PEMBUATAN & PEWARNAAN APUSAN DARAH TEPI

Tujuan a. Tujuan Instruksional Umum Mahasiswa dapat memahami cara pembuatan preparat apusan darah dengan metode apus. Mahasiswa dapat memahami cara pewarnaan hapusan darah tepi untuk menilai berbagai unsur sel darah tepi seperti RBC, WBC, Platelet.

b. Tujuan Instruksional Khusus Mahasiswa dapat meakukan pembuatan preparat apusan darah dengan metode apus. Mahasiswa mengetahui teknik pewarnaan hapusan darah tepi yang baik dan benar untuk menilai berbagai unsur sel darah tepi seperti RBC, WBC, Platelet. Mahasiswa mampu melakukan pewarnaan hapusan darah tepi dengan metode Romanowsky, untuk menilai berbagai unsur sel darah tepi seperti RBC, WBC, Platelet.

Metode Metode yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah metode apus (smear) serta pewarnaan hapusan darah dengan metode Romanowsky (Giemsa)

Prinsip a. Pembuatan apusan darah tipis Setetes darah dipaparkan di atas sebuah glas objek, aca perata di dorong sepanjang kaca sediaan, kemudian dilakukan pewarnaan. b. Pewarnaan Giemsa Penambahan larutan metilen biru dan eosin yang dilarutkan di dalam methanol akan membentuk presipitasi hitam. Yaitu dua zat warna yang berbeda yaitu Azur B ( Trimetiltionin ) yang bersifat basa dan eosin y ( tetrabromoflurescin ) yang bersifat asam seperti kromatin, DNA dan RNA. Sedangkan eosin y akan mewarnai komponen sel yang

bersifat basa seperti granula, eosinofili dan hemoglobin. Ikatan eosin y pada azur B yang beragregasi dapat menimbulkan warna ungu, dan keadaan ini dikenal sebagai efek Romanowsky giemsa.

DASAR TEORI Sel darah pada umumnya dikenal ada tiga tipe yaitu: eritrosit, lekosit dan trombosit. Eritrosit manusia dalam keadaan normal berbentuk cakram bulat bikonkaf dengan diameter 7,2 m tanpa inti, lebih dari separuh komposisi eritrosit terdiri dari air (60%) dan sisanya berbentuk substansi koloidal padat. Sel ini bersifat elastis dan lunak. Lekosit (sel darah putih) terdapat pada bagian pinggir sel darah, lekosit ini dibagi menjadi dua yaitu granulosit dan agranulosit. Trombosit (disebut juga keping darah), berbentuk sebagai keping-keping sitoplasma lengkap dengan membran yang mengelilinginya, Trombosit terdapat khusus pada sel darah mammalia. Untuk melihat struktur sel-sel darah dengan mikroskop cahaya pada umumnya dibuat sediaan apus darah. Sediaan apus darah ini tidak hanya digunakan untuk mempelajari sel darah tapi juga digunakan untuk menghitung perbandingan jumlah masing-masing sel darah. Pembuatan preparat apus darah ini menggunakan suatu metode yang disebut metode apusan (metode smear) yang merupakan suatu sediaan dengan jalan mengoles atau membuat selaput (film) dan substansi yang berupa cairan atau bukan cairan di atas gelas benda yang bersih dan bebas lemak untuk kemudian difiksasi dan diwarnai (Handari, 2003).

a. Sedian Darah Tepi Pemeriksaan preparat apus darah tepi merupakan pemeriksaan darah rutin dan pemeriksaan penyaring. Pemeriksaan darah rutin terdiri dari hemoglobin, jumlah lekosit, hitung jenis lekosit , dan laju endapan darah. Pemeriksaan penyaring terdiri dari gambaran darah tepi, jumlah eritrosit, hematokrit, indeks eritrosit, jumlah retikolosit, dan trombosit. (Budiwiyono I,1995) Menurut jenisnya preparat apus darah tepi dibagi menjadi dua yaitu sediaan hapus darah tipis dan sediaan hapus darah tebal. (Ismid IS, 2000) Preparat darah apus tipis yaitu preparat yang sedikit membutuhkan darah untuk pemeriksaan dibandingkan dengan preparat darah apus

tebal, morfologinya lebih jelas, dan perubahaan pada eritrosit dapat terlihat jelas.(Budiwiyono I,1995) Jenis Apusan darah: 1. Sediaan darah tipis Ciri-ciri sediaan apus darah tipis yaitu lebih sedikit membutuhkan darah untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tebal, morfologinya lebih jelas, dan perubahan pada eritrosit dapat terlihat jelas. 2. Sedian darah tebal Ciri-ciri sediaan apus darah tebal yaitu lebih banyak membutuhkan darah untuk pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tipis, jumlah selnya lebih banyak dalam satu lapang pandang, dan bentuknya tak sama seperti dalam sediaan apus darah tipis (Imam Budiwiyono 1995). Sediaan apus yang dibuat dan dipulas dengan baik merupakan syarat mutlak untuk mendapatkan hasil pemeriksaan yang baik. Bahan pemeriksaan yang terbaik adalah darah segar yang berasal dari kapiler atau vena yang dihapuskan pada kaca objek. Pada keadaa tertentu dapat pula digunakan darah EDTA. (Arjatmo Tjokronegoro, 1996) Pada sediaa apus yang baik akan diperoleh juga distribusi sel yang baik,hal ini penting dalam hal memperoleh hasil hitung jenis leukosit yang benar dan dalam melakukan evaluasi gambaran darah tepi. Apusan diatas kaca sediaan dapat dibagi menjadi 3 bagian : 1. Bagian Pangkal (Head) yaitu bagian dimana tetesan darah mulai diapuskan. Pada bagian ini sebagian besar eritrosit tampak(dibawah tabung mikroskop)terletak tumpang tindih. 2. Bagian Tengah (Body) dimana letak sebagian eritrosit mulai terpisah dan sebagian lainya masih tumpang tindih. 3. Bagian Ujung (Tail) yaitu bagian paling tipisdibagian ini eritrosit kelihatan saling berpisah atau bersinggungan.

