LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA

ISOLASI SENYAWA DARI SIMPLISIA BUAH CABE JAWA

(Piper retrofractum Vahl.)

Disusun Oleh:
Shift B / Kelompok 7

Neneng Indah Nurazizah (10060316084)

Anggi Arisandi (10060316085)
Ainul Fatihah Halim (10060316086)
Alya Nur Azizah (10060316087)
Ayu Aprillia Sabatini (10060316088)
Yosi Alviani Lestari (10060316089)

Tanggal Penyerahan: Rabu, 07 November 2018

Asisten Penanggung Jawab: Dwiratie Regina Cahyani, S. Farm

LABORATORIUM FARMASI UNIT B

PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
1440 H / 2018 M
 ISOLASI SENYAWA DARI SIMPLISIA BUAH CABE JAWA
(Piper retrofractum Vahl.)

I. Tujuan Percobaan
Pada praktikum kali ini bertujuan untuk mengisolasi senyawa dari
simplisia cabe jawa (Piper retrofractum Vahl.). Tahapan awal dari isolasi suatu
senyawa adalah tahapan skrining fitokimia yang bertujuan untuk proses
identifikasi awal untuk mengetahui golongan senyawa apa saja yang terdapat di
dalam simplisia. Selanjutnya dilakukan tahap ekstraksi yang bertujuan untuk
menarik seluruh senyawa yang terdapat di dalam simplisia sehingga didapatkan
senyawa yang masih umum, metode ekstraksi yang digunakan adalah metode
maserasi. Setelah simplisia diektraksi, dilakukan pemantauan ekstrak terhadap
ekstrak menggunakan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis). Setelah
pemantauan ekstrak, dilakukan fraksinasi yang bertujuan untuk mendapatkan
suatu fraksi yang lebih sederhana dari ekstrak dengan metode ekstraksi cair-cair.
Tahapan selanjutnya adalah proses pemantauan fraksi menggunakan
kromatografi lapis tipis. Setelah didapatkan fraksi, selanjutnya dilakukan tahapan
fraksinasi kedua untuk mendapatkan komponen yang lebih sederhana lagi yaitu
subfraksi, maka digunakan metode kromatografi kolom klasik. Tahapan
selanjutnya adalah dilakukannya proses pemantauan kembali subfraksi
menggunakan kromatografi lapis tipis. Kemudian subfraksi yang terpilih
dimurnikan menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif untuk mendapatkan
senyawa murni. Setelah didapatkan hasil senyawa yang diduga murni, maka untuk
memastikannya dilakukan proses uji kemurnian menggunakan kromatografi 1
dimensi dan 2 dimensi. Selanjutnya dilakukan pencucian kristal yang bertujuan
untuk mendapatkan kristal yang lebih murni sehingga terbebas dari pengotor.
Setelah didapatkan kristal yang lebih murni, dilanjutkan dengan proses pengujian
titik leleh dengan menggunakan melting point. Setelah dipastikan murni, maka
untuk mengetahui identitas senyawa yang diperoleh maka dilakukan pengujian
menggunakan alat spektrofotometer UV sehingga didapatkan data berupa panjang
gelombang dan nilai absorbansi.
II. Alat dan Bahan
Tabel 2.1 Alat dan Bahan yang digunakan selama praktikum
Alat Bahan
Alat maserasi Air panas
Batang pengaduk Amilalkohol
Beaker glass Aquadest
Cawan Penguap Benang kasur
Chamber Etanol 96%
Corong Pisah Etil asetat
Gelas ukur 10 mL HCl pekat
Gelas ukur 50 mL Kapas bebas lemak
Gelas ukur 100 mL Kertas perkamen
Hair Dryer Kertas saring
Hot Plate Kloroform
Kaca arloji Larutan Amonia 10%
Mortir dan stemper Larutan Besi (III) Klorida 1%
Neraca analitik Larutan Gelatin 1%
Oven Larutan HCl 2 N
Pipet tetes Larutan NaOH 1 N
Spatel Larutan Vanilin 10% dalam H2SO4 pekat
Spektrofotometer UV-Vis Metanol
Statip dan klem n-heksan
Tabung kromatografi kolom Pereaksi Besi (III) Klorida
Tabung reaksi Pereaksi Dragendorff
Vacum rotary evaporator Pereaksi Liebermann Burchard
Vial Pereaksi Mayer
Water bath Pereaksi Steasny
Serbuk Magnesium
Pipa kapiler
Plastic Wrap
Plat KLT analitik
Plat KLT preparatif
Silika gel
Simplisia Cabe Jawa
III. Prosedur
3.1 Skrining Fitokimia
3.1.1 Alkaloid
Simplisia ditempatkan pada tabung reaksi, lalu di asamkan dengan
penambahan Asam Klorida 2N lalu disaring. Kemudian filtrat di basakan dengan
penambahan larutan Amonia 10%, kemudian ditambahkan kloroform dan di
kocok kuat-kuat. Lalu lapisan kloroform di pipet dan di saring, kemudian
kedalamnya di tambahkan Asam Klorida 2N lalu dikocok kuat kuat-kuat sampai
terdapat dua lapisan dan lapisan asam dipipet dan dibagi tiga bagian. Yaitu pada
bagian pertama ditambahkan Pereaksi Mayer dan adanya endapan putih atau
kekeruhan menandakan positif alkaloid, pada bagian kedua ditambahkan Pereaksi
Dragendorff dan adanya endapan jingga-kuning atau kekeruhan menandakan
positif alkaloid, dan pada bagian ketiga digunakan sebagai blangko.
Pembuatan Pereaksi Mayer: HgCl2 sebanyak 1,36 gram dilarutkan ke
dalam 60 mL air dan sebanyak 5 gram KI dilarutkan dalam 10 mL air, lalu kedua
larutan tersebut dicampurkan dan digenapkan dengan menggunakan air hingga
volumenya 100 mL.
Pembuatan ereaksi Dragendorff: sebanyak 8 gram Bi(NO3 )3. H2O
dilarutkan dalam 30% b/v HNO3 dan sebanyak 27,2 gram KI dilarutkan dalam 50
mL air, lalu kedua larutan tersebut dicampurkan dan dibiarkan selama 24 jam
kemudian disaring, lalu digenapkan dengan air hingga volumenya 100 mL.

3.1.2 Polifenolat
Simplisia ditempatkan pada tabung reaksi lalu ditambahkan air
secukupnya, lalu dipanaskan diatas penangas air dan disaring. Kepada filtrat
ditambahkan larutan Pereaksi Besi (III) Klorida dan timbulnya warna hijau atau
biru-hijau, merah-ungu, biru-hitam hingga hitam, menandakan simplisia positif
fenolat atau timbul endapan coklat menandakan adanya polifenolat.
3.1.3 Flavonoid
Simplisia sebanyak 1 gram ditempatkan dalam gelas kimia, kemudian
ditambahkan 100 mL air panas dan di didihkan selama 10 menit. Kemudian
campuran disaring, lalu filtrat ditampung sebagai LARUTAN C yang nantinya
akan digunakan untuk pemeriksaan golongan senyawa Flavonoid, Saponin, dan
Atrakuinon.

3.1.4 Saponin
Larutan C diambil sebanyak 5 mL, lalu di masukkan kedalam tabung
reaksi dan di kocok secara vertical selama 10 detik. Kemudian dibiarkan selama
10 menit. Terbentuknya busa 1 cm yang stabil di dalam tabung reaksi
menunjukkan adanya golongan senyawa saponin. Dan busa tersebut masih
bertahan (tidak hilang) setelah ditambahkan beberapa tetes Asam Klorida.

3.1.5 Antrakuinon
Larutan C sebanyak 5 mL lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
Kemudian ditambahkan beberapa tetes larutan Natrium Hidroksisa 1N.
terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukkan adanya golongan
senyawa kuinon.

3.1.6 Tanin
Simplisia sebanyak 1 gram ditambahkan air panas sebanyak 100 mL,
kemudian didihkan selama 15 menit. Lalu campuran di dinginkan,
kemudiandisaring dan filtrat dibagi menjadi 3 bagian dalam tabung reaksi.
Kedalam tabung filtrat pertama ditambahkan larutan Besi (III) Klorida 1%,
terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya golongan
senyawa tanin. Ke dalam filtrat kedua ditambahkan larutan Gelatin 1%,
terbentuknya endapan putih menunjukkan keberadaan senyawa tanin. Kedalam
filtrat ketiga ditambahkan 15 mL Pereaksi Steasny, lalu dipanaskan dengan
penangas, terbentuknya endapan merah muda menunjukkan adanya tanin katekat.
Hasil uji filtrat ketiga disaring. Lalu filtrat dijenuhkan dengan penambahan
Natrium Asetat, kemudian ditambahkan beberapa tetes larutan Besi (III) Klorida
1%, terbentuknya warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat.
Pembuatan Pereaksi Steasny: sebanyak 2 baguan Formaldehid 30%
dicampurkan dengan bagian Asam Klorida pekat.

3.1.7 Monoterpen dan seskuiterpen

Simplisia digerus dengan eter lalu disaring. Filtrat ditempatkan dalam
cawan penguap dan dibiarkan menguap sampai kering, lalu ditambahkan larutan
Vanilin 10% dalam Asam Sulfat pekat dan timbulnya warna-warna menandakan
positif senyawa monoterpena dan seskuiterpena.

3.1.8 Triterpenoid dan steroid

Simplisia digerus dengan eter lalu disaring. Filtrat ditempatkan dalam
cawan penguap dan dibiarkan menguap sampai kering, lalu ditambahkan larutan
Pereaksi Liebermann Burchard dan terjadinya warna merah-ungu menandakan
positif triterpenoid, sedangkan bila warna hijau-biru menunjukkan positif steroid.
Pembuatan Pereaksi Liebermann Burchard: Asam Asetat Anhidrat
sebanyak 1 mL dicampur dengan 1 mL kloroformm, lalu didinginkan pada suhu
0°C, lalu ditambahkan 1 tetes Asam Sulfat pekat.

3.2 Ekstraksi
3.2.1 Maserasi
Alat maserator yang akan digunakan dibersihkan dan dibilas dengan
etanol. Kapas sumbat dipasang pada bagian bawah alat dan saluran pada bagian
bawah maserator dipastikan tertutup. Selain itu, kertas saring diukur sesuai
dengan diameter maserator dan ditempatkan ke dalam alat maserator. Kemudian
pada bagian atas kertas saring, ditambahkan kapas hingga menutupi kertas saring.
Sebanyak 200 gram simplisia ditimbang, dimasukan ke dalam alat
maserator dan diratakan permukaan simplisia di dalam maserator. Ke dalam
maserator, ditambahkan pelarut hingga simplisia terendam dengan volume pelarut
600 mL. Bagian atas maserator ditutup menggunakan alumunium foil untuk
menghindari penguapan pelarut, campuran diaduk setiap beberapa waktu tertentu
dan dibiarkan selama 24 jam. Prosedur dilakukan selama 2 hari dan pada hari
kedua, volume pelarut yang ditambahkan sebanyak 500 mL. Kemudian, wadah
penampung disiapkan dan saluran pada bagian bawah alat maserator dibuka untuk
mengambil filtrat. Saluran ditutup kembali setelah semua filtrat tertampung.
Proses pengambilan filtrat diulangi sebanyak duakali pada hari pertama dan
kedua.

3.2.2 Pemekatan Ekstrak

Ekstrak cair dimasukkan ke dalam alat vaccum rotary evaporator.
Evaporator diatur pada suhu kurang lebih 30-400C. Vaccum rotary evaporator
dijalankan. Setelah pelarut berkurang, tambahkan ekstrak cair. Penguapan pelarut
dilakukan hingga dalam ekstrak hanya tersisa sedikit pelarut, tetapi tidak sampai
kering. Prosedur dilakukan hingga seluruh ekstrak cair terpekatkan. Kemudian,
ekstrak hasil evaporasi dipekatkan di atas waterbath.

