Validasi dan Verifikasi

Metode

Mirawati siregar
 •Suatu percobaan laboratorium
•Untuk membuktikan bahwa
karakteristik kinerja metode

Validasi analisis telah memenuhi

persyaratan yang telah ditetapkan
sebelumnya

•Suatu percobaan laboratorium

•Untuk membuktikan bahwa
laboratorium mampu
menggunakan metode analisis
standar pada kondisi nyata di
laboratoriumnya

Kualifikasi Kualifikasi instrumen:

DQ, IQ, OQ dan PQ
 Verifikasi

 Metode tidak baku,

 Metode pengembangan
 Metode baku yang
dimodifikasi Validasi
 Metode baku yang
digunakan di luar
lingkup
 Adopsi metode baku/standar
 Untuk membuktikan bahwa suatu
laboratorium mampu melakukan analisis di
laboratoriumnya
 untuk menunjukkan bahwa kinerja metode
dapat ditiru atau diulang oleh laboratorium
yang bersangkutan dengan hasil yang sama
 Tahapan Validasi/Verifikasi Metode
Literature search
Pengembangan/
Telaah karakteristik Analit
optimasi Metode
Penyiapan bahan dan alat

Pembuatan
Permintaan protokol
Validasi/Verifikasi Validasi/verifikasi

Penyerahan Percobaan Lab

dokumen mengacu protokol
validasi/verifikasi

Penyususnan Laporan
Analisis Data
Validasi/Verifikasi
 Application:
 Titration, spectrphotometric,
chromatographic method etc.

General test do not typically

 require verification
(water, heavy metal, residue on ignition etc.)
Categories of Analysis
I. Quantitation of major components of bulk drug
substances/active ingredients
II. Determination of impurities/degradation products
A. Quantitative B. Limit Test
III. Determination of performance characteristics (dissolution
test, drug release etc.)
IV. Identification test

8
 Assay Category 2
Analytical
Assay
Performa Assay
Quantitati Limit Category
nce Category 1
ve Tests 3
Parameter

Accuracy Yes Yes * *

Precision Yes Yes No Yes
Specificity Yes Yes Yes *
LOD No No Yes *
LOQ No Yes No *
Linearity Yes Yes No *
Range Yes Yes * *
Ruggedne
Yes Yes Yes Yes
ss be required, depending on the nature of the specific test.
* May

9
 Impurity testing
Type of
Analytical Identificatio
Assay
n Quantitative Limit Tests
Procedure

Accuracy No Yes No Yes

Precision

No Yes No Yes
Repeatability
Interm.
No Yes No Yes
Prec.
Specificity Yes Yes Yes Yes
LOD No No Yes No
LOQ No Yes No No
10
 Accuracy
Precision
Limit of Detection
Validasi
Limit of Quantitation
Metode
Selectivity/Specificity
Linearity and Range
Ruggedness/Robustness

11
Akurasi rendah Akurasi tinggi Akurasi tinggi Akurasi rendah
Presisi tinggi Presisi tinggi Presisi rendah Presisi rendah

12
USP dan ICH  menggunakan istilah
Specificity

IUPAC dan AOAC  menggunakan istilah

Selectivity

AOAC: Specificity  “highest selectivity”

13
Specificity (USP/ICH):
Kemampuan untuk mengetahui adanya analit
di dalam campuran , tanpa adanya pengaruh
dari zat lain seperti impurities, hasil urai dan
komponen matriks.

Selectivity menggambarkan kemampuan

suatu metode analisis untuk membedakan
analit dari komponen lainnya pada sampel
14
Kuliah Anfar II, 2008 FFUA
Jika tersedia zat hasil degradasi:

Suntikkan atau totolkan:

 Blanko sampel/Placebo
(Sampel minus analit)
 Zat Hasil degradasi
(degradants)
 Zat yang memiliki struktur
mirip (Related
Substances

Selektif  Rs ≥ 1,5
15
Jika tidak tersedia zat hasil degradasi (Degradants)

Lakukan forced degradation studies

Sampel disimpan pada suhu/kelembaban
tertentu atau penambahan oksidator
 Bandingkan profil pemisahan peak
sebelum dan sesudah perlakuan

16
 Heat  Temperature (50 - 60 oC)
 Humidity  Kelembaban (70 to 80%)
 Acid Hydrolysis  HCl 0.1 N
 Base Hydrolysis  NaOH 0.1 N
 Oxidation  H2O2 (3 to 30%)
 Light  UV/Vis

17
 diode array detector  spectra overlay
 Evaluasi korelasinya (r, MF)
r> 0,99 or MF>990
 Spectra overlay “upslope,
apex dan down slope”
 Peak should be “pure”

MF = 1000  r = 1 100% pure peak

MF > 990  pure
MF < 900  impure
900 < MF < 950  contaminated
19
Pure and Impure HPLC peaks

 Peak purity tests can also be evaluated with

– The 3D-spectra of Photodiode array detectors
– Mass spectrometry
20
 Linieritas metode analisis menunjukkan
kemampuan suatu metode untuk
memperoleh hasil uji, yang baik langsung
maupun dengan definisi transformasi
matematis yang baik, proporsional dengan
konsentrasi analit dalam sampel pada
rentang tertentu (Leyva, 2008).
 Melalui analisis statistik
Linear Regression (y = mx + b)
 Correlation Coefficient, y-intercept (b), slope
(m), residual sum of squares
 Disarankan menggunakan minimum 5 macam
konsentrasi analit
 Disarankan terhadap sampel yang independen, bukan
dari sampel hasil pengenceran

