E

GEN TARGET S

PADA ANALISIS M
PCR-COVID19
Sukma Nuswantara N
 PERANGKAT PCR

Generasi III

Generasi II

Generasi I
CENTRAL DOGMA OF SARS-COV2
RUTINITAS LABORATORIUM PCR
EKSTRAKSI RNA SARS-CoV2

RT-PCR

ANALISIS
ONE STEP VS TWO STEP RT-PCR
 VARIASI KONTROL
• SARS-CoV-2
• Other non-Covid19: SARS-CoV,
etc
• RNAse P
• EAV (Equine Artritis Virus)
• House-keeping genes (GAPDH,
Ubiquitin, beta-actin, tubulin,dll)
• Cross-reactivity controls
CT value (Cycle Threshold)
CQ ( Cycle of Quantification)

• Titik potong antara # siklus

PCR, threshold dan RFU
• Nilai yang praktis untuk
menggambarkan jumlah virus
(tidak langsung) dg cara yang
singkat dan ekonomis
• PERHATIAN:
• Bukan skala absolut
• Sering berbeda nilainya untuk
mesin yang beda, kit/reagen
 FAKTOR YANG MEMENGARUHI NILAI CT
1. MASTER MIX PCR : pH dan konsentrasi garam mempengaruhi
fluorescensi
2. PASSIVE REFERENCE DYE (ROX) : Rasio antara reporter (FAM) dan
ROX bisa berubah
3. EFISIENSI REAKSI:
- Primer (spesifisitas, annealing temperature)
- Template terlalu minim
- Ekstraksi RNA sub-optimal
- Kualitas enzim reverse transcriptase & DNA polymerase
kurang
- Degradasi RNA/cDNA (mis. Multiple freeze-thaw)
- PCR inhibitor
SUSUNAN
GENOM
SARS-COV-S
 S protein –Ace2 Binding
PERANAN
TIAP GEN
DALAM SIKLUS
SARS-COV-2
RDRP

Nucleocapsid (N)
Spike (S)
Membrane (M)
Envelope €
GEN TARGET PADA DIAGNOSTIK RT-PCR COVID19
GEN

E (Envelope) E

N (Nucleocapsid) N, N1, N2, N3

ORF (Open reading frame) ORF1, ORF 1ab,ORF 1b, RdRp

S (Spike) S
 GEN TARGET PADA BEBERAPA NEGARA
Institute Country Gene Target
China CDC China ORF1ab and N
Institut Pasteur France Two targets in RdRp
US CDC USA Two targets in N gene
National Institute of Infectious Japan Pancorona and multiple
Disease targets, Spike protein
Charite Germany RdRp, E, N
HKU Hongkong Orf1b-nsp14, N
National Institute of Health Thailand N
 ORF (OPEN READING FRAME)
Satu fragmen DNA/RNA yang diawali dengan START
CODON dan diakhiri dengan STOP CODON
START DNA/RNA STOP

AUG UAA, UAG or UGA

CONTOH
 ARTI PENTING ORF 1ab DALAM
DIAGNOSTIK SARS-COV2
theORF1ab region encodes well-conserved non-structural
proteins and therefore is less susceptible to recombination

Biomarka RT-PCR COVID19 di

dalam ORF 1 ab

1. NSP2 (NS-1)
2. NSP3 (NS-2)
3. NSP14
4. orf1a
5. RdRp (NSP12)
6. Helicase
 RESOLVING POWER OF ORF SARS-COV-2

• Diagnostically
NS-1 important
• Stable regions in
ORF1ab with less
polymorphism
• Showing good

NS-2 discriminating results

for the increasing
cases of mutation
RDRP GENE (RNA
DEPENDENT RNA
POLYMERASE)

•Paling banyak digunakan dalam

diagnostic Covid19
•Disarankan oleh WHO dan Kemenkes

•Termasuk Non-structural Protein, yaitu

nsp 12
•Salah satu gen penting dalam
pembuatan vaksin Covid 19
 INTERPRETASI N1-N2-N3 & RNA P GENES

SARS-LIKE
SARS-COV-2
COV
THE POPULAR SET OF E, RdRP & N GENES
 ALUR DIAGNOSTIK SARS-COV-2
MENGGUNAKAN TARGET E-RDRP-N

CONFIRMATION
CONFIRMED
RdRP GENE
SARS-COV-2
CT<40
POSITIVE
CT<40
CONFIRMATION
SCREENING ASSAY RdRP GENE
(E GENE)
CT>40
NEGATIVE
CT>40
S-ACE2 COMPLEX
S GENE IN SARS-COV-2 ANALYSIS
PERBANDINGAN GEN RDRP, E & N VS GEN S DAN GEN ORF1AB
POTENSI GEN M: MENGATASI
POLIMORFISME
 WHO RECOMMENDATION

WHO recommendationsWHO interim guidance : Laboratory testing for coronavirus disease (COVID-19) in suspected
human cases. 19 March 2020
 RINGKASAN
• Gen struktural dan non-struktural mempunyai
arti penting dalam diagnostic SARS-CoV-2
• Berfungsi sebagai screening & discriminating
tool dalam RT-PCR
• Dapat digunakan pada virus original (Wuhan)
maupun pasca-Wuhan (SARS-CoV-2)
TERIMAKASIH
snuswa@gmail.com