3.3 Pemantauan Ekstrak

3.3.1 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Bejana (chamber) disiapkan. Kemudian plat KLT diberi garis pembatas
atas dan bawah sebagai jarak elusi dengan cara memberi garis pada ujung atas dan
ujung bawah plat yang berjarak 1 cm dari kedua ujung tersebut, kemudian plat
diaktivasi dengan cara dipanaskan di dalam oven bersuhu 1050C selama 10 menit.
Setelah itu fase gerak berupa pelarut campuran yang terdiri dari n-heksan dan
kloroform dengan perbandingan 0,5:3,5 sebanyak 8 mL disiapkan, kemudian
dimasukkan kedalam bejana (chamber). Selanjutnya eluen dijenuhkan dengan
kertas saring, dengan cara kertas saring dicelupkan kedalam bejana lalu ditutup
menggunakan kaca arloji. Kemudian bejana dibiarkan jenuh dengan uap fase
gerak. Setelah itu sejumlah ektrak kental dilarutkan dengan beberapa mL etanol
hingga diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer. Plat
KLT analitik yang telah diaktivasi dikeluarkan dari oven dan dibiarkan dingin.
Setelah dingin, ekstrak ditotolkan pada plat KLT analitik dengan menggunakan
pipa kapiler dan totolan ekstrak dibiarkan mengering (pelarut menguap).
Kemudian plat yang telah ditotolkan dimasukkan kedalam bejana (Perhatian :
tinggi permukaan fase gerak/ pengembang dalam bejana harus lebih rendah
daripada totolan bercak). Selanjutnya fase gerak dibiarkan naik hingga garis
pembatas atas yang sebelumnya telah dibuat. Kemudian plat diangkat, plat
dibiarkan mengering (hingga fase gerak/pengembang menguap), selanjutnya
warna bercak dilihat di bawah sinar ultraviolet λ 254 nm dan 366 mm.
Dilakukan kembali KLT dengan eluen yang berbeda yaitu, toluen : etil
asetat dengan perbandingan 7 : 3 sebanyak 5 mL dan hanya dengan menggunakan
n-heksan 5 mL.

3.4 Fraksinasi
3.4.1 Ekstraksi Cair-Cair
Corong pisah yang berukuran 250 ml dalam keadaan bersih yang
sebelumnya telah dibilas etanol teknis disiapkan dan dipastikan telah kering. 47
gram ekstrak kental dilarutkan terlebih dahulu dengan 500 mL aquadest panas dan
sedikit etanol, kemudian ekstrak kental yang telah dilarutkan dalam 500 mL
aquadest panas tersebut kemudian dimasukkan kedalam corong pisah sebanyak
100 mL. Ditambahkan 100 ml pelarut n-heksan dan corong pisah dipasangkan
penutupnya. Corong pisah dikocok dengan hati hati dan sesekali dibuka keran
pada bagian bawah corong pisah untuk mengurangi tekanan uap yang terjadi
dalam corong pisah, pengocokan dilakukan selama 15 menit. Setelah proses
pengocokan selesai dilakukan, corong pisah disimpan pada klem dan didiamkan
sampai kedua lapisan terpisah dengan jelas. Didalam corong pisah terdiri atas dua
lapisan dimana lapisan atas merupakan lapisan pelarut n-heksan dan lapisan
bawah adalah lapisan air sehingga yang diambil untuk diuapkan adalah lapisan
atas (fraksi n-heksan). Fraksi air dimasukkan kembali kedalam corong pisah dan
diulangi sebanyak 1 kali. setelah dipisahkan untuk yang ke 2 kalinya, lapisan
bawah dengan pelarut air ditambahkan 100 mL etil asetat dan dilakukan perlakuan
yang sama seperti terhadap n heksan, dilakukan sebanyak 2 kali. Setiap fraksi
yang didapat selanjutnya diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator.
3.4.2 Kromatografi Kolom Klasik
1,5gram fraksi etil asetat yang telah kental diserbukkan terlebih dahulu
dengan penambahan 1gram silika gel dan digerus menggunakan mortir dan
stemper. 50gram silika gel 60 dibuat bubur silika dengan penambahan n-heksan di
dalam beaker glass dan kemudian dimasukkan kedalam kolom yang sebelumnya
telah disumbat kapas bebas lemak dibagian ujungnya. Silika gel dimasukkan
kedalam kolom sambil kolom dipukul perlahan, diatas silika gel diletakan kertas
saring dan kemudian dimasukkan fraksi etil asetat yang telah diserbukan tadi.
Eluen dimasukkan ke dalam kolom dan keran sambil dibuka sehingga eluen turun.
Penambahan eluen harus secara kotinyu sehingga silika tidak sampai kering.
Fraksi-fraksi yang keluar ditampung dalam vial yang sebelumnya telah dikalibrasi
10 mL. Fraksi yang diperoleh dipekatkan dan dilakukan proses pemantauan
dengan KLT. Warna bercak yang dihasilkan dilihat dibawah sinar UV λ 254 nm
dan λ 366 nm.

3.4.3 Pembuatan Eluen

Elusi landaian dengan campuran pelarut dibuat dalam seri landaian
campuran pelarut mulai dari yang bersifat kurang polar hingga bersifat polar,
dalam beberapa wadah pelarut. Seri campuran pelarut yang dijadikan sebagai
eluen ialah:
N-Heksan (mL) Etilasetat (mL) Metanol (mL)
20 0 0
12 8 0
8 12 0
0 20 0
0 12 8
0 8 12
0 0 20
0 0 20
3.5 Teknik Pemisahan dan Pemurnian
3.5.1 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Pelat KLT tebal khusus untuk KLT preparatif disiapkan. Fraksi hasil
kromatografi kolot ditotolkan membentuk pita bergaris tepat 1 cm dari ujung
bawah pelat. Disiapkan eluen n-heksan : kloroform (0,5 : 3,5). Chamber
dijenuhkan terlebih dahulu dengan cara kertas saring dimasukan ke dalam
chamber yang telah berisi eluen, kemudian didiamkan hingga kertas saring
terbasahi sempurna. Pelat KLT yang telah berisi totolan isolat dimasukan kedalam
chamber. Didiamkan hingga pada pelat diperoleh bercak yang telah memisah
sempurna. Pelat dikeluarkan dari chamber, didiamkan hingga kering lalu di pantau
menggunakan sinar UV 254 nm dan 366 nm. Bercak pita yang diduga senyawa
target di kerok, lalu dimasukan kedalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan
pelarut metanol 5 mL kedalam erlenmeyer, lalu disaring larutan hingga silika gel
terpisah. Filtrat kemudian diuapkan hingga di peroleh kristal.

3.5.2 Kristalisasi Senyawa

Fraksi hasil kromatografi kolom dipanaskan menggunakan hairdyer
hingga seluruh pelarut menguap dan diperoleh isolat yang bebas dari pelarut.
Selanjutkan isolat cair didinginkan menggunakan pendingin butiran es pada
wadah, sehingga diperoleh butir-butir kristal. Kemudian direkristalisasi dengan
cara dilarutkan didalam pelarut n-heksan : etilasetat hingga diperoleh kristal yang
lebih murni.

3.6 Uji Kemurnian

3.6.1 Pengujian Titik Leleh
Kristal yang diperoleh dari hasil isolasi diserbukkan, Kemudian
dimasukkan kedalam pipa kapiler lalu masukkan ke dalam alat melting point,
ditekan start lalu lihat pipa kapiler pertama kali mencair hingga mencair
seluruhnya dan dicatat suhu nya.
3.6.2 KLT Satu Dimensi
Tiga buah Plat KLT disiapkan dan diberi garis pada ujung bawah dan atas
dengan jarak 1 cm dimana pada plat pertama diberi tanda n-heksan, plat kedua etil
asetat dan plat ketiga metanol. Setelah itu masing masing plat tersebut di aktivasi
dalam oven dengan suhu 105 °C selama 10 menit. Kemudiam tiga buah chamber
disiapkan dimana chamber pertama berisi n-heksan, chamber kedua berisi etil
asetat dan chamber ketiga berisi metanol. Kemudian masing masing chamber
dijenuhkan menggunakan indikator kertas saring. Hasil filtrasi pada KLT
Preparatif di totolkan pada masing-masing plat kemudian plat tersebut dimasukan
ke dalam masing-masing chamber dengan eluen yang berbeda hingga eluen
menarik dengan sempurna. Plat diangkat kemudian dipantau dengan sinar UV
pada panjang gelombang 254 nm dan dikeringkan.

3.6.3 KLT Dua Dimensi

Disiapkan 2 buah chamber dimana chamber pertama berisi n heksan : etil
asetat (7:2) dan chamber kedua berisi n heksan – etilasetat (2:7) lalu dijenuhkan.
Disiapkan pula plat KLT yang sudah ditandai dan larutkan sedikit kristal yang
diperoleh jika ada, dengan sedkit etil asetat. Ditotolkan dengan tepat disebelah kiri
plat KLT. KLT dimasukkan kedalam chamber pertama lalu dibiarkan sampai
eluen menaik sempurna. Plat KLT lalu diangkat dan di analisis dengan sinar uv
pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Lalu plat KLT dikeringkan. Plat
KLT kemudian dimasukkan kedalam chamber kedua dengan terlebih dahulu
memutar plat sebesar 90oC sehingga bercak tepat berada dibawah lalu dilakukan
hal yang sama dengan cara sebelumnya. Kemudian di analisis.

3.6.4 Spektrofotometri UV-Vis

Spektofotometri UV- Vis dinyalakan kemudian hasil filtrasi dari KLT
Preparatif dan etanol disiapkan. Etanol dimasukan ke dalam kuvet. Kemudian
kuvet yang berisi etanol dimasukkan ke dalam spektrofotometri UV – Vis yang
digunakan sebagai blanko kemudian dibuang. Lalu pada kuvet tersebut
dimasukkan filtrat hasil KLT preparatif yang telah dilarutkan dalam etanol dan
diukur absorbansinya.

IV. Data Pengamatan dan Perhitungan

4.1 Skrining Fitokimia
Tabel 4.1 Data Pengamatan
Senyawa Pengamatan Gambar
Alkaloid - Pada Pereaksi Mayer
simplisia positif
mengandung alkaloid
yang ditandai dengan
timbulnya endapan
berwarna putih dan
larutan berwarna
bening kekeruhan.
- Pada Pereaksi
Dragendorff simplisia
positif mengandung
alkaloid ditandai
dengan timbulnya
endapan berwana
jingga-kuning.
Polifenolat Simplisia positif
mengandung senyawa
polifenolat ditandai
dengan timbulnya warna
hijau kecoklatan. .
 Flavonoid Terbentuk warna dalam
lapisan amilalkohol.
Artinya cabe jawa positif
mengandung senyawa
flavonoid.

Saponin Larutan C sebanyak 5 mL

setelah dikocok 10 detik
dan didiamkan selama 10
menit, busa hilang.
Artinya cabe jawa negatif
atau tidak mengandung
saponin.
Antarkuinon Larutan C sebanyak 5
mL, setelah ditambahkan
5 tetes NaOH 1N,
terbentuk warna kuning
sedikit kemerahan.
Artinya simplisia positif
mengandung kuinon.
Tanin - Tabung 1: Simplisia
negatif mengandung
tanin karena tidak
terbentuk warna biru
tua atau hitam
kehijauan.
- Tabung 2: Simplisia
negatif mengandung
tanin karena tidak
terbentuk endapan
putih.
 - Tabung 3: Simplisia
negatif mengandung
tanin karena tidak
terbentuk endapan
berwarna merah
muda.

