Validasi Metode Analisis

Bagian B
 Akurasi

VMA-2013 [ B ] 2
 Akurasi

Accuracy = Ketepatan

Ketepatan suatu metode analisis

adalah
kesesuaian antara hasil uji yang diperoleh
dan
nilai sebenarnya yang diterima

VMA-2013 [ B ] 3
 Cara Evaluasi Accuracy

VMA-2013 [ B ] 4
 Penentuan Akurasi Metode Analisis
dengan cara:

Pertama:
Dengan cara membandingkan hasil analisis metode yang
divalidasi dengan hasil analisis yang diperoleh
menggunakan metode baku (established reference method)

VMA-2013 [ B ] 5
 lanjutan…

Kedua:

Dengan menganalisis sampel yang diketahui

konsentrasinya (certified reference material, CRM) dan
membandingkan hasil analisis terhadap nilai
sebenarnya yang dinyatakan dalam CRM

VMA-2013 [ B ] 6
 Bila CRM Tidak Tersedia

Ketiga:

Tambahkan (spiking) zat baku dengan konsen-trasi yang

diketahui (by weight or by volume) ke dalam, matrik*
kemudian:
- lakukan ekstraksi analit  injekkan ke
alat analisis dan hasil yang diperoleh
ditentukan rekoverinya (%)
Matrik * = …..???
VMA-2013 [ B ] 7
 Persyaratan Akurasi
 Konsentrasi harus mencakup rentang zat yang dianalisis
dan salah satunya adalah konsentrasi yang dekat dengan
nilai limit of quantitaion (LoQ)
 Perkiraan rekoveri tergantung pada:
- matrik sampel
- prosedur penyiapan sampel, dan
- konsentrasi sampel
[ Lihat Tabel AOAC / HORWITZ ]

VMA-2013 [ B ] 8
 Akurasi

Misal:
Tiga (3) macam konsentrasi yang mencakup
80, 100, dan 120 %
dari nilai kadar sampel
dan masing-masing konsentrasi direplikasi 3 kali

“ Accuracy should be reported as % recovery ”

VMA-2013 [ B ] 9
 Rekoveri

Respon hasil ekstraksi

Rekoveri = X 100 %
Respon zat baku*

* : yang dilarutkan dalam pelarut murni

Perhatikan tata-cara penyiapan sampel

VMA-2013 [ B ] 10
2013 11
2013 12
 Ilustrasi
Presisi dan Akurasi

VMA-2013 [ B ] 13
 Accuracy vs precision

What would you

like to see ?

VMA-2013 [ B ] 14
 Accuracy vs precision

 Poor accuracy
 Good precision

VMA-2013 [ B ] 15
 Accuracy vs precision

 Poor precision
 Good accuracy

VMA-2013 [ B ] 16
 Accuracy vs precision
What would you
call this?

 Totally hopeless!
 Poor precision
 Poor accuracy

VMA-2013 [ B ] 17
 Tingkatan dan Rentang
Untuk
Menentukan Akurasi

VMA-2013 [ B ] 18
 Akurasi

Ahuja dan Dong, 2005.

VMA-2013 [ B ] 19
 Bagaimana Menentukan Kriteria
Keberterimaan Akurasi
[ Acceptance Criteria ]
???

VMA-2013 [ B ] 20
 Kriteria Penerimaan

VMA-2013 [ B ] 21
 Accuracy and Precision

Snyder
VMA-2013 [ B ] dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 22
 Recovery Results for C.U.

LoBrutto and Patel, 2007

VMA-2013 [ B ] 23
 Linearitas

VMA-2013 [ B ] 24
 Linearitas

Linearitas suatu metode analisis adalah:

kemampuan metode untuk

mendapatkan hasil uji (respon)
yang
(secara langsung atau dengan bantuan perubahan
matematik)
proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel
pada suatu rentang tertentu

VMA-2013 [ B ] 25
 Linearitas

Dipersiapkan dengan:

minimum lima (5) level konsentrasi dengan

tiga ( 3 ) replikasi

VMA-2013 [ A ] 26
 Kurva Baku [ 3 replikasi ]

Lakukan replikasi !

