SPEKTROSKOPI

MASSA
Oleh :
Anita Kumala Hati, M.Si.,Apt
Prodi S-1 Farmasi Universitas Ngudi Waluyo
POLA SPEKTROMETER MASSA
BERDASARKAN CARA IONISASINYA
Pola
No Cara Ionisasi Sampel Spekt. Massa Sifat Sampel Spektrum

1 Electron Bombardment EI-MS Volatile Banyak

Fragmen
2 Chemical Ionization CI-MS Volatile Ion Mol jelas

3 Field Desorption FDI-MS Non-volatile Ion Mol jelas

4 LASER Desorption LD-MS Non-volatile Ion Mol jelas

5 Fast Atom FAB-MS Non-volatile Ion Mol jelas

Bambardment
6 Electrospray Ionization ESI-MS Non-volatile Ion Mol jelas

7 Matrix-LASER MALDI-MS macromolecul Ion Mol jelas

Desorption e

8
1 ELECTRON IMPACT (EI)
(TUMBUKAN ELEKTRON)
 Pada EI-MS, Ionisasi sampel dilakukan dengan membenturkan/
menumbukkan sampel dengan semburan elektron. Semburan elektron
dipercepat dari hot filament menuju anoda, dimana sample berada
diantaranya. Perbedaan potensial sekitar 70eV.

 Karena 1eV ~ 23 kkal/mol ~ 96 kJ/mol, maka energi elektron dengan beda

potensial sebesar 70eV tidak saja cukup untuk melaksanakan ionisasi
sampel, tetapi juga untuk melakukan fragmentasi secara ekstensif.

 Catatan: ikatan tunggal yang paling kuat pada molekul organik

mempunyai kuat-ikatan sepadan dengan 4eV. Jadi 70eV keseluruhannya
akan digunakan untuk ionisasi dan fragmentasi sampel, dan hanya sekitar 0-
6eV yang akan disimpan sebagai energi internal ion-ion.

11
ELECTRON IMPACT (EI)
(TUMBUKAN ELEKTRON)
Skema dari Ionisasi Sampel dengan pola Electron Impact

Heated filament
Hamburan elektron
70eV
Repeller plate
..............
.............. Ke ion analyzer

Molekul sampel anoda

12
ELECTRON IMPACT (EI)
(TUMBUKAN ELEKTRON)
 Karena molekul organik , tanpa kecuali, berisi pasangan elektron dalam
orbital-terisinya, maka ionisasi sampel terjadi dengan cara mengambil satu
elektron, sehingga akan meninggalkan elektron yang tidak
berpasangan, disebut ion radikal-positif atau ion radikal-kation.

EI-MS
 M M+. + e
70 eV

 Karena tingginya energi ionisasi, maka pada spektrum massa dengan pola
EI, seringkali Molecular Ion (M+.) tidak bisa terlihat atau tidak terbentuk,
karena mengalami fragmentasi menjadi daughter ions yang banyak, atau
abundance-nya sangat-sangat kecil.

13
PRINSIP ANALISIS SPEKTROSKOPI MASSA
FRAGMENTASI DALAM KAMAR PENGION

m+ m1+ m2+ + m20

EI-MS Ion positif
mol. netral
70 eV
M M+. m+. m1+ m2+
Sampel Ion Molekul
Ion radikal-positif
parent-ion

m1+. m20 mol. netral

m +
m1 +.

m- m1+
Ion negatif
m+ + R.
radikal netral Daughter-
ion

m-. Ion-ion Fragment

Ion radikal-negatif
daughter ions

14
ELECTRON IMPACT (EI)
(TUMBUKAN ELEKTRON)

Elektron-

H
..
H O..

H H
Non-bonded electron, n

Elektron-

Urutan Kemudahan Terionisasi

en > e > e

15
 2 CHEMICAL IONIZATION (CI)
(IONISASI KIMIAWI)

 Untuk mendapatkan Molecular Ion yang baik, dengan abundance yang cukup
untuk bisa dilihat, maka dapat digunakan cara ionisasi yang dikenal dengan
Chemical Ionization.

 Pada pola CI-MS ini, sebagai chemical pengion-nya digunakan gas-organik

sperti: metana, isobutana atau ammoniak

 Pada pola CI-MS ini maka gas-pengion akan diinosasi dengan energi elektron
300eV yang menghasilkan ion gas; ion ini segera bereaksi dengan counter-part
netralnya.

 Yang akan terbaca pada CI-MS, bukanlah Molecular ion (M+.) seperti pada EI-MS,
namun yang terbaca adalah MH+, yaitu molecular ion plus 1H.