Monoterpena dan Simplisa positif

Seskuiterpena mengandung
monoterpena dan
seskuiterpena ditandai
dengan timbulnya warna
hijau kehitaman.
Triterpenoid dan Steroid Simplisia positif
mengandung triterpenoid
dan steroid ditandai
dengan timbulnya warna
merah-ungu.

Perhitungan:
1. Pereaksi Mayer
50 𝑚𝐿
- HgCl2 = 100 𝑚𝐿 x 1,36 gram = 0,68 gram
50 𝑚𝐿
- Air = x 60 mL = 30 mL
100 𝑚𝐿
50 𝑚𝐿
- KI = x 5 gram = 2,5 gram
100 𝑚𝐿
50 𝑚𝐿
- Air = x 10 mL = 5 mL
100 𝑚𝐿

Air hingga 50 mL
2. Pereaksi Dragendorff
8 gram Bi(NO3 )3. H2 O → 30% b/v HNO3
7,2 gram KI → 50 mL air
V1 . N1 = V2 . N2
50 . 0,3 = V2 . 0,65
15 =V2 . 0,65
V2 = 23 mL
3. Gelatin 1%
Literatur = 2% → 2 gram ~ 100 mL
1% → 1 gram ~ 100 mL
X ~ 50 mL
50 𝑚𝐿
Bobot gelatin = x 1000 mg = 500 mg = 0,5 gram
100 𝑚𝐿

4. FeCl3 1% 50 mL
Kelarutan: FeCl3 9 gram ~ 100 mL
50 𝑚𝐿
50 mL = 100 𝑚𝐿 x 9 gram

= 4,5 gram
5. Peraksi Steasny
2
- Formaldehid = 3 x 50 mL = 33,33 mL
1
- HCl pekat = 3 x 50 mL = 16,67 mL

6. NaOH 1N
Mr NaOH = 23 + 16 + 1 = 40
𝑔𝑟𝑎𝑚 1000
NaOH 1N = x 50 𝑚𝐿
𝑀𝑟
𝑔𝑟𝑎𝑚 100
1N = x
40 50
40
gram = 20 = 2 gram

7. Vanillin 10%
10
Vanillin = 100 x 50 gram = 5 gram

8. Ammonia 10%
10
Ammonia = 100 x 50 mL = 5 mL
9. Pengenceran HCl 12,06N ke HCl 2N
V1 . N1 = V2 . N2
2 . 50 = V2 . 12,06
100 = 12,06 V2
100
V2 = 12,06

= 8,29 mL

4.2 Ekstraksi
Tabel 4.2 Pengamatan dan Perhitungan untuk esktraksi
Gambar Hasil Pengamatan
Ekstraksi dengan alat 3.2.1. Maserasi
maserator Nama Simplisia: Retrofracti Fructus
Nama Umum : Cabe Jawa
Jumlah simplisia yang diekstraksi: 426 gram
Jumlah pelarut yang digunakan: Etanol 1.100
mL
Pada hari pertama: 600 mL etanol
Pada hari kedua: 500 mL etanol

3.2.2. Pemekatan Ekstrak

Jumlah ekstak yang diperoleh :
48,3762 gram
%Rendemen ekstrak :
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑘𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ
𝑥 100%
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖
48,3762 𝑔𝑟𝑎𝑚
= 𝑥 100% = 11,35%
426 𝑔𝑟𝑎𝑚
4.3 Pemantauan Ekstrak
Tabel 4.3 Pengamatan KLT dan perhitungan
Pengamatan Perhitungan
KLT dengan 0,5
N-heksan = 𝑥 8 𝑚𝑙 = 1 𝑚𝑙
4
menggunakan eluen 3,5
Kloroform = 𝑥 8 𝑚𝑙 = 7 𝑚𝑙
4
n-heksan : kloroform
 Dik: Jarak pelarut = 4cm
(0,5 : 3,5)
Jarak bercak 1 = 2,5 cm
Jarak bercak 2 = 3,8 cm
 Dit: nilai Rf?
 Jawab:
2,5 𝑐𝑚
Rf bercak 1 = = 0,62
4 𝑐𝑚
3,8 𝑐𝑚
Rf bercak 2 = = 0,95
4 𝑐𝑚

3
Etil asetat = 10 𝑥 5 𝑚𝑙 = 1,5 𝑚𝑙
KLT dengan
7
menggunakan eluen Toluena = 10 𝑥 5 𝑚𝑙 = 1,5 𝑚𝑙
toluena : Etil asetat  Dik: Jarak pelarut = 4cm
(7 : 3) Jarak bercak 1 = 3 cm
Jarak bercak 2 = 3,8 cm
 Dit: nilai Rf?
 Jawab:
3 𝑐𝑚
Rf bercak 1 = = 0,75
4 𝑐𝑚
3,8 𝑐𝑚
Rf bercak 2 = = 0,95
4 𝑐𝑚

KLT dengan  Dik: Jarak pelarut = 4cm

menggunakan eluen Jarak bercak 1 = 3 cm
n-heksan 5 mL Jarak bercak 2 = 3,8 cm
  Dit: nilai Rf?
 Jawab:
2,9 𝑐𝑚
Rf bercak 1 = = 0,72
4 𝑐𝑚

Rf bercak 2 = -

Jadi, eluen yang digunakan untuk KLT analitik

selnjutnya dan untuk KLT preparatif adalah eluen
n-heksan : kloroform (0,5 : 3,5)

4.4 Fraksinasi
Tabel 4.4 Pengamatan serta perhitungan untuk ECC dan Kromatografi Kolom
Pengamatan Perhitungan
Ekstraksi Cair-Cair  Jumlah ekstrak untuk di ECC 47 gram
 Pelarut yang dipakai adalah 500 mL air
 Fraksi Etil Asetat
Bobot cawan kosong = 75,6037 g
Bobot cawan + fraksi = 88, 4711 g
Fraksi = 88,4711 g - 75,6037 g = 12,8674 gram
312,8674 𝑔
% Rendemen = 𝑥 100 % = 27,37%
47 𝑔

 Fraksi n-heksan
Bobot cawan kosong = 68,4992 g
Pemekatan fraksi n-
Bobot cawan + fraksi = 70 g
heksan dan etil asetat
Fraksi = 70 g – 68,4992 g = 1,5008 gram
1,5008 𝑔
% Randemen = 𝑥 100 % = 3,19%
47 𝑔

 Eluen ke-1
N-heksan : Kloroform (0,3:3,5)
0,5
N-heksan = 𝑥 8 𝑚𝑙 = 1 𝑚𝑙
4
 3,5
Kloroform = 𝑥 8 𝑚𝑙 = 7 𝑚𝑙
4
Pemantauan fraksi n-
 Fraksi N-heksan
heksan dan etil asetat
Jarak pelarut = 4,1 cm
Jarak bercak 1 = 2,7 cm
Jarak bercak 2 = 3,8
2,7
Rf bercak 1 = 4,1 = 0,658
3,8
Rf bercak 2 = 4,1 = 0,926

 Eluen ke-2
Etil asetat : Toluen (3:7)
3
Etil asetat = 10 𝑥 5 𝑚𝑙 = 1,5 𝑚𝑙
7
Toluena = 10 𝑥 5 𝑚𝑙 = 1,5 𝑚𝑙

 Fraksi Etil Asetat

Jarak pelarut = 4,1 cm
Jarak bercak 1 = 2,8 cm
Jarak bercak 2 = 3,8
2,8
Rf bercak 1 = 4,1 = 0,682
3,8
Rf bercak 2 = 4,1 = 0,926

Jadi eluen yang digunakan n-heksan : kloroform

(0,5:3,5)
 Fraksi n-heksan
2,7
Rf bercak 1 = 4,1 = 0,658
3,8
Rf bercak 2 = 4,1 = 0,926

 Fraksi etil asetat

2,8
Rf bercak 1 = 4,1 = 0,682
 3,8
Rf bercak 2 = 4,1 = 0,926

Kromatografi Kolom  Bobot silika gel :

1
 = 3 𝜋 𝑟2 𝑡. 𝑒𝑙𝑢𝑠𝑖
1
 = 3 3,14 𝑥 (2,2)2 20 𝑐𝑚
303,952
 = = 101,317333 𝑔
3

 Fraksi untuk kolom 1,5 g

 Silika gel yang di gerus 1 g
 Fraksi Etil Asetat untuk KK
Bobot cawan = 75,6037 g
Bobot cawan fraksi = 12,8674 g
% Rendemen Fraksi etil asetat =
12,8674 𝑔
𝑥 100% = 27,37 %
47 𝑔

 Silika gel 60 untuk mengeringkan = 1 gram

 Pemantauan subfraksi dari vial 11, 12, 13
N-heksan : Kloroform (0,5:3,5)
0,5
N-heksan = 𝑥 8 𝑚𝐿 = 1 𝑚𝐿
4
3,5
Kloroform = 𝑥 8 𝑚𝐿 = 7 𝑚𝐿
4

Jarak pelarut = 4 cm
Jarak bercak = 2 cm
2
Rf = 4 = 0,5

Jadi, subfraksi yang digunakan untuk KLT

preparatif adalah subfraksi di vial 11, 12 & vial
13, sedangkan vial 14 digunakan untuk cuci
kristal.
4.5 Teknik Pemisahan dan Pemurnian
A. Perhitungan eluen
N-heksan : kloroform (0,5 : 3,5)
0,5
N-heksan = × 50 mL = 6,25 mL
4
3,5
Kloroform = × 50 mL = 43,75 Ml
4

B. Pengamatan
Tabel 4.5 Gambar dari KLT preparatif
No Gambar Keterangan
Proses elusi KLT Preparatif

Hasil elusi KLT Preparatif pada

sinar UV 254 nm

Hasil elusi KLT Preparatif pada

sinar UV 366 nm

Spot senyawa hasil pemisahan

pada Plat KLT Preparatif (Yang
sudah di kerok)
 C. Perhitungan Nilai Rf
Dik = Eluen yang digunakan n-heksan 6, 25 mL, kloroform 43,75 mL
Jarak eluen = 17, 9 cm
Jarak pita 1 (Merah) = 12,3 cm
Jarak pita 2 (Biru) = 15,8 cm
Dit = Nilai Rf KLT preparatif?
12,3 cm
Jawab = Rf pita 1 = 17,9 cm = 0,687
15,8 cm
Rf pita 2 = 17,9 cm = 0,882

4.6 Uji Kemurnian

Tabel 4.6 Pengamatan hasil uji kemurnian
No Gambar Hasil Pengamatan
1. Pengujian Titik Leleh Rentang Titik leleh yang didapat
: Kristal 1 : 132 – 134o C
Kristal 2 : 115 – 127oC
2. KLT Satu Dimensi KLT Satu Dimensi
Pita 1 Jarak Eluen : 4cm
Etil asetat Pita 1 (Merah) : Murni,karena
timbul 1 bercak
Pelarut : Etil Asetat (Bercak:
3,4cm)
3,4𝑐𝑚
Rf : 104𝑐𝑚 = 0,85

Pelarut : n-heksan (Bercak: 0cm)

0𝑐𝑚
N-Heksan Rf : 4𝑐𝑚 = 0

Pelarut : metanol (Bercak :

3,2cm)
3,2𝑐𝑚
Rf : = 0,8
4𝑐𝑚
Methanol

(Dipantau secara langsung)

Etil asetat

N-Heksan

Methanol

(Dipantau dengan sinar UV

pada panjang gelombang
254nm)
 Pita 2 Pita 2 (Biru) : Tidak murni,
Etil asetat karena timbul 2 bercak
Pelarut : Etil asetat

(Dipantau secara langsung)