VMA-2013 [ B ] 27
 lanjutan…
 Linearitas ditentukan dengan menganalisis:

tiga hingga enam kali penginjeksian dari

lima atau lebih konsentrasi zat standar
yang terletak antara
80 - 120 %
rentang
konsentrasi yang diperkirakan

VMA-2013 [ B ] 28
 Linearitas dapat disiapkan dengan cara:

1. Minimum 5 konsentrasi zat standar (dari

pengenceran larutan induk)
atau

2. Minimum 5 konsentrasi zat standar (dari

masing-masing penimbangan zat standar)

Mana yang direkomendasikan ?

Mengapa ?
VMA-2013 [ B ] 29
 lanjutan…
Linearity = Linieritas  Y = bX + a
- hasil pengukuran menggunakan suatu metode
analisis yang berupa: abs, luas area, atau tinggi puncak
menunjukkan proporsio-nalitas dengan kadar zat yang
dianalisis

Syarat:

Koefisien korelasi [ r ] ≥ 0,999

Kazakevich and LoBrutto, 2007, p.471-481; Ahuja and Rasmussen, 2007, p.292;
Snyder dkk., 1997, p. 691 dan Chan dkk., 2004, p.16.
VMA-2013 [ B ] 30
VMA-2013 [ B ] 31
 Linearity Assay & C.U.

VMA-2013 [ B ] 32
 Low-Level Linearity

VMA-2013 [ B ] 33
 Combine or Separate Linear
regression ?

VMA-2013 [ B ] Ermer dan Miller, 2005, p.253 34

 Rentang [ Range ]

VMA-2013 [ B ] 35
 Rentang
 Rentang suatu metode analisis adalah interval antara
tingkat paling atas dan paling bawah yang sudah terbukti
dapat ditentukan dengan akurasi, presisi, dan linearitas
menggunakan metode seperti yang ditulis

 Rentang biasanya digambarkan/dinyatakan dalam unit

(%, ppm) yang diperoleh dengan metode analitik
tersebut

VMA-2013 [ B ] 36
 Rentang Minimum

Jenis analisis Rentang [ % ]

PK. Kadar Obat atau Sediaan 80 - 120

Obat

Keragaman kandungan 70 - 130

[ atau lebih lebar ]

Uji disolusi +/- 20

ICH, Q 2A and 2B, 2005 / ICH Q2 (R1)

VMA-2013 [ B ] 37
 Tingkatan dan Rentang
Untuk
Menentukan Linearitas

VMA-2013 [ B ] 38
 Linearitas

Ahuja dan Dong, 2005.

VMA-2013 [ B ] 39
 Linearitas

Ahuja dan Dong, 2005.

VMA-2013 [ B ] 40
 Range

Snyder
VMA-2013 [ B ] dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 41
 Limit of Detection [ LoD ]
dan
Limit of Quantitation [ LoQ ]

VMA-2013 [ B ] 42
 Limit of Detection [LoD]

 LoD adalah konsentrasi analit terrendah dalam sampel

yang masih dapat dideteksi tetapi tidak diperlukan secara
kuantitatif

 Pada HPLC, LoD adalah jumlah zat yang diinjeksikan

untuk menghasilkan tinggi puncak paling tidak 2 atau 3
kali tinggi puncak baseline noise level

VMA-2013 [ B ] 43
 Limit of Quantitation
 LoQ adalah jumlah zat minimum yang diinjeksikan
untuk memberikan hasil pengukur-an secara teliti

 Pada HPLC, biasanya tinggi puncak 10 hingga 20 kali

lebih tinggi dibanding baseline noise

 Sejumlah sampel dengan konsentrasi analit menurun

(semakin kecil) diinjeksikan 6 kali,  Hitunglah nilai
RSD-nya

VMA-2013 [ B ] 44
VMA-2013 [ B ] Ermer and Miller, 2005, p.101 45
VMA-2013 [ B ] 46
 Paper penentuan LoD