16
CHEMICAL IONIZATION (CI)
(IONISASI KIMIAWI)

Reaksi Ionisasi pada Pola CI-MS

CI-MS
CH4 CH 4+. + 2e
metana 300 eV radikal-kation

CH4+. + CH4 CH5++ + CH3.

radikal-kation metana [metana+H] radikal metil

CH
[metana+H]5+
+
+ M
sampel
MH
[sample+H] +
+
+ CH
metana 4

CH5+ : Spesies pengionisasi Sampel (M),

merupakan “solvasi” proton terhadap CH4
MH+ : BM Sampel + H

17
CHEMICAL IONIZATION (CI)
(IONISASI KIMIAWI)
 Pengion kimiawi selain metana adalah, Isobutana dan
Ammoniak

 C4H10, isobutana, akan memberikan spesies pengion

C4H11+
 NH3, ammoniak, akan memberikan spesies pengion
NH4+

18
3 FIELD DESORPTION IONIZATION (FDI)
(IONISASI DESORPSI MEDAN)
Ionisasi pada FDI-MS dilakukan dengan menggunakan
desorpsi medan (field desorption). Energi untuk
desorpsi (pelepasan) diberikan oleh medan dg
potensial sebesar 8 kV
Medan yang digunakan berupa plat-kawat, yang
permukaannya berupa jarum-jarum tajam (sharp
needles).
Plat-kawat logam tipis (ketebalan ~ 5mm),
Permukaan plat berupa sharp-needles.
+ 8kV Larutan 1 mg dioleskan pada permukaan
plat.
Plat-kawat ini dijaga potensialnya pada +
8kV

19
FIELD DESORPTION IONIZATION (FDI)
(IONISASI DESORPSI MEDAN)
SKEMA IONISASI FDI-MS

Plat-kawat
+ 8 kV

dibesarkan +
+ 8kV
+ terdesorpsi

+
Plat-kawat
5 mm
Katode celah Sampel, 1 mg

Jarum-jarum tajam.
Terbuat dari metal, yang
Mengandung vacant-
orbital

20
 FIELD DESORPTION IONIZATION (FDI)
(IONISASI DESORPSI MEDAN)

Karena jarum-jarum pada muka-plat sangat tajam, maka Kuat-medan dapat

mencapai 108 Vcm-1. Dan potensial ini akan menyebabkan satu elektron dari
Sampel (M) masuk ke vacant-orbital dari logam jarum tersebut. Akibatnya Sampel
akan kehilangan satu elektron, dan terdesorpsi keluar dari permukaan plat

+.
Jarum-tajam
..
M . M
Vacant-orbital
Sampel terdesorpsi (lepas)
Dengan potensial plat sebesar + 8kV, dari muka jarum
maka Kuat medan muka jarum dapat sebagai Molecular ion, bisa
mencapai 108 Vcm-1, shg 1 elektron sampel sebagai M+. Atau MH+
masuk vacant-orbital logam jarum tersebut

21
 FIELD DESORPTION IONIZATION (FDI)
(IONISASI DESORPSI MEDAN)

Lepasnya/terdesorpsinya M+. disebabkan oleh adanya gaya tolak coulombik

(Coulombic repulsion). Tekanan pada ujung-jarum cukup tinggi, sehingga
memungkinkan terjadinya reaksi bimolekuler dari sampel, sehingga ion molekul
akan berbentuk spesies MH+

Jarum-tajam
H+
..
M MH +

Vacant-orbital Terdesorpsi/lepas

Kesimpulan: Ionisasi dengan pola FDI akan menghasilkan Ion

Molekul, yang bisa dalam bentuk M+. atau MH+

22
 4 LASER DESORPTION (LD)
(DESORPSI LASER)

•Pada LD-MS, ionisasi dilakukan dengan Teknik Desorpsi

LASER (Light Amplificated by Stimulation of Emmission
Radiation). Pada Teknik ini, Sampel dibombardir dengan denyut
intensif (intense pulses) dari sinar LASER, pada durasi waktu
yang pendek. LASER pulses yang digunakan adalah dalam
rentang waktu antara 1-100 nanno-detik.

•Metoda LD-MS ini dikembangkan menjadi MALDI atau Matrix

Assisted LASER Desorption Inonization.

23
 FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)
5 (BOMBARDIR ATOM CEPAT)
 Prinsip ionisasi pada FAB-MS juga menggunakan pendekatan
desorpsi (pelepasan), hanya energi yang digunakan berasal
dari tumbukan/bombardment oleh atom cepat (fast atom).