(Dipantau dengan sinar UV pada

panjang gelombang 254nm)

3. KLT Dua Dimensi Non Polar

Pelarut : n-heksan : etil asetat
7 : 2
7
n-heksan : 9 𝑥 9𝑚𝐿 = 7𝑚𝐿
2
etil asetat : 9 𝑥 9𝑚𝐿 = 2𝑚𝐿

(Dipantau secara langsung)

Semi Polar
n-heksan : etil asetat
2 : 7
2
n-heksan : 𝑥 9𝑚𝐿 = 2𝑚𝐿
9
7
etil asetat : 9 𝑥 9𝑚𝐿 = 7𝑚𝐿

Pita 1
(Dipantau dengan sinar UV pada Jarak eluen 1 : 3cm
panjang gelombang 254nm) Elusi 1 : 0,8cm
 0,8𝑐𝑚
Rf : = 0,267
3𝑐𝑚

Jarak eluen 2 : 2,9cm

Elusi 2 : 2,5cm
2,5𝑐𝑚
Rf : 2,9𝑐𝑚 = 0,86

4. Spektrofotometri Hasil absorbansi sampel

V. Pembahasan
5.1 Skrining Fitokimia
Cabai jawa (Piper retrofractum Vahl) adalah jenis rempah yang masih
berkerabat dengan lada dan kemukus, termasuk dalam suku sirih-sirihan atau
Piperaceae. Nama lainnya adalah cabai jamu, cabai jawa atau cabai saja,
meskipun penyebutan terakhir ini akan rancu dengan cabai lainnya yaitu
Capsicum annuum. Adapun klasifikasi tumbuhan sirsak adalah sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Ordo : Piperales
Familia : Piperaceae
Genus : Piper
Spesies : P. retrofractum
(Syukur, 2002).
 Pada praktikum kali ini, bagian tumbuhan yang praktikan gunakan adalah
bagian buahnya. Hal ini dikarenakan banyak sekali manfaat yang terkandung
didalam buah cabe jawa. Cabe jawa dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai
pengobatan alternatif untuk mengobati sakit perut, masuk angina, beri-beri,
rematik, tekanan darah rendah, kolera, influenza, sakit kepala, bronchitis, dan
sesak nafas. Karena itu, cabe jawa banyak dibutuhkan sebagai bahan pembuatan
jamu tradisional dan obat pil/kapsul modern serta bahan campuran minuman.
Rasa pedasnya berasal dari senyawa piperin dengan kandungan sekitar 4,65
(Januwati, 2000).
Skrining fitokimia atau penapisan fitokimia merupakan analisis kualitatif
terhadap senyawa-senyawa metabolit sekunder. Suatu ekstrak dari bahan alam
terdiri atas berbagai macam metabolit sekunder yang berperan dalam aktivitas
biologinya. Senyawa-senyawa tersebut dapat diidentifikasi dengan pereaksi-
pereaksi yang mampu memberikan ciri khas dari setiap golongan dari metabolit
sekunder (Harborne,1987). Dalam tahapan skrining fitokimia, metode yang
digunakan harus memenuhi syarat-syarat seperti sederhana dan cepat,
menggunakan peralatan yang sedikit mungkin, selektif untuk kelompok tertentu
dan dapat memberikan informasi tambahan mengenai keberadaan suatu senyawa
yang sedang diperiksa.
Senyawa-senyawa yang akan diidentifikasi dengan uji pereaksi kimia pada
praktikum kali ini adalah senyawa golongan alkaloid, polifenolat, flavonoid,
saponin, antrakuinon, tanin, monoterpen, seskuiterpen, triterpenoid dan steroid.
Sampel yang digunakan adalah simplisia buah cabe jawa yang sudah dikecilkan
dan di gerus dalam mortir.
Pada pemeriksaan senyawa alkaloid, simplisia buah cabe jawa
ditambahkan larutan HCl 2N hal ini dimaksudkan agar larutan tersebut bersifat
asam sehingga alkaloid yang semua merupakan basa bebas berubah menjadi
bentuk garamnya kemudian disaring. Tujuan alkaloid dibuat menjadi bentuk
garamnya adalah agar senyawa-senyawa yang bersifat non polar dapat dipisahkan.
Kemudian larutan tersebut dibasakan menggunakan larutan amonia 10%, hal ini
bertujuan agar senyawa yang bersifat polar dapat dipisahkan. Selanjutnya
ditambahkan kloroform yang bersifat semipolar, hal ini bertujuan agar senyawa
non polar dan polar benar-benar tertarik dan kemudian dipipet sambil larutan
disaring. Filtrat kemudian ditambahkan HCl 2N, hal ini bertujuan agar filtrat
bersifat asam. Kemudian larutan tersebut dikocok kuat dan lapisan asamnya
dipipet. Proses penambahan larutan yang bersifat basa dan bersifat asam adalah
agar senyawa-senyawa yang bersifat polar dan non polar dapat tertarik sehingga
saat ditambahkan pereaksi maka hanya senyawa alkaloid saja yang dapat
terdeteksi untuk menghindari adanya hasil positif palsu. Lapisan asam tersebut
kemudian dibagi menjadi 3 bagian, pada bagian pertama ditambahkan pereaksi
Mayer, bagian kedua ditambahkan pereaksi Dragendorff dan bagian ketiga
digunakan sebagai blangko.
Pada bagian pertama saat ditambahkan pereaksi Mayer, di dalam larutan
menjadi bening kekeruhan dan timbul endapan putih. Hal tersebut dapat terjadi
karena nitrogen pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam Hg dari kalium
tetraiomerkurat (II) sehingga membentuk kompleks merkuri-alkaloid yang
mengendap (Marliana, 2005). Oleh karena itu saat ditambahkan pereaksi Mayer,
maka akan diperoleh hasil berupa larutan positif mengandung alkaloid. Pada
bagian kedua, larutan ditambahkan pereaksi Dragendorff, dan terjadi perubahan
pada larutan menjadi warna jingga-kekuningan. Hal ini dikarenakan nitrogen pada
alkaloid membentuk ikatan kovalen koordinat dengan bismuth (Marliana, 2005).
Sedangkan bagian tiga digunakan sebagai blangko yang berfungsi sebagai
pembanding.
Identifikasi selanjutnya adalah terhadap senyawa polifenolat. Senyawa
polifenolat merupakan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan dari adaptasi
tanaman terhadap kondisi stres lingkungan akibat sinar radiasi UV atau agresi
patogen. Saat ditambahkan larutan pereaksi besi (III) klorida maka larutan yang
merupakan campuran antara simplisia dengan air yang telah dipanaskan dan
disaring akan berubah warna menjadi hijau. Hal tersebut karena senyawa
polifenolat yang terdapat di dalam simplisia daun sirsak bereaksi dengan pereaksi
besi (III) klorida.
 Uji selanjutnya adalah uji senyawa flavonoid, simplisia ditambahkan air
panas. Hal tersebut bertujuan agar senyawa-senyawa yang terdapat di dalam
simplisia dapat tertarik dan didihkan selama 10 menit dengan tujuan untuk
memaksimalkan proses penarikan senyawa-senyawa. Kemudian larutan tersebut
disaring untuk dipisahkan dari serbuknya dan ditandai sebagai larutan C untuk
pengujian senyawa flavonoid, saponin dan antrakuinon. Kemudian paa larutan C
untuk pengujian senyawa flavonoid, ditambahkan serbuk magnesium dan HCl
pekat. Lalu ditambahkan amilalkohol, dan dikocok kuat. Hal tersebut bertujuan
agar senyawa flavonoid dapat tertarik dan terdapat pada lapisan amilalkohol.
Adanya kandungan senyawa flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna pada
lapisan amilalkohol. Berdasarkan hasil percobaan uji senyawa flavonoid
menunjukkan hasil positif.
Pengujian selanjutnya adalah uji senyawa saponin. Larutan C untuk
pengujian saponin dimasukkan kedalam tabung reaksi dan dikocok secara vertikal
selama 10 menit. Pengujian inin dilakukan secara duplo. Pengocokan bertujuan
untuk mengetahui adanya kandungan saponin yang ditandai dengan terbentuknya
busa setinggi 1 cm. Berdasarkan hasil pengocokan, dalam larutan C memang
terdapat busa namun hanya sebentar sehingga pengujian ini menghasilkan hasil
yang negatif. Hal tersebut dikarenakan apabila suatu simplisia positif mengandung
saponin maka tinggi busa harus 1 cm dan busa tersebut bersifat stabil.
Senyawa yang diuji selanjutnya adalah senyawa antrakuinon. Suatu
simplisia dikatakan positif mengandung antrakuinon apabila saat ditambahkan
beberapa tetes NaOH maka adanya warna kuning hingga merah. Berdasarkan
hasil percobaan, larutan c terbentuk warna kuning kemerahan. Hal ini
menandakan bahwa cabe jawa mengandung senyawa antrakuinon.
Selanjutnya dilakukan pengujian terhadap senyawa tanin. Saat filtrat hasil
penarikan senyawa menggunakan air panas dan proses pendidihan selama 15
menit dibagi menjadi 3 bagian. Pada tabung 1 ditambahkan larutan besi (III)
klorida 1% tidak terbentuk warna biru tua atau hitam kehijauan. Hal tersebut
menunjukkan bahwa simplisia cabe jawa negatif atau tidak mengandung senyawa
tanin. Reaksi perubahan warna tersebut merupakan reaksi khusus untuk golongan
fenol. Tanin termasuk golongan fenol sehingga dapat diuji menggunakan metode
ini. Perubahan warna tersebut dapat terjadi karena apabila Fe terikat dengan tanin
maka akan menghasilkan warna yang spesifik karena gugus hidroksil
berkonjugasi dengan ikatan rangkap (Robinson, 1995). Sedangkan pada tabung 2
dan 3 juga sama tidak menunjukkan adanya kandungan tanin. Hal ini
menunjukkan bahwa tanin yang terkandung didalam cabe jawa tidak spesifik
berupa tanin galat dan tanin katekat.
Pengujian selanjutnya adalah pengujian kandungan senyawa monoterpen
dan seskuiterpen. Pengujian tersebut dilakukan dengan cara simplisia digerus
dengan eter lalu disaring. Kemudian filtrat ditempatkan di cawan penguap dan
dibiarkan menguap sampai kering. Kemudian ke dalam filtrat ditambahkan larutan
vanilin 1% dalam H2SO4 pekat. Kemudian pada filtrat timbul warna hitam pekat
sehingga dapat diperoleh hasil bahwa simplisia cabe jawa mengandung senyawa
monoterpen. Proses penggerusan simplisia menggunakan eter bertujuan agar
senyawa monoterpen dan seskuiterpen dapat tertarik keluar dari simplisia dan
dilakukan proses penggerusan adalah untuk mempercepat proses tersebut.
Pengujian yang terakhir adalah pengujian senyawa triterpenoid dan
steroid. Pada awalnya simplisia digerus dengan eter kemudian disaring. Lalu
filtrat ditempatkan di dalam cawan penguap dan dibiarkan hingga kering. Lalu
ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard. Hasil yang diperoleh adalah
timbulnya warna hijau kehitaman sehingga dapat diketahui bahwa di dalam cabe
jawa terdapat senyawa steroid. Sedangkan untuk triterpenoid menghasilkan hasil
positif. Hal tersebut menunjukkan bahwa cabe jawa positif mengandung
triterpenoid.
Berdasarkan hasil pengujian, simplisia cabe jawa positif mengandung
alkaloid, polifenolat, flavonoid, antarkuinon, monoterpena dan seskuiterpena,
serta triterpenoid dan steroid. Tetapi simplisia cabe jawa negative mengandung
saponin dan tanin.
5.2 Ekstraksi
Ekstraksi adalah pemisahan suatu zat dari campurannya dengan
pembagian sebuah zat terlarut antara dua pelarut yang tidak dapat tercampur untuk
mengambil zat terlarut tersebut dari satu pelarut ke pelarut yang lain. Seringkali
campuran bahan padat dan cair (misalnya bahan alami) tidak dapat atau sukar
sekali dipisahkan dengan metode pemisahan mekanis. Misalnya saja, karena
komponennya saling bercampur dengan sangat erat, peka terhadap panas, beda
sifat-sifat fisiknya terlalu kecil, atau tersedia dalam konsentrasi yang terlalu
rendah (Christian, 2004).
Simplisia yang digunakan pada tahapan ekstraksi percobaan ini, adalah
bagian buah dari cabe jawa yang berupa padatan, maka dari itu, metode ekstraksi
yang digunakan adalah ekstraksi padat-cair. Adapun mekanisme dari
proses ekstraksi padat cair: pertama, terjadi perpindahan solven dari larutan ke
permukaan solid (adsorpsi), diikuti dengan difusi solven ke dalam solid dan
pelarutan solut oleh solven, kemudian difusi ikatan solut-solven ke permukaan
solid, dan desorpsi campuran solut-solven dari permukaan solid kedalam badan
pelarut. Pada umumnya perpindahan solven ke permukaan terjadi sangat cepat di
mana berlangsung pada saat terjadi kontak antara solid dan solvent, sehingga
kecepatan difusi campuran solut-solven ke permukaan solid merupakan tahapan
yang mengontrol keseluruhan proses ekstraksi padat-cair. Kecepatan difusi ini
tergantung pada beberapa faktor yaitu: temperatur, luas permukaan partikel,
pelarut, perbandingan solut dan solven, kecepatan dan lama pengadukan. Untuk
memisahkan minyak dari pelarutnya, dilakukan dengan cara distilasi (Pramudono
dkk, 2008).

