VALIDASI

METODE ANALISIS
Validasi
 Validasi adalah : Tindakan pembuktian yang
terdokumentasi bahwa suatu prosedur, proses,
material, peralatan atau sistem akan selalu
memberikan hasil sesuai dengan yang di
harapkan secara konsisten.

 Validasi proses terdiri atas 4 bagian yang

berbeda.
1. Software Validation
2. Hardware / Instrumentation Validation /
Qualification
3. Method Validation
4. System Suitability
 THE VALIDATION PROCESS

Hardware Method
Validation

Validation

Software System
Suitability
 THE VALIDATION TIMELINE

Vendor’s User’s Site User’s Site

Site
Structural and Fuctional Validation Calibration
Software Qualification Maintenance
Validation: System
ISO/ 9000 Instalation Operational Performance Sultabillity
Tickit

DQ IQ OQ PQ OQ,PQ

Before Before Use After Use

Purchase
 The USP Eight Steps Of Method Validation
Precision

Accuracy

Limit Of Detection

Limit Of Quantitation
Method
Validation Specificity

Linearlty and Range

Ruggedness

Robustness
 ICH Method Validation Parameters

Precision

Accuracy

Limit Of Detection

Limit Of Quantitation
Method Specificity
Validation
Linearlty

Range

Robustness

System Sultabillity
Analytical Method to Be Validated ( Menurut ICH )
Impurity / Purity Test Assay
Type of analitical prosedure :
Identification - Dissolution
parameteras
QuantitativeLimit - Content
Accuracy - + - +
Precision - - - -
Repeatability - + - +
IntermidiatePrecision - + 1) - + 1)
Reproducibility(2) - + - +
Specificity / Selectivity + + + +
Detection Limit - - 2) + +
Quantitation Limit - + - -
Linearity and Range - + - +
Robustness / Ruggedness - + - +

1) Tidak perlu dilakukan bila reproducibility sudah dilaksanakan

2) Bila di perlukan
 Determinasi
Karakteristik
Kinerja Metoda Analisis
 DETERMINASI KARAKTERISTIK KINERJA
METODE ANALISIS

Validasi metode analisis di lakukan melalui penentuan

karakteristik kinerjanya yang terdiri atas :
 Akurasi
 Presisi
 Spesifisitas / Selektifitas
 LOD / Limit Of Detection
 LOQ / Limit Of Quantitation
 Ruggedness atau Robustness
 Linearitas dan rentang
 Uji Kesesuaian Sistem
1. Penentuan Akurasi

 Akurasi di definisikan sebagai kedekatan hasil

pengujian terhadap nilai sebenarnya
 Penentuan akurasi di lakukan dengan
menggunakan minimal 9 kali pengukuran dari 3
larutan dengan konsentrasi yang berbeda ( untuk
masing – masing konsentrasi di lakukan 3 kali
pengukuran )
2. Penentuan Presisi

Presisi di definisikan sebgai kedekatan beberapa nilai

pengukuran dari sampel yang homogen pada kondisi
normal (sampel yang sama dan di uji secara berurutan )
Penentuan presisi umumnya mencakup pemeriksaan :
 Repeatability
 Intermediate Precision
 Reproducibility
a. Repeatability

Dinyatakan sebagai hasil presisi di bawah perlakuan

yang sama ( analis dan alat yang sama ) dalam interval
waktu pemeriksaan yang singkat.

Repeatability dilakukan dengan menggunakan minimal 9

pengukuran dengan 3 larutan dengan konsentrasi yang
berbeda ( masing – masing larutan 3 kali pengukuran )
atau dengan melakukan pengujian minimal 6 kali
terhadap sampel dengan konsentrasi 100 %
b. Intermediate Precision
Dilakukan dengan cara mrngulang pemeriksaan tersebut dengan
menggunakan alat yang berbeda, hari yang berbeda, analis yang
berbeda dan sebagainya.

c. Reproducibility
Dinyatakan sebagai presisi yang di peroleh dari hasil pengukuran
pada laboratorium yang berbeda
3. Penentuan Spesifisitas
Spesifisitas atau selektivitas di definisikan sebagai kemampuan
metode analisis untuk mendeteksi secara kuantitatif analit dengan
komponen lain yang menyertai, misalnya hasil penguraian atau
ketidakmurnian.

Spesifisitas meliputi :
1. Identifikasi
2. Uji kemurnian
3. Penetapan kadar atau potensi
Salah satu prosedur untuk penentuan spesifisitas metode analisis dapat
dilakukan dengan membandingkan hasil persen perolehan kembali dari
sampel dengan “ pengotor “ dan sampel tanpa “pengotor”.
Sampel murni Sampel dengan pengotor

Di uji dengan metode analisis Di uji dengan metode

analisis
yang akan di tentukan yang akan di tentukan
Spesifisitasnya Spesifisitasnya

% recovery = a % recovery = b

bandingkan nilai b terhadap a.