23
 S xo
VXO  100%
X

S XO
S
 Y where SY 
 y i  yˆ i 
, yˆ  a  bxi
b N 2

Y  Y  with
2
1
X P  2 S XO .ttable .  1  2P
N b .QXX
1 X2
YP  a  SY . ttable . 1
N QXX
2
1
QXX   Xi 
2
 X i , t  student t factor for f  N - 2
N
and p  0.05

24
25
 Interval antara konsentrasi terbesar dan
terkecil dari analit dalam sampel
 Memenuhi syarat dalam hal presisi, akurasi dan
linieritas

26
 For Drug Substance & Drug product Assay
 80 to 120% of test Concentration
 For Content Uniformity Assay
 70 to 130% of test Concentration
 For Dissolution Test Method
 +/- 20% over entire Specification Range
 For Impurity Assays
 From Reporting Level to 120% of Impurity
Specification for Impurity Assays
27
Uji Homogenitas kurva kalibrasi

28
 Biasanya dinyatakan dalam persen perolehan
kembali (% recovery)
 Dapat dilakukan melalui pebandingan hasil
analisis antara metode yang divalidasi dengan
metode standar  uji t  harus tidak berbeda
makna
 Dapat dilakukan metode adisi standar terhadap
blanko atau sampel.

29
 Persen perolehan kembali (% recovery)

Kadar yang diperoleh

% Re c  x100%
Kadar sesungguhnya

Persyaratan untuk assay validation = 98-102%

 Dianjurkan menggunakan tiga macam konsentrasi

masing-masing 3 kali replikasi
 Adisi standar pada blanko/plasebo  dianjurkan
konsentrasi 80% - 120 %

30
 KURVA AKURASI menurut Funk et. al.

- Untuk mengetahui ada atau tidaknya kesalahan sistematis,

Dibuat kurva regresi antara Xf (konsentrasi analit hasil
analisi) terhadap Xc (konsentrasi nominal analit)
Xf = af + bf. Xc
-Dihitungconfidence range (Cr) dari intercept {VB(af)} dan
slope {VB(bf)} dari recovery Pada p = 0.05
ttable.Syf
Cr bf = bf 
Qxx
1 Xc 2
Cr af = af  ttable . Syf . 
N Qxx
Syf =
 [Xif - (af + bf - Xi )]2

N-2

t = Student-t-factor f = N-2, P = 95 %. 31
M. Yuwono & G. Indrayanto, Validation method of Chromatography Methods of
Analysis, Profiles of Drugs Substances, Excipients and Related Methodology,
Vol. 32, Elsevier Academic Press, San Diego, New York, Boston, London,
Sydney, Tokyo, Toronto. In Press (2005)

32
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
33
 Kedekatan dari suatu seri pengukuran yang diperoleh
dari sampel yang homogen

 Dalam bentuk RSD (relative standard deviation)

 Meliputi:
- Repeatability
- Intermediate Precision
- Reproducibility
34
 Kondisi sama pada interval waktu yang singkat
 Satu larutan uji  disuntikkan berkali-kali pada hari
yang sama, alat yang sama, analisis serta kondisi lain
yang sama.
 Disebut juga
Intra-assay precision

35
Disebut juga “within-laboratory variations”.

Berbeda hari, atau analis, atau instrument

(dalam satu laboratorium)

Sebagai bagian Ruggedness menurut USP

36
 Repeatability test at different labs.
 Berbeda analisis atau instrument dari laboratorium
yang berbeda

37
 Dianjurkan menggunakan 3 macam
konsentrasi berbeda, misal 80, 100 dan 120 %
dari konsentrasi target
 Masing-masing konsentrasi dilakukan 3
replikasi
 Dianjurkan dilakukan pada hari yang berbeda
dan analisis yang berbeda
 Kriteria penerimaan: RSD < 2% (Assay
validation)

38
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
39
 Quantitation Limit
(QL)
 Lowest amount of  Lowest amount of
analyte in a sample analyte in a sample
that can be detected that can be quantified
but not necessarily with suitable accuracy
quantitated. and precision.
 Estimated by Signal to  Estimated by Signal to
Noise Ratio of 3:1. Noise Ratio of 10:1.

41
Detection Limit (DL) and Quantitation Limit
(QL)

1. Based in Visual Evaluations

- Used for non-instrumental methods
2. Based on Signal-to Noise-Ratio
- 3:1 for Detection Limit
- 10:1 for Quantitation Limit
3. Based on Standard Deviation of the Response and
the Slope

42
 Based on Visual Evaluation
 may be used for non-instrumental
methods.
 Based on Signal-to-Noise
 Based on the Standard Deviation of the
Response and the Slope

43
Based on Signal-to Noise-Ratio

44
where
= the standard deviation of the response ( SD
of blank samples or SD of intercepts of regression line)
S = the slope of the calibration curve

45
Robustness
 Definition: Capacity to remain unaffected by small
variations in method parameters
 Determination: Comparison results under differing
conditions with precision under normal conditions
 Variations may include: stability of analytical solution,
variation of pH in a mobile phase, different column
(lot/supplier), temperature, flow rate.

46
 degree of reproducibility of test results
 obtained by the analysis of same samples under a
variety of conditions,
such as different laboratories, analysts,
instruments, different lot of reagents,
days etc.

47
 “When sponsors make changes in the analytical
procedure, drug substance, drug product, the
changes, may necessitate revalidation of the
analytical procedures.”
 “The degree of revalidation depends on the
nature of the change.”

48