SKEMA IONISASI FAB-MS

Bombardment dg atom-cepat

...
Ion-ion Sampel
Probe Ion analyzer

sampel
Metal probe tip
+kV (spektra ion-positif)
-kV (spektra ion-negatif)
24
FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)
(BOMBARDIR ATOM CEPAT)
Prinsip FAB-MS
 Beberapa mikrogram sampel (M) dilarutkan dalam beberapa mikroliter
matrix dengan volatilitas rendah, -umumnya dipakai gliserol. Matrix
diperlukan agar sampel tidak rusak bila terkena bombardment atom
cepat secara langsung. Jadi fungsi matrix untuk melindungi sampel.
 Sebagai atom cepat, umumnya digunakan atom-atom yang termasuk
gas-mulia, seperti: Xe, Ne, Ar dsb.
 Pembuatan Atom Cepat, sbg contoh Xe :
Atom Xe Cepat dibuat dengan memberikan percepatan pada Ion
Xenon sampai pada tingkat energi sekitar 6-9 KeV. Ion Xe Cepat
yang terjadi tersebut, kemudian dinetralkan dengan Atom Xe
Stasioner, sehingga akan terjadi ion exchange, dimana Ion Xe Cepat
yang berbenturan dengan Atom Xe Stasioner, akan berubah menjadi
Atom Xe Cepat, sedang Atom Xe Stationer akan berubah menjadi
Ion Xe Stasioner.

25
FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)
(BOMBARDIR ATOM CEPAT)
Reaksi Pembentukan Atom Cepat

Xe+ + Xe Xe + Xe +
Atom Ion exchange
Ion cepat Atom cepat Ion stasioner
stasioner

Atom Cepat membombardir Sampel dlm Matrix

- Atom Cepat ini kemudian membombardir sampel dlm matrix,
sehingga sampel (M) akan terdesorpsi/terlepas sebagi ion-ion.
- Ion-ion ini kemudian dianalisis dalam ion analyzer.
- Ion yang muncul umumnya [M+H]+ dan juga [M-H]-.
-Dengan FAB-MS bisa dilakukan pola ion-positif atau ion-negatif.

desorpsi
Xe + M/matrix [M+H]+ atau
[M-H]-
26
FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)
(BOMBARDIR ATOM CEPAT)

bombardment

Xe [M-H]-
matrix sampel

M desorpsi
[M+H]+ Ke Ion Analyzer

M desorpsi

[M+H]+
Metal probe tip desorpsi

DESORPSI ION-ION OLEH ATOM CEPAT PADA FAB-MS

27
 FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)
(BOMBARDIR ATOM CEPAT)
Matrix:
Pada analisis FAB-Mass Spectrometry, maka sangat dianjurkan bahwa
Sampel harus dilarutkan dalam suatu matriks. Sampel harus sedikit lebih
bersifat hidrofobik dibanding matrix, atau dengan kata lain matriks harus
sedikit lebih hidrofilik dibanding sampel. Sampel harus mampu mengisi
interface matrix, karena penetrasi atom cepat Xe hanya sekitar 10nm ke
dalam matrix.

Matrix yang sering digunakan adalah:

(1) Gliserol, (2) Campuran Tiogliserol/Digliserol (1:1), (3) Tetragol dan
(4) Teracol.

28
 FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)
(BOMBARDIR ATOM CEPAT)
Citra FAB-Mass Spectrum:
Pada Spektrum positif, ion [M+H]+ muncul dengan kelimpahan yang
tinggi.
Pada Spektrum-negatif, ion [M-H]- muncul denga kelimpahan yang
tinggi.
Bila Sampel mengandung gugus COOH atah NH2, maka ion-ion Sampel
yang bersal dari COO- dan NH3+ akan mucul dalam kelimpahan yang
relatif signifikan.
Ion yang berasal dari [M+matriks+H]+ juga acap kali muncul.

Spektra pada FAB-MS umumnya:

[M+H]+, [M-H]-, [M+matriks]+

29
 6 ELECTROSPRAY IONIZATION
(IONISASI SEMPROTAN-ELEKTRIK)

 Pada ESI-MS, ionisasi sampel dilakukan dengan electrospray (semprot-

elektrik). Electrospray, adalah suatu istilah yang digunakan untuk
menyatakan adanya kecepatan aliran-kecil suatu likuid (umumnya 1-10
ml/menit), dari suatu jarum kapiler, ketika beda potensial 3-6 kV
diperlakukan antara akhir dari kapiler tersebut dengan elektroda
silindris, yang berjarak 0,3-2 cm dari jarum tersebut (William &
Fleming, 1995).
 Dengan kondisi spt diatas, cairan yang meninggalkan kapiler tidak sebagai
tetesan, namun sebagai semprotan (spray), atau semburan-halus.
 Electrospray ini terbentuk pada tekanan mendekati tekanan atmosfer, dan
terdiri dari butiran-butiran likuid, yang dapat bermuatan positif atau
negatif, tergantung dari voltase yang diperlakukan pada kapiler.