4. Penentuan Limit of Detection ( LOD )
Batas kuantitasi atau LOQ didefinisikan sebagai konsentrasi
sampel terendah yang masih dapat dideteksi oleh metode analisis
namun tidak perlu terkuantitasi sebagai nilai yang tepat.

LOD dari suatu metode analisis dapat di tentukan dengan

berbagai cara :
- Visual
- Signal to noise ratio
- Perbandingan SD dan Slope kurva kalibrasi
5. Penentuan Limit of Quantitation ( LOQ )
Batas kuantitasi atau LOQ didefinisikan sebagai konsentrasi
sampel terendah yang masih dapat dideteksi secara
kuantitatif dengan akurasi dan presisi yang dapat di terima.
LOQ dilakukan untuk penentuan kadar secara kuantitatif
bagi Impurity test atau degradation product

LOQ dari suatu metode analisis dapat dengan cara :

- Visual
- Signal to noise ratio
- SD dan Slope kurva kalibrasi
6. Penentuan Ruggedness dan Robustness

Ruggedness atau ketangguhan metode analisis didefinisikan

sebagai derajat keberulangan hasil pengujian yang diperoleh
dari sampel yang sama dan di uji pada kondisi yang berbeda,
laboratorium, analis, alat, suhu, waktu pengujian dan lain –
lain. Dengan kata lain, ketangguhan metode analisis adalah
kemampuan metode analisis untuk tidak memberikan reaksi
terhadap variasi parameter yang sengaja dilakukan
• Robustness
didefinisikan sebagai kapasitas dari metode analisis untuk tetap tidak
terpengaruh oleh variasi kecil yang sengaja dilakukan pada parameter
pemeriksaan atau metoda analisisnya. Sebagai contoh, variasi dapat
dilakukan pada pH, suhu dan lain – lain.
7. Penentuan Linearitas dan Rentang
• Linearitas didefinisikan sebagai kemampuan metode
analisis untuk memberikan hasil pengukuran yang secara
langsung proporsional dengan rentang konsentrasi yang
diberikan

Linearitas ditentukan dengan menghitung koefisien korelasi

dan koefisien penentu. Nilai koefisien penentu terkecil
adalah 0,997

• Rentang didefinisikan sebagai interval antara konsentrasi

tertinggi terhadap konsentrasi terendah yang dapat di
deteksi secara akurat dan cermat
8. System – Suitability / Kesesuaian Sistem
Faktor Retensi Dinyatakan sebagai k dan secara umum harus lebih besar dari
2, k menunjukkan tingkat pemisah zat yang di uji.
Ripitabilitas Dinyatakan sebagai relative standart deviation yang diperoleh
dari hasil minimal 5 kali penyuntikan
Retensi Relatif Perbandingan jarak yang di tempuh zat uji dengan zat standar.
Tidak diperlukan bila sudah dilakukan pemeriksaan resolusi
Resolusi Efisiensi pemisahan puncak dari 2 komponen dari suatu
campuran atau puncak lain yang kemungkinan berpengaruh,
yang berasal dari zat yang diperiksa seperti :Impurity,Exipient,
“degradation product “ atau “interval standard”
Faktor Ikutan T harus lebih kecil atau sama dengan 2

Theoritical Plates/ Efisiensi kolom, secara umum harus lebih besar dari 2000
Lempeng Teoriritis (N)
Pembuktian Hasil Validasi
 Akurasi dan Presisi dapat dinyatakan dengan :

 Deviasi Standar ( Standart Deviation – SD ) atau simpangan

baku
 Deviasi Standart Relatif ( Relative Standard Deviation –
RSD ) atau “
Simpangan Baku Relatif “ ( SR )
 Rentang kepercayaan ( Confidence interval )
 Koefisien variasi ( perbandingan 2 hasil pemeriksaan )
 Deviasi Standar ( SD ) dihitung dengan persamaan :

1=n
Σ ( xi – x )2
 = SD = 1=1
n-1

n = Jumlah pengukuran
xi = Hasil pengukuran ke I
x = rata – rata pengukuran

Simpangan Baku Relatif ( % ) dihitung dengan persamaan :

SR (%) = SD x 100 %
X
 Rentang Kepercayaan dihitung dengan persamaan :
SD x t
n
SD : Deviasi Standar
t : Student factor pada :
- 95% confidence (  : 0,05 )
- DF : u – 1
n : Jumlah contoh

Koefisien Variasi :
n
1 ∑. ( xi – μx ) ( yi – μy )
n i-1
Spesifisitas dinyatakan sebagai resolusi dan dapat dihitung dengan persamaan :

RS = 2 ( t2 – t1 )
W 1 + W2

t1 : Waktu retensi kompenen 1 diukur dari saat penyuntikan sampai

saat elusi maksimum puncak
t2 : Waktu retensi komponen 2 diukur dari saat penyuntikkan sampai
saat eluasi maksimum puncak
W1 : Lebar puncak komponen 1 diukur dengan jalan ekstrapolasi sisi
puncak yang berupa garis yang relatif lurus sampai garis dasar
W2 : Lebar puncak komponen 2 diukur dengan jalan ektrapolasi sisi
puncak yang berupa garis yang relatif lurus sampai garis dasar
a. Penentuan LOD dan LOQ Secara Visual

