LAPORAN PRAKTIKUM METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK PERCOBAAN 2 UJI AKTIVITAS SUKSINAT DEHIDROGENASE

Nama NIM Kelompok

: Imana Mamizar : 10511066 :5

Nama Asisten : Bunga (20513032) Tanggal Percobaan : 20 Februari 2014 Tanggal Pengumpulan : 27 Februari 2014

LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2014

UJI AKTIVITAS SUKSINAT DEHIDROGENASE

I.

Tujuan -Membandingkan aktivitas enzim suksinat dehidrogenase tanpa inhibitor dan dengan menggunakan inhibitor

II. Teori Dasar III. Data Pengamatan Percobaan Tabung A (tanpa malonat) 0.5mL metilen biru + 0.5 mL air + 5mL Buffer pH 7.0+ 0.5 mL homogenate Tabung B (tanpa malonat) 0.5mL metilen biru + 0.5mL Na-suksinat+ 5mL Buffer pH 7.0+ 0.5 mL homogenate Tabung C (tanpa malonat) 0.5mL metilen biru+ 0.5 mL Na-suksinat +5mL Buffer pH 7.0 + 0.5mL homogenate panas Tabung A (dengan malonat) 0.5mL metilen biru +0.5 mL air + 5mL Buffer pH 7.0 + 0.5 mL Na-malonat + 0.5mL homogenate Pengamatan -waktu 20 menit - tidak terdapat perubahan warna sama sekali (warna larutan masih tetap biru) -waktu 20 menit 21.22 detik -larutan berubah warna menjadi putih (bagian putih mendominasi bagian larutan) - waktu 9 menit 39.1 detik -larutan tidak mengalami perubahan warna (warna larutan masih tetap biru) -waktu 20 menit 17.23 detik -dengan waktu yang sama dengan tabung A tanpa malonat, diamati bahwa larutan tidak mengalami perubahan warna sama sekali (warna larutan masih tetap biru) -waktu 21 menit 39.47 detik -dengan waktu yang sama dengan tabung B tanpa malonat , teramati bahwa larutan tidak mengalami perubahan warna sama sekali (warna larutan tetap biru) -waktu 9 menit 38.1 detik - dengan waktu yang sama dengan tabung C tanpa malonat , teramati bahwa larutan tidak mengalami perubahan warna sama sekali (warna larutan tetap biru)

Tabung B (dengan malonat) 0.5mL metilen biru +0.5 mL Na-suksinat + 5mL Buffer pH 7.0 + 0.5 mL Na-malonat + 0.5mL homogenate Tabung C (dengan malonat) 0.5mL metilen biru +0.5 mL Na-suksinat + 5mL Buffer pH 7.0 + 0.5 mL Na-malonat + 0.5mL homogenate panas

IV. Pembahasan Pada percobaan ini akan dilihat perbandingan aktivtitas suatu enzim dalam mengatalisis reaksi dengan menggunakan inhibitor dan tanpa menggunakan inhibitor. Bahan-bahan yang digunakand alam percobaan ini adalah homogenate dari hati sapi; larutan sukrosa 0.25 M ; 0.05% w/v metilen biru; Buffer fosfat pH 7.0 50mM; larutan Na-suksinat 0.1 M; larutan Na-Malonat 0.5 M dan paraffin oil. Homogenat hari sapi terbuat dari campuran hati sapi dengan larutan sukrosa 0.25M yang berfungsi sebagai sumber enzim suksinat dehidrogenase.. Metilen biru digunakan sebagai indikator terjadinya reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat. Metilen biru yang dalam keadaan teroksidasi akan berwarna biru sedangkan dalam keadaan tereduksi tidak berwarna. Buffer fosfat pH 7.0 berfungsi untuk menjaga kondisi pH larutan , karena enzim suksinat dehidrogenase bekerja maksimum pada pH 7. Larutan Na-suksinat digunakan sebagai substrat (suksinat) dan Na-malonat digunakan sebagai inhibitor. Hati yang yang dicampur dengan larutan sukrosa kemudian dihomogenkan. Homogenasi dengan sukrosa ini berfungsi untuk mengekstrak enzim suksinat dehidrogenase yang terkandung dalam hati sapi, karena sukrosa dapat melisis membran sel dengan cara membuat larutan di luar sel menjadi hipertonis, sehingga protein-protein yang di dalam sel hati (enzim suksinat dehidrogenase) terekstrak ke luar. Percobaan dilakukan sebanyak 2 kali untuk mengamati perbedaan aktivitas enzim suksinat dehidrogenase pada saat tidak ada inhibitor dan tanpa inhibitor. Percobaan pertama dilakukan untuk melihat aktivitas enzim pada saat tidak ada inhibitor. Komposisi masing-masing tabung A, B dan C dibuat berbeda.Homogenat yang diberikan pada tabung A dan B tidak dipanaskan terlebih dahulu dan pada tabung A tidak ditambahkan Na-suksinat. Sedangkan pada tabung C, homogenate yang ditambahkan dipanaskan terlebih dahulu.Pemanasan homogenate dilakukan untuk membuat enzim terdenaturasi sehingga enzim menjadi rusak dan tidak dapat berfungsi sebagaimana mestinya. Pengamatan kedua dilakukan dengan menambahkan Na-malonat sebagai inhibitor pada masing-masing tabung A, B, dan C. Tujuan dilakukannya vakum pada masing-masing reaksi adalah untuk menghilangkan pengaruh oksigen dari dalam tabung. Ada 3 step yang dilakukan untuk mencegah oksigen dari udara masuk ke dalam tabung Thunberg dan menghilangkan oksigen yang berada dalam tabung. Langkah pertama yang dilakukan adalah meneteskan parafin oil pada campuran reaksi di dalam tabung, tahap kedua adalah pemberian vaselin pada tutup tabung Thunberg untuk membuat lapisan antar tutup tabung dengan tutup tabung menjadi kedap udara, dan tahap terakhir adalah pemvakuman tabung.Keberadaan oksigen dapat mengoksidasi kembali metilen biru yang telah tereduksi, sehingga waktu berhentinya reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat tidak dapat diketahui secara kualitatif. Proses inkubasi dilakukan untuk memberikan waktu untuk enzim mengatalisis reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat. Inkubasi dilakukan pada suhu 37o C karena pada suhu ini enzim dapat bekerja secara optimum, sesuai dengan suhu tubuh sapi atau manusia di mana reaksi siklus asam sitrat terjadi. Dari hasil pengamatan pada percobaan pertama, tabung A tanpa malonat tidak menghasilkan perubahan warna sama sekali setelah dilakukan inkubasi. Hal ini dikarenakan pada tabung A tidak terdapat Na-suksinat sehingga tidak ada substrat yang terlibat dalam reaksi, secara otomatis tidak