5.2.1 Maserasi
Metode ekstraksi padat-cair ini, digunakan dengan salah satu cara dingin
yaitu: maserasi. Metode maserasi merupakan metode perendaman sampel dengan
pelarut organik, umumnya digunakan pelarut organik dengan molekul relatif kecil
dan perlakuan pada temperatur ruangan, agar pelarut mudah terdistribusi ke dalam
sel tumbuhan. Metode maserasi ini sangat menguntungkan karena maserasi akan
memberikan efektivitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa
bahan alam dalam pelarut akibat kontak langsung dan waktu yang cukup lama
dengan sampel (Djarwis, 2004).
Tahapan pertama yang dilakukan dalam proses ekstraksi dengan cara
maserasi ini, yaitu: alat maserator terlebih dahulu dipastikan bersih, kemudian alat
maserator dibilas dengan etanol secukupnya. Hal ini, bertujuan agar tidak ada
pengotor pada alat yang dapat mempengaruhi hasil dari ekstrak yang diperoleh.
Setelah alat maserator dipastikan bersih, dipasangkan sumbat kapas pada bagian
bawah alat maserator, dipasangkan juga kertas saring yang diameternya telah
disesuaikan dan diatas kertas saring tersebut ditutupi kembali menggunakan
kapas. Pemasangan kapas dan kertas saring ini bertujuan agar saat mengambil
filtrat dari bawah alat maserator, simplisia tersaring dan hanya filtrat nya saja
yang tertampung.
Simplisia buah cabe jawa sebelum dimasukan ke dalam alat maserator,
terlebih dahulu ditumbuk kasar, tujuannya untuk memperoleh filtrat dalam jumlah
banyak, karena semakin kecil ukuran partikel maka akan semakin luas permukaan
dari simplisia yang kontak dengan pelarut, sehingga senyawa yang tertarik akan
semakin banyak. Akan tetapi simplisia tidak boleh ditumbuk terlalu halus, karena
jika simplsia terlalu halus, simplisia akan ikut tersaring pada saat proses ekstraksi.
Lalu, kedalamnya ditambahkan pelarut organik berupa etanol secara perlahan
sampai simplisia dalam alat maserator terendam. Jumlah etanol yang digunakan
sebanyak 600 mL. Pada proses ini, pelarut yang digunakan adalah etanol karena
etanol bersifat universal yang artinya dapat menyari zat yang sifat kepolarannya
relatif tinggi sampai yang relatif rendah. Selain itu, etanol tidak menyebabkan
pembengkakan membran sel dan efektif dalam menghasilkan jumlah bahan aktif
yang optimal(Argianti,dkk.2015). Kemudian pada bagian atas alat maserator,
ditutup menggunakan alumunium foil agar pelarut yang digunakan untuk
merendam simplisia tidak mudah menguap.
Perendaman simplisia buah cabe jawa dilakukan selama 48 jam dan tiap
24 jam, filtrat ditampung dan ditambahkan kembali pelarut, pada 24 jam kedua,
jumlah pelarut yang ditambahkan sebanyak 500 mL. Selain itu, selama proses
perendaman, campuran sesekali diaduk ini dilakukan agar memperoleh hasil filtrat
yang maksimal. Kemudian saluran pada bagian bawah maserator dibuka dan
filtrat ditampung dalam botol kaca.

5.2.2 Pemekatan Ekstrak

Tahapan kedua dari proses ekstraksi pada percobaan kali ini, yaitu
menggunakan alat vacuum rotary evaporator. Vaccuum Rotary Evaporator adalah
alat yang berfungsi untuk memisahkan suatu larutan dari pelarutnya sehingga
dihasilkan ekstrak dengan kandungan kimia. Cairan yang akan diuapkan biasanya
ditempatkan dalam suatu labu yang kemudian dipanaskan dengan bantuan
penangas, dan diputar. Uap cairan yang dihasilkan didinginkan oleh suatu
pendingin (kondensor) dan ditampung pada suatu tempat (receiver flask).
Kecepatan alat ini dalam melakukan evaporasi sangat cepat, terutama bila dibantu
oleh vakum. Kelebihan lainnya dari alat ini adalah diperolehnya kembali pelarut
yang diuapkan.
Adapun prinsip kerja alat ini didasarkan pada titik didih pelarut dan
adanya tekanan yang menyebabkan uap dari pelarut terkumpul di atas, serta
adanya kondensor (suhu dingin) yang menyebabkan uap ini mengembun dan
akhirnya jatuh ke tabung penerima (receiver flask). Setelah pelarutnya diuapkan,
akan dihasilkan ekstrak yang dapat berbentuk padatan (solid) atau cairan (liquid)
(Nugroho, et al. 1999).
Tahapan pemekatannya, pertama labu alat rotary evaporator dipastikan
bersih da kering terlebih dahulu, kemudian labu dibilas oleh sedikit ekstrak agar
yang tersisa dalam labu hanya filtrat saja, tidak ada zat pengotor lainnya. Sebelum
labu dipasangkan ke alat, dioleskan sedikit vaselin pada bagian.... untuk
mempermudah pelepasan labu dari alat rotary evaporator. Kemudian filtrat yang
akan dipekatkan, dimasukan ke dalam labu hingga labu terisi setengahnya,
pasangkan labu ke alat rotary evaporator dan dan jalankan alat dengan suhu
waterbath yang digunakan sekitar 30°C-40°C. Prosedur ini dilakukan hingga
seluruh filtrat terpekatkan.
 Setelah seluruh filtrat terpekatkan, filtrat ditaruh di dalam cawan porselen
dan diuapkan kembali di atas waterbath hingga diperoleh ekstrak kental.
Sebelumnya, cawan yang berisi ditutup dengan alumunium foil dan diberi sedikit
lubang agar ekstrak yang diperoleh tidak terlalu kering. Karena simplisia yang
digunakan mengandung piperin, ekstrak yang diperoleh sulit mengental dan
terdapat banyak minyak, sehingga harus disimpan di dalam kulkas untuk
mendapat ekstrak yang cukup kental. Kemudian diperoleh hasil ekstrak kental
dari proses oemekatan ekstrak sebanyak:48,3762 gram. Dari hasil tersebut
didapatkan % rendemen ekstrak dari hasil perhitungan yaitu: 11,35%. Besar
kecilnya nilai rendemen, menunjukan keefektifan proses ekstraksi, efektifitas
proses ekstraksi dipengaruhi oleh jenis pelarut yang digunakan sebagai penyari,
ukuran partikel simplisia, metode dan waktu ekstraksi. Menurut literatur
Farmakope Herbal 2010, rendemen ekstrak kental cabe jawa tidak kurang dari
12%. Namun, rendeen yang dihasilkan dari percobaan ini hanya sebesar 11,35%.
Hasil tersebut masih menunjukan hasil rendemen ekstrak kental yang belum baik.
Hal tersebut dapat terjadi karena saat proses pemekatan, ekstrak yang diperoleh
tidak begitu kental yang diakibatkan oleh banyaknya komponen minyak yang
terdapat dalam ekstrak.

