 Pembuatan Pb Asetat 20%
25 ml x 6 kelompok = 150 ml
Overmatt 10% x 150 ml = 15 ml
Total 150 ml + 15 ml = 165 ml
Pb asetat serbuk = 20% x 165 = 33 g
Air = 165 –  33 g = 132 ml
 Kloroform
45 ml x 6 kelompok = 270 ml
Overmatt 10% x 270 ml = 27 ml
270 + 27 ml = 297 ml ~ 300 ml