ada reaksi yang berlangsung. Pada tabung B tanpa malonat, teramati bahwa perubahan warna larutan menjadi putih membutuhkan waktu inkubasi 20 menit 21.22 detik. Perubahan warna larutan dari biru menjadi putih menunjukkan reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat yang dikatalisis menggunakan enzim suksinat dehidrogenase berlangsung. Perubahan warna ini berasal dari metilen biru yang dalam keadaan tereduksi berubah warna dari biru menjadi tidak berwarna. Pada tabung C tanpa malonat dengan homogenate yang dipanaskan tidak teramati perubahan warna larutan sama sekali. Hal ini disebabkan oleh enzim yang terdenaturasi akibat pemanasan. Selanjutnya pada percobaan kedua, pada masing-masing tabung ditambahkan Na-malonat sebanyak 0.5 mL dengan semua perilaku yang diberikan dibuat sama. Pada tabung A dengan malonat, dengan waktu inkubasi yang sama dengan tabung A tanpa malonat, tidak teramati adanya perubahan warna larutan. Hal ini disebabkan karena tidak adanya substrat yang terlibat dalam reaksi. Pada tabung B dengan malonat, dengan waktu inkubasi yang sama dengan tabung B tanpa malonat, tidak teramati juga adanya perubahan warna larutan. Malonat yang memiliki struktur yang mirip dengan suksinat menempel pada sisi katalitik enzim namun tidak dapat terjadi reaksi. Hal ini mengakibatkan sisi aktif enzim tidak dapat bereaksi dengan dengan suksinat karena telah disisipi oleh malonat, sehingga reaksi oksidasi tidak dapat berlangsung. Karena tidak ada aktivitas enzim yang teramati, maka pada percobaan ini, malonat bertindak sebagai inhibitor. Pada tabung C dengan malonat serta homogenate panas dan dengan waktu inkubasi yang dibuat sama dengan tabung C tanpa malonat, teramati bahwa tidak ada perubahan warna larutan sama sekali. Hal ini dikarenakan enzim yang terdenaturasi akibat proses pemanasan homogenate sehingga enzim menjadi rusak dan tidak dapat berfungsi sebagaimana mestinya. Reaksi yang berlangsung pada proses oksidasi suksinat menjadi fumarat dengan katalis enzim suksinat dehidrogenase adalah sebagai berikut :

Penambahan malonat yang berperan sebagai inhibitor menyebabkan terbentuknya kompleks enzim inhibitor (EI) sehingga tidak terbentuknya kompleks enzim substrat (ES)

Mekanisme reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat dengan menggunakan inhibitor malonat, secara umum sebagai berikut :

V. Kesimpulan VI. Daftar Pustaka http://instruction2.mtsac.edu/crexach/physiology/pdf%20phys%20lab%20support%20and%20suppl ement/Lab%20Concepts%20compet%20inhibition.pdf