5.3 Pemantauan Ekstrak

Pemantauan ekstrak adalah suatu metode yang digunakan untuk memantau
ada tidaknya senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak daun
sirsak. Metode yang digunakan saat melakukan proses pemantauan ekstrak adalah
metode kromatografi. Kromatografi adalah suatu cara pemisahan dimana
komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan antara 2 fase, salah
satunya yang merupakan fase stasioner (diam) dan yang lainnya berupa fasa
gerak. Fase gerak dialirkan sepanjang fase diam, sedangkan fasa diam cenderung
menahan komponen campuran. Berdasarkan terikatnya suatu komponen pada fasa
diam dan perbedaan kelarutannya di dalam fasa gerak maka komponen-komponen
suatu campuran dapat dipisahkan, dimana komponen yang kurang larut dalam
fasa gerak atau yang lebih kuat teradsorpsi dalam fasa diam akan tertinggal,
sedangkan komponen yang lebih larut di dalam fasa gerak akan bergerak lebih
cepat (Khopkar, 2008).
Kromatografi yang digunakan adalah kromatografi lapis tipis. Hal tersebut
dikarenakan kromatografi lapis tipis merupakan metode yang umum dan paling
mudah digunakan untuk melakukan pemisahan. Waktu pemisahan yang
digunakan lebih cepat dan sensitive, dengan hanya membutuhkan sedikit sampel
untuk dapat terdeteksi serta memiliki daya resolusi yang tinggi. Kromatografi
lapis tipis adalah kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium
yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel atau bahan serbuk lainnya.
Pelat yang digunakan pada praktikum adalah pelat aluminium yang dilapisi silika
gel GF 254.
Pada percobaan kali ini sampel yang digunakan adalah ekstrak kental dari
cabe jawa hasil maserasi. Plat KLT yang akan digunakan terlebih dahulu diberi
batas atas dan bawah setinggi 1 cm. Hal ini bertujuan agar proses elusi dapat
berjalan baik karena tidak adanya pengaruh dari ekstrak yang dikhawatirkan
tercelup di dalam eluen dan perhitungan Rf dapat dipantau dengan baik.
Kemudian plat diaktivasi dengan cara dipanaskan di dalam oven bersuhu 1050C
selama 10 menit. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air yang dikhawatirkan
terperangkap di dalam plat KLT sehingga proses pemisahan dapat terjadi dengan
sempurna dan berlangsung dalam waktu yang lebih cepat.
Ekstrak kental hasil maserasi dilarutkan terlebih dahulu dengan etanol
secukupnya, tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer. Hal ini bertujuan agar
ektrak mudah untuk ditotolkan diatas pelat KLT. Etanol digunakan sebagai
pelarut dikarenakan etanol merupakan pelarut semipolar sehingga dapat
melarutkan senyawa polar dan non polar.
Bejana (chamber) terlebih dahulu dijenuhkan. Proses penjenuhan
dilakukan dengan cara chamber yang telah berisi eluen dimasukkan kertas saring
kemudian ditutup dengan kaca arloji. Penggunaan kertas saring berfungsi sebagai
penanda bahwa uap eluen telah memenuhi dinding chamber sehingga proses elusi
akan berjalan dengan baik. Saat proses penjenuhan chamber ditutup rapat karena
campuran kedua pelarut yang digunakan bersifat mudah menguap sehingga
apabila tidak ditutup maka dikhawatirkan pelarut akan habis karena menguap.
Selain itu posisi chamber saat dilakukan proses penjenuhan tidak boleh digeser
atau dipindah-pindah, dengan tujuan agar tekanan dalam larutan stabil dan tidak
terjadinya proses penguapan yang lebih cepat pada eluen yang bersifat volatil.
Plat KLT yang sudah diaktivasi kemudian dikeluarkan dari oven dan
dibiarkan dingin di suhu ruang. Proses pendinginan tersebut bertujuan untuk
mencegah rusaknya senyawa-senyawa yang terdapat dalam ekstrak akibat kondisi
plat KLT yang masih panas. Selanjutnya ekstrak yang telah dilarutkan dengan
etanol ditotolkan pada plat KLT menggunakan pipa kapiler dan dibiarkan
mengering. Kemudian plat KLT tersebut dimasukkan ke dalam chamber yang
telah dijenuhkan oleh eluen. dielusi hingga mencapai tanda batas. Elusi dilakukan
menggunakan beberapa eluen dengan perbandingan yang berbeda. Eluen pertama
yang digunakan ada n-heksan dan kloroform dengan perbandingan 0,5 : 3,5, eluen
kedua ada toluena : etil asetat dengan perbandingan 7 : 3, eluen ketiga yaitu n-
heksan sebanyak 5 mL. Hal ini dilakukan dengan tujuan untuk melihat dengan
eluen mana terjadi pemisahan yang paling baik. Bila eluen terlalu polar, bercak
akan berada pada posisi paling atas dan nilai Rf besar. Sedangkan apabila eluen
terlalu non polar maka bercak akan berada pada posisi paling bawah plat sehingga
nilai Rf kecil. Nilai Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada
kromatogram. Nilai Rf merupakan perbandingan antara jarak senyawa dari titik
awal dan jarak tempuh pelarut dari titik awal.
Setelah elusi mencapai tanda batas, plat KLT kemudian dikeluarkan dari
chamber. Plat dibiarkan mengering dan selanjutnya dilihat warna bercak yang
timbul dibawah lampu UV dengan λ 254 nm dan 366 nm. Berdasarkan warna
bercak yang terlihat di bawah lampu UV diperoleh tinggi spot dari masing-masing
senyawa dengan eluen yang berbeda. Dari ketiga plat, diperoleh tinggi spot yang
berbeda. Setelah dianalisa tinggi spot yang paling baik diperoleh pada plat yang
dielusi dengan eluen n-heksan : kloroform dengan perbandingan 0,5 : 3,5. Hal
tersebut dikarenakan tinggi spot tersebut tidak terlalu tinggi juga tidak terlalu
rendah. Setelah dihitung nilai Rfnya, maka diperoleh hasil sebesar 0,62 dan 0,95.
 Bercak dilihat pada lampu UV dengan λ 254 nm dan 366 nm dimaksudkan
karena pada masing-masing panjang gelombang tampilan bercak akan berbeda.
Pada panjang gelombang 254 nm, plat akan berfluoresensi sedangkan sampel
akan tampak berwarna gelap. Bercak akan muncul dikarenakan adanya daya
interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada
lempeng. Sedangkan pada panjang gelombang 366 nm, noda akan berfluoresensi
dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda dapat terjadi karena adanya
daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh
auksokrom yang ada pada noda tersebut.

5.4 Fraksinasi
Fraksinasi Fraksinasi adalah proses pemisahan suatu kuantitas tertentu dari
campuran (padat, cair, terlarut, suspensi atau isotop) dibagi dalam beberapa
jumlah kecil (fraksi) komposisi perubahan menurut kelandaian. Pembagian atau
pemisahan ini didasarkan pada bobot dari tiap fraksi, fraksi yang lebih berat akan
berada paling dasar sedang fraksi yang lebih ringan akan berada diatas. Fraksinasi
bertingkat biasanya menggunakan pelarut organik seperti eter, aseton, benzena,
etanol, diklorometana, atau campuran pelarut tersebut. Asam lemak, asam resin,
lilin, tanin, dan zat warna adalah bahan yang penting dan dapat diekstraksi dengan
pelarut organik (Adijuwana dan Nur, 1989).
Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan yang bertujuan untuk
memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari kandungan yang lain.
Senyawa yang bersifat polar akan masuk ke pelarut polar dan senyawa non-polar
akan masuk ke pelarut non-polar. Dari proses graksinasi, dapat diduga sifat
kepolaran dari senyawa yang akan dipisahkan (Adijuwana dan Nur, 1989).
Fraksinasi bertingkat umumnya diawali dengan pelarut yang kurang polar
dan dilanjutkan dengan pelarut yang lebih polar. Tingkat polaritas pelarut dapat
ditentukan dari nilai konstanta dielektrik pelarut. Emapat tahapan fraksinasi
bertingkat dengan menggunakan empat macam pelarut yaitu:
1. ekstraksi aseton
2. fraksinasi n-heksan
 3. fraksinasi etil eter
4. fraksinasi etil asetat
(Lestari dan Pari, 1990).

Ekstraksi cair-cair digunakan untuk memisahkan senyawa atas dasar

perbedaan kelarutan pada dua jenis pelarut yang berbeda yang tidak saling
bercampur. Jika analit berada dalam pelarut anorganik, maka pelarut yang
digunakan adalah pelarut organik, dan sebaliknya (Khamidinal, 2009).
Pada metode ekstraksi cair-cair, ekstraksi dapat dilakukan dengan cara
bertahap (batch) atau dengan cara kontinyu. Cara paling sederhana dan banyak
dilakukan adalah ekstraksi bertahap. Tekniknya cukup dengan menambahkan
pelarut pengekstrak yang tidak bercampur dengan pelarut pertama melalui corong
pemisah, kemudian dilakukan pengocokan sampai terjadi kesetimbangan
konsentrasi solut pada kedua pelarut. Setelah didiamkan beberapa saat akan
terbentuk dua lapisan dan lapisan yang berada di bawah dengan kerapatan lebih
besar dapat dipisahkan untuk dilakukan analisis selanjutnya (Khamidinal, 2009).
Ekstrak kental hasil ekstraksi dan yang sudah dilakukan proses
pemantauan ekstrak menggunakan KLT selanjutnya dilakukan proses fraksinasi,
ekstrak yang dihasilkan dari proses ekstraksi biasanya masih mengandung banyak
senyawa baik itu senyawa yang besifat polar, semi polar maupun non pola.
Dilakukan frkasinasi dengan tujuan untuk memisahkan ssenyawa-senyawa yang
terkandung dalam ekstrak berdasarkan kepolarannya. Teknik fraksinasi dilakukan
dengan menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran berbeda. Metode yang
digunakan adalah Ekstraksi Cair-Cair (ECC), metode ini merupakan meode yang
paling umum digunakan karena prosesnya yang sangat sederhana. Pada ekstraksi
cair-cair digunakan 2 pelarut yang tidak saling tercampurkan karena prinsipnya
like dissolve like maka suatu senyawa akan lebih larut atau tertarik dalam pelarut
yang memiliki sifat mirip.
Pelarut yang digunakan dalam ECC selalu dimulai dari pelarut yang
memiliki kepolaran yang rendah atau nonpolar, kemudian dilanjutkan dengan
pelarut semi polar dan polar. Hal ini dilakukan untuk mencegah senyawa dapat
larut atau tertarik seluruhnya pada salah satu sifat pelarut saja, sehingga apabila
proses ECC digunakan pelarut semi polar dan polar terlebih dahulu dan
pengocokannya terlalu kuat kemungkinan besar semua senyawa dapat larut atau
tertarik dalam pelarut semi polar tersebut.
Ekstrak kental yang didapat pertama kali dilarutkan terlebih dahulu
dengan sedikit demi sedikit air panas dan setelah dapat larut kemudian
digenapkan 100 ml dengan air panas dan dimasukkan kedalam corong pisah,
ditambahkan N-heksan terlebih dahulu dan dikocok sekitar 15 menit. Fraksi N-
heksan diambil dan diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator. Fraksi air
ditambahkan etilasetat dan dikocok kembali 15 menit, fraksi etil asetat diambil
dan diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator. Diuapkan dengan rotary
evaporator bertujuan untuk mendapatkan fraksi yang lebih kental, dengan kata
lain hanya sedikit terdapat pelarut dari fraksi tersebut. Prinsip rotary evaporator
terletak pada penurunan tekanan pada labu bundar dan pemutaran labu bundar
sehingga pelarut dapat menguap lebih cepat dibawah titik didihnya.
Proses ECC dilakukan sebanyak 4 kali, sedangkan fraksi yang diperlukan
untuk proses kromatografi kolom minimal 1 gram. Maka pada proses ECC yang
dilakukan menggunakan n-heksan dua kali dan etil asetat 2 kali. Fraksi kental
yang telah didapat selanjutnya dilakukan pemantauan fraksi dengan KLT,
pemantauan ini dilakukan untuk memastikan kesesuaian bercak yang timbul
dengan bercak saat pemantauan ekstrak. Pada fraksi n-heksan terdiri dari dua
bercak, Rf bercak ke-1 yaitu 0,682 dan Rf bercak ke-2 yaitu 0,926, sedangkan
pada fraksi etil asetat terdiri dari dua bercak dengan Rf ke-1 yaitu 0,75 dan Rf ke-
2 yaitu 0,95. Eluen yang digunakan untuk melakukan pemantauan fraksi n-heksan
adalah n-heksan dan klorofrom dengan perbandingan 0,5:3,5 sedangkan untuk
fraksi etik asetat adalah toluene dan etil asetat dengan perbandingan 7:3. Fraksi
yang kental selanjutnya dilakukan proses sub fraksinasi.
Subfraksinasi merupakan fraksinasi terhadap fraksi yang telah didapatkan,
dari proses subfraksinasi ini akan dihasilkan subfraksi-subfraksi dengan
kandungan senyawa yang lebih sedikit dibandingkan fraksinasi namun
mendapatkan hasil yang lebih murni. Subfraksinasi dapat dilakukan dengan
metode yang sama dengan sebelumnya ataupun metode fraksinasi lainnya.
Metode subfraksinasi yang digunakan oleh praktikan adalah Kromatografi Kolom
Klasik (KK). Kromatografi merupakan teknik pemisahan campuran komponen
berdasarkan migrasi komponen-komponen tersebut dari fase diam oleh pengaruh
fase gerak. Fase diam dalam kromatografi kolom klasik adalah silika gel 60, silika
gel tipe ini memiliki ukuran partikel lebih besar dibandingkan dengan silika gel
untuk Kromatografi Cair Vacum (KCV) karena pada kromatografi kolom klasik
ini hanya mengandalkan gaya gravitasi berbeda dengan KCV yang mendapat
bantuan lagi dari vacum, sehingga pada kromatografi kolom klasik ini tidak
khawatir mendapat hasil yang kurang murni.
Kolom yang akan digunakan dalam kromatografi disumbat terlebih dahulu
ujungnya dengan menggunakan kapas bebas lemak, hal ini dilakukan dengan
tujuan sebagai penyangga agar tidak ada silika gel yang ikut keluar. Silika gel 60
yang telah buat bubur silika dimasukkan kedalam kolom dan diberi kertas saring
diatasnya kemudian dimasukan fraksi yang telah diserbukan. Ditambahkan eluen
secara perlahan secara berurutan sesuai seri campuran pelarut yang telah dibuat.
Seri campuran pelarut yang dijadikan sebagai eluen ialah :
N-Heksan (mL) Etil asetat (mL) Metanol (mL)
20 0 0
12 8 0
8 12 0
0 20 0
0 12 8
0 8 12
0 0 20
0 0 20

Hasil kromatografi ini disebut dengan subfraksi, subfraksi ditampung per 5

mL pada setiap vialnya. Vial yang didapat dari keseluruhan eluen adalah 15.
Kemudian dari 15 vial ditentukan subfraksi mana yang akan digunakan untuk
KLT preparatif dengan cara KLT.
 Pemantauan subfraksi ini dilakukan dengan cara menghitung Rf dari tiap
vialnya dan dibandingkan dengan Rf saat pemantauan ekstrak. Berdasarkan hasil
pengamatan subfraksi vial 1-10 tidak digunakan. Berdasarkan perhitungan dan
pengamatan spot dibawah lampu UV maka hanya vial 11, 12, 13 yang mendekati
Rf fraksi n-heksan sedangkan vial 14 digunakan untuk cuci kristal. Rf fraksi n-
heksan yaitu 0,5 dari vial 11, 12, 13. Sehingga vial yang akan digunakan dalam
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif adalah vial 11, 12, dan 13.

