Penemuan kasus Plasmodium

knowlesi dengan metode

biomolekuler

Badan Riset dan Inovasi Nasional

Malaria pada primata LOGO

Malaria pada manusia Malaria pada primata

P.falciparum Tipe vivax (Pv, P cynomolgy)

Tipe ovale (Po, P. fieldi, P simiovale )
P.vivax
Tipe malariae (Pm,iP. inui, P rodhaini
P.malariae )
Tipe falciparum
UGM (Pf, P. coatneyi)
P.ovale
UGM Mikroskopis
UNAIR
Tipe lain (P. knowlesi)
P.knowlesi
UNAIR
UNBRAW
UNBRAW Identifikasi malaria
UNHAS
mikroskopis
RDT
PCR
 LOGO
Primata non manusia

M. nemestrina M.fascicularis

M. mulatta
 LOGO
Zoonotic Malaria
 LOGO
Faktor Risiko Infeksi P.knowlesi

 Lokasi  daerah Kasus malaria rendah

atau telah eliminasi
 Pemukiman sekitar hutan & ada monyet
 Riwayat berkunjung ke sekitar hutan
 Mikroskopis  positif malaria, spesies
suspek P.knowlesi
 Persiapan Laboratorium
 Mikroskopis  Sediaan darah tipis dan tebal
 PCR  Kertas Whatman #3  dried blood spot
 SDM  terlatih
 LOGO
Identifikasi malaria Pk
 Mikroskopis
 Kepadatan rendah  dibawah ambang
mikroskopis  sulit
 Spesiasi Pk  sulit
 RDT
 Belum tersedia RDT untuk Pk
 Molekuler
 Deteksi di bawah ambang mikroskop
(senditifitas bervariasi)
 LOGO
Identifikasi Infeksi P.knowlesi
 Teknik PCR
 nested PCR (Singh B et al, 1999) yang terdiri dari 2
tahapan PCR  Meningkatkan spesifisitas amplifikasi DNA
dengan mengurangi background, yang disebabkan oleh
amplikasi DNA yang non spesifik  2 pasang primer
 Target gen species-specific sequences pada small- subunit
ribosomal RNA (SSUrR)
 Primer genus : rPLU1 dan rPLU5  rPLU3 dan rPLU4
 Genus Plasmodium (+)  Primer spesies spesifik Pk
(produk rPLU1 dan rPLU5)  kn1f - Kn3r

 Target gen  Imwong  khusus Pk

 Pk 1160 dan Pk 1150  Pk 1140 dan Pk 1150
 LOGO
Identifikasi Infeksi P.knowlesi
 Sampel
 DBS  darah jari, manajemen praktis dan aman
 Darah EDTA  darah vena  manajemen tidak mudah
 SD tebal  darah jari  ekstraksi kompleks

 Ruangan
 Preparasi sampel
 Preparasi Media  clean room
 Ruang amplifikasi, visualisasi dan produk PCR
 LOGO
Sampel PCR malaria