30
ELECTROSPRAY IONIZATION
(IONISASI SEMPROTAN-ELEKTRIK)
Prinsip Ionisasi pada ESI-MS
 Jika semprotan-likuid dari kapiler tadi mengandung Sampel, maka Ion
Molekul dari Sampel tadi bisa didapat dengan cara menguapkan
(evaporizing) solven dari likuid tadi. Drying gas dimasukkan untuk proses
evaporasi.
 Pada proses evaporasi, butiran-butiran likuid yang bermuatan tadi akan
terreduksi ukurannya, dan muatan-listriknya menjadi semakin
berdekatan. Gaya repulsif (tolak-menolak) karena adanya muatan yang
sama, mulai muncul. Ini disebut gaya repulsif Coulombik.
 Pengecilan ukuran butiran karena evaporasi terus terjadi, sampai pada titik,
dimana gaya repulsif Coulombik mengatasi dan melawan gaya kohesif
butiran tersebut , sehingga terjadilah desolvasi atau pecahnya solven
butiran.
 Sampel yang ada dalam butiran akan terlepas/terdesorpsi keluar dalam
bentuk [M+H]+ atau [M-H]-, tergantung beda potensial yang diberikan.
31
 ELECTROSPRAY IONIZATION
(IONISASI SEMPROTAN-ELEKTRIK)
BAGAN SISTEM IONISASI PADA ESI-MS

Elektroda silindris spray

Sampel
diinjeksikan

Ke Ion Analyzer
3-6 kV

Jarum
Kapiler

Drying gas
Ion Molekul:
[M+H]+ atau [M-H]-

32
 ELECTROSPRAY IONIZATION
(IONISASI SEMPROTAN-ELEKTRIK)
SKEMA IONISASI ESI-MS

+ + + + +
+ Evaporasi
+ +
(1) +Sampel
+ + + ++
Butir-spray mengecil
Butir-spray (droplet) awal
Muatan positif makin berdekatan,
Gaya repulsi antar muatan makin terasa

+++ Desolvation in the

+ Selft-generated electric field
(2) + + +
+ + ++ Pecah, karena adanya gaya- Ion Molekul:
repulsi Coulombik [M+H]+ atau [M-H]-

33
ELECTROSPRAY IONIZATION
(IONISASI SEMPROTAN-ELEKTRIK)

 Larutan yang digunakan pada ESI-MS ini umumnya campuran

air/metanol dengan grade pro-analisa.
 Jika bekerja untuk ion-positif, perlu ditambahkan pula sedikit
asam organik volatile, sperti 0.1% asam trifluoroasetat.
 ESI-MS merupakan teknik yang sangat bagus untuk
menghasilkan ion molekul dari molekul-molekul polar yang
besar, seperti biopolimer.

34
 MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION
7 IONIZATION (MALDI)

 Ionisasi dengan pola MALDI merupakan tahap yang lebih maju dari ionisasi pola
LDI, dan juga menggunakan pendekatan desorption.

 Perbedaannya dengan LDI adalah, bahwa pada pola MALDI, sampel yang akan
dianalisis dilarutkan dulu kedalam solven yang terdiri dari larutan molekul
organik kecil, yang disebut dengan matrix.

 Molekul organik kecil atau Matrix yang digunakan ini, dipilih yang mempunyai
sifat absorpsi kuat pada panjang-gelombang LASER .

 Setelah sampel dilarutkan pada solven yang berisi matrix, kemudian solven
diuapkan sehingga akan didapatkan larutan-padat dari sampel di dalam matrix (a
solid solution of sample in the matrix)

35
MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION
IONIZATION (MALDI)

 Kemudian larutan-padat sampel dalam matrix ini diiradiasi dengan

sinar LASER.

 Induksi sinar LASER ini akan mengakibatkan akumulasi energi yang

besar di dalam larutan-padat tersebut melalui eksitasi elektronik dari
molekul-molekul matrix.

 Akumulasi ini akan menyebabkan desorpsi ion-ion, yang terbentuk

oleh adanya proton transfer antara photoexcited matrix dengan
molekul sampel.

 Desorpsi diikuti desolvasi akan menghasilkan Ion molekul yang berupa

[M+H]+
36
 Spektra EI-MS kloroquin

Spektra NICI-MS kloroquin

Pemecahan molekul yang mempunyai gugus
benzil Fragmentasi yang khas dari molekul yang mempunyai gugus benzil
adalah terbentuknya ion tropilium, suatu cincin anggota tujuh yang sangat stabil
karena adanya delokalisasi muatan positif pada cincin, dan ion ini biasanya
muncul sebagai base peaknya.

C7H7+ (m/z = 91)

 

Fragmentasi
levodopa