5.5 Teknik Pemisahan dan Pemurnian

Untuk memperoleh senyawa murni, kita harus memisahkan dari
campurannya untuk mendapatkan senyawa murni, dilakukanlah suatu teknik yang
dapat memisahkan antar zat murni dengan bahan-bahan pengotor atau pencampur
lainnya pada suatu campuran yakni pemisahan dan pemurnian.
Pemisahan dan pemurnian merupakan suatu cara yang dilakukan untuk
memisahkan atau memurnikan suatu ssenyawa atau sekelompok senyawa yang
mempunyai susunan kimia yang berkaitan dari suatu bahan, baik dalam skala
laboratorium maupun skala industri. Pada prinsipnya, pemisahan dilakukan untuk
memisahkan dua zat atau lebih yang saling bercampur, sedangkan pemurnian
dilakukan untuk mendapatkan zat murni dari suatu zat yang telah tercemar oleh
zat lain (Sumar Hendayana, 2006: 2).
Pemisahan dan pemurnian suatu zat yang mengalami campuran atau
tercemar dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu penyaringan (filtrasi),
sentrifugasi, penguapan (evaporasi), kristalisasi, pelarutan, dan kromatografi
preparatif (Sumar Hendayana, 2006: 2).
Pada praktikum teknik pemisahan dan pemurnian kali ini menggunakan
cara KLT Preparatif dimana dapat digunakan untuk memisahkan bahan dalam
jumlah gram, namun sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah
milligram. Prinsip kerja dari metode kromatografi lapis tipis preparatif adalah
proses isolasi berdasarkan perbedaan daya serapdengan kecepatan yang berbeda
sehingga terjadi pemisahan. Seperti halnya KLT secara umum, KLT Preparatif
juga melibatkan fase diam dan fase gerak. Dimana penyangganya adalah plat
khusus KLT preparatif. Untuk jumlah sampel 10-100 mg, dapat dipisahkan
dengan mengunakan KLT Preparatif dengan fase diam silika gel atau aluminium
oksida. Jika tebalnya di dua kalikan, maka banyaknya sampel yang dapat
dipisahkan bertambah 50%. Seperti halnya KLT biasa, fase diam yang paling
umum digunakan pada KLT Preparatif adalah silika gel. Pada praktikum kali ini
silika gel yang diguanakan adalah silika gel GF 254. Artinya silika terbuat dari
gipsum yang dapat menempel pada dinding chamber dan dapat menangkap
cahaya pada gelombang 254 dan 366 nm (Diana, 2013: 16).
Sebelum dilakukan KLT preparatif, fraksi yang telah memiliki senyawa
target yaitu vial no. 11, 12 dan 13 disatukan dan diuapkan kembali supaya
mendapatkan fraksi yang lebih kental. Setelah itu dilakukan simulasi KLT
preparatif dengan KLT analitik berukuran 20 cm x 20 cm. Mula – mula plat KLT
diberi garis pada bagian ujung bawah dan atas dengan jarak 1 cm sebagai penanda
agar spot yang kita totolkan pada plat KLT preparatif tidak terendam eluen dan
membiaskan hasil. Setelah diberi tanda, plat tersebut di aktivasi selama 15 menit
dengan suhu 105 °C hal tersebut dilakukan untuk menghilangkan air yang
terdapat pada plat. Eluen yang digunakan yaitu n – heksan dan etil asetat sebanyak
50 ml dengan perbandingan 0,5 : 3,5. Subfraksi kemudian ditotolkan pada plat
KLT Preparatif dengan membentuk garis lurus / pita untuk memudahkan dalam
pengamatan dan pengerokan senyawa yang akan diambil.
Sebelum KLT preparatif dimasukan ke dalam chamber, terlebih dahulu
chamber dijenuhkan dengan eluen yang akan dipakai dan menggunakan kertas
saring. Fungsi dari penjenuhan chamber adalah untuk menghilangkan lapisan
udara pada chamber agar proses elusi dalam pemisahan berjalan secara sempurna.
Kertas saring digunakan sebagai indikator untuk melihat jenuhnya chamber oleh
eluen. Setelah chamber tersebut jenuh, subfraksi yang telah diuapkan, ditotolkan
sepanjang 20 cm tanpa putus membentuk pita, pada saat penotolan tidak boleh
terjadi pemutusan karena dapat mengganggu proses pemisahan.
Selanjutnya plat KLT tersebut dimasukkan ke dalam chamber yang telah
diisi oleh eluen n-heksan dan etilasetat sebanyak 50 mL dengan perbandingan 0,5
: 3,5. Eluen yang digunakan adalah n-heksan : etilasetat karena eluen tersebut
dapat membawa sampel terpisah ketika dimasukkan ke dalam chamber. Elusi
dibiarkan berjalan hingga eluen mencapai batas garis atas plat KLT yang ada di
dalam chamber ditunggu sampai eluen terangkat hingga mencapai batas atas plat
KLT.
Plat yang telah dilewati eluen tersebut, kemudian dikeluarkan dan
dibiarkan mengering, kemudian di lihat di bawah sinar lampu UV agar noda yang
tercetak pada plat terlihat dengan jelas. Panjang gelombang UV yang digunakan
adalah 245 nm dan 366 nm. Panjang gelombang 254 nm merupakan panjang
gelombang yang paling cocok karena dengan panjang gelombang ini noda pada
plat dapat terlihat jelas. Pita noda yang terbentuk ditandai dengan pensil agar lebih
jelas dalam memisahkan noda. Pita noda tersebut merupakan senyawa yang
berhasil dipisahkan dan selanjutnya akan dimurnikan serta diidentifikasi. Pada UV
366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan
noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV
dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut.
Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh
komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke
tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil
melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat
terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi pada sinar UV 366
nm (Sudjadi, 1986: 46).
Setelah didapat beberapa pita noda, dipilihlah 2 pita noda senyawa yang
akan diambil. Pita yang diambil yaitu pita yang memiliki warna lebih dominan,
diantaranya pita 1 berwarna merah dan pita 2 berwarna biru. Hal tersebut
dikarenakan bahwa pita yang memiliki warna yang paling pekat berarti pita
tersebut memiliki senyawa yang banyak terdapat pada sampel cabe jawa,
kemudian noda tersebut dikerok, dihaluskan dan diletakkan dalam vial kemudian
dilarutkan dengan metanol 5 ml. Hasil isolat yang telah dilarutkan dengan metanol
lalu disaring untuk memisahkan silika gel dengan senyawa kuning hasil KLT
preparatif. Hal ini bertujuan agar tidak ada lagi senyawa pengotor yang di dapat
setelah KLT preparatif sehingga hanya terdapat satu isolat saja.
5.6 Uji Kemurnian
Pada pengujian kemurnian ini, dilakukan uji kemurnian menggunakan
pengujian titik leleh, KLT satu dimensi,dan dua dimensi. Uji kemurnian dilakukan
untuk meguji atau memastikan bahwa isolat yang dihasilkan mengandung
senyawa murni dan tidak terkontaminasi oleh senyawa lain yang tidak diharapkan.
Pengujian rentang Titik leleh digunakan untuk melihat akan keberadaan
suatu pengotor atau kontaminan pada kristal senyawa.Suatu senyawa murni akan
memiliki rentang titik lebur yang pendek.Sampel senyawa murni biasanya hanya
terdiri atas satu bentuk kristal dan meleleh pada temperatur kurang dari 1oC.Besar
daerah titik atau range lebih 1oC.Besar daerah titik leleh atau range lebih 1oC
menunjukkan adanya pengotor (Martin, 1990).
Pada pengujian rentang titik leleh, kristal sampel diserbukkan agar mudah
dimasukkan kedalam pipa kapiler,kemudian pipa kapiler dimasukkan ke alat
melting point lalu diamati perubahan yang akan terjadi ketika suhu dinaikan
dengan melihat rentang titih leleh mulai dari serbuk kristal pertama kali meleleh
sampai semua serbuk kristal berubah menjadi cair.Berdasarkan pengamatan
didapat rentang titik leleh pada kristal 1(n-heksan) adalah 132-134oC dan pada
kristal 2 (kloroform) adalah 115-127oC.Dari hasil yang didapat menunjukkan
bahwa hanya kristal 1 (menggunakan pelarut n-heksan) yang mengandung
senyawa murni dikarenakan rentang titik lelehnya tidak lebih dari 2oC.
KLT satu dimensi digunakan untuk menguji kemurnian suatu isolat
berdasarkan pada sifat kepolaran senyawa dalam isolat tersebut
(Sastrohamidjojo,1996). Suatu isolat murni hanya akan memberikan satu bercak
pada semua hasil pengembangan dengan semua eluen.
KLT Dua Dimensi adalah cara yang memungkinkan pemakaian lapisan
fase diam yang lebih luas untuk memisahkan campuran yang mengandung banyak
komponen. Selain itu, dua sistem pelarut yang sangat berbeda dapat digunakan
secara berurutan pada campuran tertentu, jadi memungkinkan pemisahan
campuran yang mengandung komponen yang kepolarannya sangat berbeda.
Ekstrak ditotolkan dan dielusi seperti pada KLT normal kemudian diputar 90°
untuk pengembangan kedua (Gibbons, 2006).
KLT Dua Dimensi bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika
komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama,
karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino.
Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara
berurutan sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang
mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (Sastrohamidjojo,1996).
KLT satu dimensi dan KLT dua dimensi sama-sama dilakukan diatas plat
KLT silica gel dan proses pengerjaannya hampir sama dengan proses KLT
analitik, namun yang membedakan KLT 2 dimensi dengan KLT satu dimensi
tersebut yaitu pada KLT dua dimensi dilakukan 2 kali elusi/pengembangan karena
elusi nya harus membentuk dua dimensi.
Pada KLT satu dimensi terlebih dahulu isolat diuji dengan menggunakan
eluen non polar, kemudian semi polar, lalu terakhir polar. Eluen yang digunakan
yaitu n – heksan , etil asetat dan metanol yang masing-masing eluen ditempatkan
pada chamber yang berbeda. Teknik pengerjaannya sama seperti KLT analitik
biasa yaitu menjenuhkan chamber terlebih dahulu kemudian mengaktivasi plat
KLT yang digunakan. Hasil yang diperoleh pada pengujian pita 1 (merah)
terbentuk satu buah bercak pada plat yang dielusi oleh ketiga eluen yaitu n-
heksan,metanol,dan etil asetat.Sehingga menunjukkan bahwa isolat tersebut sudah
murni . Sedangkan pada pengujian pita 2 (Biru) terbentuk dua buah bercak pada
plat saat dielusi oleh etil asetat,sehingga menunjukkan bahwa tidak murni dan
masih ada pengotor didalamnya.
Selanjutnya dilakukan pengujian terhadap plat KLT dua dimensi.Dimana
prinsip kerjanya adsorpsi dan partisi dengan menggunakan lempeng GF 254
sebagai fase diam dan perbandingan eluen pada profil KLT dimana akan
memperpanjang lintasan noda (Rf) dengan menunjukkan senyawa tunggal yang
terdapat pada isolasi buah cabe jawa. Mekanisme kerjanya sama dengan cara
penggunaan plat KLT pada umunya. Namun pada pengujian ini mengelusi noda
pada 2 arah yang berbeda dan menggunakan eluen yang berbeda tapi hanya
menggunakan satu plat KLT saja. Fase gerak pertama terdiri dari n – heksan dan
etil asetat dengan perbandingan 7 : 2 sedangkan fase gerak kedua terdiri dari n –
heksan dan etil asetat dengan perbandingan 2 : 7. Sampel ditotolkan pada lempeng
lalu dikembangkan dengan satu sistem fase gerak pertama sehingga campuran
terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat,
dikeringkan dan diputar 90°, dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang
berisi fase gerak kedua, sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan
pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi
lagi.Kemudian hasil elusi diamati menggunakan sinar uv pada gelombang
254nm.Hasil pengamatan menunjukkan hanya terdapat satu bercak saja. Hal ini
dapat disimpulkan bahwa senyawa yang didapat telah murni.
Setelah dilakukan pengujian dengan KLT pengembangan tunggal dan 2
dimensi,kemudian sampel (hasil sub-fraksinasi) diuji menggunakan
spektrofotometri UV-Vis. Pengujian tersebut dilakukan supaya dapat diketahui
panjang gelombang maksimal yang terserap dalam sampel sehingga dapat
diketahui juga senyawa apa yang terkandung pada simplisia cabe jawa . Hal
pertama dilakukan yaitu dengan melarutkan isolat dengan larutan metanol,karena
metanol merupakan pelarut universal sehingga dapat melarutkan isolat,dimana
untuk dapat melakukan pengujian karakteristik menggunakan spektrofotometri uv
,isolat harus dalam keadaan cair agar nilai absorbansi tidak terlalu tinggi dan
Metanol juga digunakan sebagai blanko, dimana blanko digunakan untuk
mengetahui besarnya serapan oleh zat yang bukan analit dan juga sebagai
pembanding terhadap sampel yang akan diuji.Berdasarkan dari pengamatan pada
spektro didapat nilai absorbansi 0,309 dengan panjang gelombang 337 ,menurut
(markhan,1988) pada rentang panjang gelombang 310-350 menunjukkan
golongan flavon.berdasarkan data tersebut diduga simplisia buah cabe jawa
mengandung senyawa flavon dari golongan flavonoid,akan tetapi menurut
literatur senyawa tersebut tidak terkandung pada cabe jawa,flavon dapat terdeteksi
pada cabe jawa kemungkinan dikarenakan sampel yang di buat terlalu encer atau
masih terdapat banyak pengotor sehingga tidak menghasilkan senyawa yang
diinginkan.
VI. Kesimpulan
Pada percobaan kali ini dihasilkan, simplisia cabe jawa positif
mengandung alkaloid, polifenolat, flavonoid, antarkuinon, monoterpena dan
seskuiterpena, serta triterpenoid dan steroid. Tetapi simplisia cabe jawa negative
mengandung saponin dan tanin.
Pada proses ekstraksi, simplisia yang digunakan pada tahapan ini adalah
bagian buah dari cabe jawa(Retrofracti Fructus) yang berupa padatan, maka dari
itu, metode ekstraksi yang digunakan adalah ekstraksi padat-cair dengan maserasi
yang termasuk cara dingin. Pelarut yang digunakan pada proses ini adalah pelarut
organik berupa etanol. Proses perendaman dilakukan selama 2 hari, pada hari
pertama ditambahkan etanol untuk merendam simplisia sebanyak 600 mL dan
pada hari kedua sebanyak 500 mL, proses perendaman dilakukan selama 2 hari
bertujuan agar senyawa-senyawa yang terdapat pada simplisia benar-benar tertarik
dan terlarut dalam pelarut yang digunakan. Kemudian tahapan selanjutnya adalah
pemekatan ekstrak menggunakan alat vaccum rotary evaporator. Setelah
diperoleh ekstrak pekat dan diuapkan di atas waterbath hingga ekstrak mengental,
diperoleh hasil ekstrak kental sebanyak: 48,3762 gram dan % rendemen: 11,35%.
Nilai % rendemen yang diperoleh, tidak sesuai dengan literatur karena seharusnya
nilai % rendemen tidak kurang dari 12%. Hal tersebut dapat terjadi karena saat
proses pemekatan, ekstrak yang diperoleh tidak begitu kental yang diakibatkan
oleh banyaknya komponen minyak yang terdapat dalam ekstrak.
Pemantauan ekstrak dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi
lapis tipis berdasarkan terikatnya suatu komponen pada fasa diam dan perbedaan
kelarutannya di dalam fasa gerak sehingga komponen-komponen suatu campuran
dapat dipisahkan. Nilai Rf yang diperoleh dari 3 eluen yang berbeda adalah 0,62
dan 0,95 dengan menggunakan eluen n-heksan : kloroform (0,5:3,5). 0,75 dan
0,95 untuk eluen toluen : etil asetat (7:3), dan 0,72 untuk eluen n-heksan sebanyak
5 mL.
Proses ECC dilakukan sebanyak 4 kali, sedangkan fraksi yang diperlukan
untuk proses kromatografi kolom minimal 1 gram. Maka pada proses ECC yang
dilakukan menggunakan n-heksan dua kali dan etil asetat 2 kali. Fraksi kental
yang telah didapat selanjutnya dilakukan pemantauan fraksi dengan KLT. Pada
fraksi n-heksan terdiri dari dua bercak, Rf bercak ke-1 yaitu 0,682 dan Rf bercak
ke-2 yaitu 0,926, sedangkan pada fraksi etil asetat terdiri dari dua bercak dengan
Rf ke-1 yaitu 0,75 dan Rf ke-2 yaitu 0,95. Eluen yang digunakan untuk
melakukan pemantauan fraksi n-heksan adalah n-heksan dan klorofrom dengan
perbandingan 0,5:3,5 sedangkan untuk fraksi etik asetat adalah toluen dan etil
asetat dengan perbandingan 7:3. Fraksi yang kental selanjutnya dilakukan proses
sub fraksinasi. Hasil kromatografi ini disebut dengan subfraksi, subfraksi
ditampung per 5 mL pada setiap vialnya. Vial yang didapat dari keseluruhan eluen
adalah 15. Berdasarkan hasil pengamatan subfraksi vial 1-10 tidak digunakan.
Berdasarkan perhitungan dan pengamatan spot dibawah lampu UV maka hanya
vial 11, 12, 13 yang mendekati Rf fraksi n-heksan sedangkan vial 14 digunakan
untuk cuci kristal. Rf fraksi n-heksan yaitu 0,5 dari vial 11, 12, 13. Sehingga vial
yang akan digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis Preparatif adalah vial 11,
12, dan 13.
Dapat disimpulkan bahwa pada KLT preparatif diperoleh 2 pita noda yaitu
pita 1 (merah) dan pita 2 (biru) yang menunjukan warna yang dominan.
Berdasarkan hasil pengamatan yang didapat dapat disimpulkan bahwa senyawa
yang terdapat pada pita 1 (merah) merupakan senyawa yang murni hal tersebut
dibuktikan melalui pengujian klt pengembangan tunggal dan klt 2 dimensi hanya
terdapat satu bercak saja sedangkan pada pita 2 (Biru) senyawa yang terkandung
belum murni hal itu dibuktikan melalui uji klt pengembangan tunggal terdapat dua
bercak yang kemungkinan masih terdapat pengotor.
Pada pengamatan pengujian rentang titik leleh dapat disimpulkan bahwa
pada kristal 1(n-heksan) senyawa yang terkandung pada kristal tersebut
merupakan senyawa murni hal tersebut ditandai dengan rentang titik lelehnya
yang tidak melebihi 2oC.Sedangkan pada kristal 2 (Kloroform) senyawa yang
terkandung pada kristal tersebut belum murni hal tersebut ditandai dengan rentang
titik lelehnya yang jauh atau melebihi 2oC.
 Berdasarkan puncak yang diperoleh dari isolate cabe jawa melalui
spektofotometri UV – Vis, senyawa yang terkandung di dalam isolate cabe jawa
termasuk senyawa dari golongan flavonoid.