• Dari serangkaian konsentrasi larutan sampel

• Tentukan kadar dengan metode analisis yang akan di tentukkan
LODnya
• Cari / hitung konsentrasi terkecil yang masih memberikan nilai yang
masih dapat dipercaya.
b. Penentuan LOD dan LOQ berdasarkan
signal to noise ratio ( S/N )
Membandingkan resapan larutan standar dengan konsentrasi
terkecil terhadap resapan larutan blanko S/N perbandingan yang
masih dapat di terima adalah :

- LOD = 2 : 1 atau 3 : 1
- LOQ = 10 : 1
c. Berdasarkan perbandingan SD dari serapan dan slope berdasarkan
kurva kalibrasi dari suatu larutan untuk penetapan LOD – LOQ

LOD dan LOQ secara matematis dapat dihitung dengan persamaan :

LOD = 3,3 σ LOQ = 10 σ

S S
di mana :

σ = SD = SYX2 = ΣY2 – (ΣY)2 / n – S2 { ΣX2 – (ΣX)2 / n }

n.2

Slope ( S ) = ΣXY – (ΣX) (ΣY) / n

ΣX2 . (ΣX)2 / n
 Penentuan Ruggedness / Robustness

Ruggedness and Robustness

Dinyatakan dalam % RSD yang dapat di hitung dengan persamaan :

RSD ( % ) = SD . 100
X
 Penentuan Linearitas

Dalam pelaksanaannya linearitas di tentukan menggunakan minimal

5 sampel dengan memperhitungkan rentang konsentrasi yang di
berikan

ICH menetapkan penggunaan minimal 5 sampel dengan rentang

konsentrasi yang di tetapkan sebagai berikut :
1. Untuk penentuan kadar : 80 – 120 % dari konsentrasi pengujian ;
2. Untuk penentuan zat pengotor : 50 – 120% dari spesifikasi ;
3. Untuk keseragaman kandungan : 70 – 130 % dari konsentrasi
pengujian ;
4. Untuk uji disolusi : kira – kira 20% dari rentang yang telah di
tetapkan. Contoh : pada spesifikasi obat lepas terkendali dinyatakan
bahwa 20% akan terdisolusi setelah satu jam dan 90% akan
terdisolusi setelah 24 jam, maka rentang yang divalidasi adalah
antara 0 hingga 110% dari data yang tercantum pada label.
Derajat linearitas dihitung dengan persamaan :

Y = a + bx

b(Slope) = n . ΣXY – ΣX . ΣY
n . ΣX2 – (Σx)2

a(Intercept) = ΣY – a . ΣX
n

r = ΣXY – ( ΣX ΣY / n )
( ΣX2 - [(ΣX)2 / n ] ) {ΣY2 – (ΣY)2 / n }
Koefisien korelasi dapat dihitung dengan menggunakan cara statistika pada
kalkulator atau menggunakan persamaan sebagai berikut :

r = ΣXY – ( ΣX ΣY / n )
( ΣX2 - [(ΣX)2 / n ] ) {ΣY2 – (ΣY)2 / n }

r2 dapat dihitung menggunakan cara statistika pada kalkulator atau dengan langsung mengkuadratkan nilai r.
Pelaksanaan Validasi
Protokol Validasi Metode Analisa

Merupakan dokumen yg memuat semua aspek yg

berkaitan dengan cara pembuatan bahan, larutan yang
akan digunakan untuk validasi
 Secara umum protokol akan mencantumkan hal – hal sebagai berikut :
1. no dokumen
2. tanggal pembuatan
3. latar belakang
4. no.metoda analisis yg akan divalidasi dari sumbernya
5. Parameter validasi yg akan dilakukan
6. Prosedur pembuatan bahan larutan untuk validasi a.l.: pembuatan
larutan uji untuk :
Uji akurasi
Presisi
Linearitas dan rentang
LOD
LOQ
Selektifitas
Dst
7. Paraf / tanda tangan pembuat, pemeriksa dan yg menyetujui
Laporan Validasi Metode Analisis

Merupakan dokumen yg memuat semua hasil validasi,

perhitungan dan analisis datanya, serta kesimpulan
termasuk paraf/tanda tangan pelaksana, pemeriksa dan
yg menyetujuinya
 Secara umum laporan akan mencantumkan hal – hal
sebagai berikut :

1. no dokumen
2. tanggal pembuatan
3. latar belakang
4. no.metoda analisis yg akan divalidasi dari sumbernya
5. hasil masing – masing parameter validasi, akurasi, presisi, linearitas
lengkap dengan perhitungan dan analisis datanya
6. Kesimpulan
7. Paraf / tanda tangan pelaksana, pemeriksa dan yg menyetujuinya