Sampel

whole blood
Dried blood spot Apus darah
(EDTA, Na citrat),
heparin
 LOGO
Identifikasi Infeksi P.knowlesi
 Alat yang dibutuhkan
 Ekstraksi DNA
• Microsentrifuge (14.000 rpm) dan sentrifuge tube steril (2 ml)
• Gunting, pinset, dan media ekstraksi (komersial), heat block
• DBS potong-potong, Column_QIAamp DNA Minikit
 Persiapan Media PCR  biosafety cabinet, mikropipet tersendiri
 Proses Amplifikasi  mesin PCR
 Elektroforesis
• Mesin Elfor
• Cetakan / comb agarose  agarose 2% dalam TE buffer
 Visualisasi  Gel doc
 LOGO
Identifikasi Spesies
PCR 1  genus Plasmodium (~ 1131 bp)
 rPLU 1 : TCA AAG ATT AAG CCA TGC AAG TGA
 rPLU 5 : CCT GTT GTTGCC TTA AAC TTC
PCR 2
 P.knowlesi
 Kn1F : CTC AAC ACG GGA AAA CTC ACT AGT TTA
 Kn3R: GTA TTA TTAGGT ACA AGG TAG CAG TAT GC
- P. falciparum (~ 206 bp)
 rFAL1 TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT
 rFAL2  ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC
 P. vivax (~205 bp)
 rVIV6  TAA CGC CGT TAG CTA GAT CCA CAA GG
 rVIV7 CTG TAG TAT TCA AAA CGC GCA ATG CTG
 P. malariae (~145 bp)
 rMAL1 ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC
 rMAL2 AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA
 P. ovale (~419 bp)
 rOVA1 ATC TCT TTT GCT ATT TTT TAG TAT TGG AGA
 rOVA4 ACT GAA GGA AGC AAT CTA AGA AAT TT
 LOGO
Identifikasi Spesies (Imwong)
1 st PCR
Pk 1160 F: 5’ GAT GCC TCC GCG TAT CGA C -3’
Pk 1150 R: 5’ TCT TTT CTC TCC GGA GAT TAG AAC TC-3’
2 nd PCR
Pk 1140 F: 5’ GAT TCA TCT AAT AAA AAT TTG CTT C-3’
Pk 1150 R: 5’ TCT TTT CTC TCC GGA GAT TAG AAC TC-3’

PCR kondisi
Pre denaturasi 950C (5 menit) diikuti dengan 30 siklus
550C (1 menit)
720C (1 menit)
940C (1 menit)
Terakhir 550C (1 menit)
720C (5 menit)
 LOGO
PCR  Kondisi program mesin

Pre- Post
Primers identifikasi denaturasi annealing elongation cycles
denaturasi elongation

rPLU1- 940C 940C 550C 720C 720C

Plasmodium 30
rPLU5
4 min 1 min 1min 2 min 5 min

940C 940C 620C 720C 720C

rpLU3-
Plasmodium 45
rPLU4
4 min 30 sec 30 sec 30 sec 5 min

kn1f - 940C 940C 620C 720C 720C

P knowlesi 35
Kn3r
4 min 30 sec 30 sec 30 sec 5 min
 LOGO
Amplifikasi
 LOGO
Hasil visualisasi  Dokumentasi
 Produk Amplifikasi  electrophoresis pada 2% agarose
gel  45 menit – 1 jam.
 Identifikasi hasil positif dinyatakan dengan pita
berukuran tertentu sesuai dengan control positif dan
juga ladder/marker.
 Ukuran pita dari tiap spesies Plasmodium berbeda
 P.knowlesi  adanya pita DNA sejajar kontrol positif
 P. knowlesi  295 bp.
 P. falciparum  206 bp
 P.vivax  121 bp
 P.malariae  145 bp
 P.ovale  419 bp
 LOGO
Interpretasi hasil PCR

 Produk Amplifikasi  electrophoresis pada 2%

agarose gel  45 menit – 1 jam.
 Identifikasi hasil positif dinyatakan dengan pita
berukuran tertentu sesuai dengan control positif dan
juga ladder/marker.
 Ukuran pita dari tiap spesies Plasmodium berbeda
 P knowlesi (295 bp)
 Hasil akhir --> dokumentasi
 LOGO
Hasil visualisasi
 LOGO
Hasil visualisasi P.knowlesi
 LOGO
Hasil visualisasi Pv dan Pm
 Gambar . Plasmodium species dengan teknik nested PCR
(M: 100 bp DNA marker, sk1: sample 1, sk2: sample 2, Pk: +ve control of Pk /295 bp
; DD2 and DD7: 3D7 culture /205 bp, Pv: +ve P. vivax /121 bp, Pm: +ve P. malariae
/145 bp and Po: +ve P. ovale/ 419 bp)
 LOGO
Kesimpulan
 Identifikasi malaria knowlesi dengan Teknik PCR
harus dilakukan bersamaan dengan pemeriksaan
mikroskopis  suspek Pk

 DBS  jenis sampel terpilih

 Primer Pk yang digunakan sesuai dengan target gen

dan tujuan pemeriksaan

 Waspada bagi penduduk (pekerja hutan) yang

bermukim di sekitar hutan dengan banyak monyet
LOGO