VII. Daftar Pustaka

Adijuwana, Nur M.A. (1989). Teknik Spektroskopi dalam Analisis Biologi. Bogor:
Pusat Antar Universitas IPB.
Christian, Gary D. (2004). Analitical Chemistry. New York: John Wiley and Sons.
Dirjen POM.(2008). Farmakope Herbal Indonesia Ed.I. Jakarta: Depkes RI.
Gibbon, J. (2006). Employee Engagement A Review of Current Research and Its
Implications. USA: The Conference Board.
Harborne, J. B. (1987). Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan, Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Imam Sudiro,
Edisi I. Bandung: ITB.
Hendayana, Sumar. (2006). Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan
Elektroforesis Modern. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya.
Januwati, M., M. Syai, dan M. Nasir. (2000). Budidaya tanaman cabe jawa (piper
retrofractum Vahl.). directorat Aneka Tanaman. Hal 2.
Khamidinal. (2009). Teknik Laboratorium Kimia. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Khopkar, S.M. (2008). Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.
Lestari SB, Pari G. (1990). Analisis kimia beberapa jenis kayu Indonesia. Bogor:
Pusat Antar Universitas IPB.
Markham, K.R., (1988). Cara Mengidentifikasi Flavonoid, diterjemahkan oleh
Kosasih Padmawinata, 15. Bandung: ITB.
Marliana, D. S., Venty, S, dan Suryono. 2005. Skrining Fitokimia dan Analisis
Kromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam dalam
Ekstrak Etanol. Jurnal Biofarmasi. 3(1) : 29.
Martin, A dkk. (1990). Farmasi Fisik. Jakarta: UI –Press.
Muliad, Diana S. (2013). Kromatografi Lapis Tipis Preparatif. Bandung: ITB.
Nugroho, B. W., Dadang, & Prijono, D. (1999). Pengembangan dan Pemanfaatan
Insektisida Alami. Bogor: Pusat Kajian Pengendalian Hama Terpadu, IPB.
Pramudono, B., S,A. Widioko dan W. Rustawan. (2008). Ekstraksi Kontinyu
dengan Simulasi BatchnTiga Tahun Aliran Lawan Arah: Pengambilan
Minyak Biji Alpuker Menggunakan Pelarut n-hexane dan Isopropil
Alkohol. Reaktor Vol. 12 Hal: 37-41. Semarang: UNDIP.
Putu Argianti M,dkk. (2015). Formulasi dan Evaluasi Kapsul Cabe Jawa(Piper
retrofractum Vahl). Jember: Universitas Jember.
Robinson, Trevor. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Edisi keenam.
Terjemahan Kosasih Padmawinata. Bandung: FMIPA ITB.
Sudjadi. (1986). Metode Pemisahan. Yogyakarta: UGM Press.
Syukur, C. dan Hernani. (2002). “Budi Daya Tanaman Obat Komersial”,
halaman 33. PT Penebar Swadaya.