Ermer and Miller, 2005, p.111

VMA-2013 [ B ] 47
 Penentuan LoD dan LoQ

Ermer and Miller, 2005, p.110

VMA-2013 [ B ] 48
VMA-2013 [ B ] 49
VMA-2013 [ B ] 50
 LoD dan LoQ

VMA-2013 [ B ] 51
 Limit of Detection

VMA-2013 [ B ] 52
 LoD PGE2

VMA-2013 [ B ] 53
 Robustness

VMA-2013 [ B ] 54
 Robustness
 Robustness adalah ukuran kinerja (performance) suatu
metode analisis apabila perubahan kecil yang disengaja
diterapkan pada kondisi metode tersebut

 Tujuan validasi parameter ini untuk mengiden-tifikasi

(bila ada) kondisi metode mana yang paling kritis untuk
menampilkan kinerja metode dengan baik

VMA-2013 [ B ] 55
 Parameter Robustness
Parameter Nominal Low value High value

Percent organic in mobile phase 25 20 30

Flow rate (mL/min) 1.0 0.8 1.2

Buffer pH 7.2 6.8 7.6

Buffer concentration (mM) 20 15 25

Column temperature (0C) 30 25 35

Detector wavelength (nm) 220 210 230

HPLC Column Different batches for same column

type

Ahuja dan Dong, 2005,

VMA-2013 [ B ] p.208 56
 Robustness

VMA-2013 [ B ] 57
 Robustness [ isocratic ]

Snyder
VMA-2013 [ B ] dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 58
 Robustness [ gradient ]

Snyder
VMA-2013 [ B ] dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 59
 System Suitability

VMA-2013 [ B ] Ermer and Miller, 2005, p.351 60

 System Suitability Test [ FDA ]

Snyder
VMA-2013 [ B ] dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12 61
 System Suitability Test

Ermer dan Miller, 2005, p.338.

VMA-2013 [ B ] 62
 Literatur

VMA-2013 [ B ] 63
 Penyimpangan -maks

Ahuja and Rasmussen, 2007, HPLC Method Development for Pharmaceutical, Chpt. 9
VMA-2013 [ B ] 64
 Injector/Autosampler

Ahuja and Rasmussen, 2007, HPLC Method Development for Pharmaceutical, Chpt. 9

VMA-2013 [ B ] 65
 Temperatur Kolom

Ahuja and Rasmussen, 2007, HPLC Method Development for Pharmaceutical, Chpt. 9

VMA-2013 [ B ] 66
 Stability of Solution

VMA-2013 [ B ]
Kazakevich and LoBrutto, 2007, p.485-486. 67
 Stability of Solution

VMA-2013 [ B ] Ahuja dan Dong, 2005, p.210-211 68

 Method Adjustment
or

Method Modification

VMA-2013 [ B ] 69
VMA-2013 [ B ] 70
 Perlukah
Metode Titrasi DiValidasi
???

VMA-2013 [ B ] 71
TITRASI, 2012 72
 Validasi Metode Titrasi

2005

VMA-2013 [ B ] 73
 European Pharmacopoeia 6.0
2008 (p.514), 4.2.2
 Volumetric solution do not differ from the prescribed
strength by more than 10 per cent. The molarity of the
volumetric solution is determined by an appropriate
number of titrations. The repeatability does not exceed
0.2 per cent (relative standard deviation).
 Misal, akan dibuat larutan baku 0,1 N,

0,09 - 0,11
Yang diperbolehkan :
[ RSD ≤ 0,2 % ]

VMA-2013 [ B ] 74
 Ermer and Miller, 2005, p.327

VMA-2013 [ B ] 75
VMA-2013 [ B ] 76
 Terima Kasih

VMA-2013 [ B ] 77