Gambar: Sediaan Hapusan Darah

Distribusi leukosit terjadi di bagian pangkal sampai dibagian ujung apusan.Biasanya limfosit cenderung berada dibagian tepi dan ujung apusan,makin tipis sediaan yang dibuat maka makin besar proporsi sel-sel segmen di bagian ujung. Sediaan yang terlalu tebal akan menyebabkan pengecatan sediaan makin sukar menyebabkan sel-sel leukosit tampak lebih kecil sehingga menyulitkan identifikasi sel.

b. Pewarnaan Sediaan Darah Tepi Macam-macam pewarnaan menurut Romanowsky ada 4, yaitu pewarnaan Wrights stain, pewarnaan Liesman, pewarnaan May Grunwald dan pewarnaan Giemsa. Pulasan Wright Zat pulas Wright mengandung eosin Y, azure B, metilen blue, dan metil alcohol dalam
konsentrasi tinggi, sehingga tidak perlu mengadakan fiksasi tersendiri. Zat pulas Wright dapat dibeli

dalam bentuk serbuk atau sebagai cairan siap pakai. Untuk membuat larutan koloid yang siap pakai larutan ini harus dilarutkan dalam metil alkohol, tiap 0,1 g serbuk itu digerus dalam sebuah mortar dengan metal alkohol ditambahkan sedikit demi sedikit sampai 60 ml. Simpanlah larutan itu dalam botol berwarna yang diisi sampai penuh, kocoklah isinya setiap hari. Larutan itu 10 hari cukup matang digunakan. Jauhkan larutan Wright dari uap asam atau basa. Tutuplah botol dengan rapat agar tidak kemasukan hawa lembab. Hasil pewarnaan menggunakan pulasan Wright yakni, eritrosit akan tampak berwarna merah-jingga; bila tampak lebih biru, bisa disebabkan karena pH buffer terlalu alkalis atau pencucian kurang bersih. Inti lekosit tampak berwarna ungu; bila tampak lebih biru, ini

disebabkan karena waktu pengecatan yang terlalu singkat. Waktu fiksasi dan pengecatan harus ditetapkan setiap menggunakan bahan cat baru utk mendapatkan hasil pengecatan yang ideal. Pulasan Giemsa Pewarnaan Giemsa disebut juga pewarnaaan Romanowski. Metode pewarnaan ini banyak digunakan untuk mempelajari morfologi sel-sel darah, sel-sel lien, sel-sel sumsum dan juga untuk mengidentifikasi parasit-parasit darah misal Tripanosoma, Psedopodia dan lain-lain dari golongan protozoa. Pewarnaan giemsa adalah pulasan yang terdiri dari eosin, metilin azur dan
metilen blue berguna untuk mewarnai sel darah dan melakukan fiksasi sendiri dengan metil alkohol.

Dasar pewarnaan Giemsa adalah presipitasi hitam yang terbentuk dari penambahan larutan metilen biru dan eosin yang dilarutkan di dalam metanol. Yaitu dua zat warna yang berbeda yaitu Azur B ( Trimetiltionin ) yang bersifat basa dan eosin y ( tetrabromoflurescin ) yang bersifat asam seperti kromatin, DNA dan RNA. Sedangkan eosin y akan mewarnai komponen sel yang bersifat basa seperti granula, eosinofili dan hemoglobin. Ikatan eosin y pada azur B yang beragregasi dapat menimbulkan warna ungu, dan keadaan ini dikenal sebagai efek Romanowsky giemsa. Efek ini terjadi sangat nyata pada DNA tetapi tidak terjadi pada RNA sehingga akan menimbulkan kontras antara inti yang berwarna dengan sitoplasma yang berwarna biru. ( Arjatmo Tjokronegoro, 1996) Zat warna yang digunakan adalah Giemsa yang sebelumnya telah diencerkan dengan aquades. Sediaan apus yang telah dikeringkan diudara, difiksasi dulu dengan methyl alkohol selama 3-5 menit. Semakin lama pewarnaan yang dilakukan maka intensitasnya menjadi semakin tua. Preparat apus yang yang telah selesai dibuat kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x. Gambar yang didapat dalam hasil menunjukan sel-sel butir darah baik eritrosit, leukosit, trombosit, atau yang lain. Hasil pewarnaan dengan giemsa pada darah manusia akan memperlihatkan eritrosit berwarna merah muda, nukleolus lekosit berwarna ungu kebiru-biruan, sitoplasma lekosit berwarna sangat ungu muda, granula dari lekosit eosinofil berwarna ungu tua, granula dari lekosit netrofil dan lekosit basofil berwarna ungu. Pembuatan sediaan apus menggunakan beberapa bahan yang berupa larutan-larutan khusus yang memiliki fungsi masing-masing. Diantaranya menggunakan methanol/ alkohol 100%, alkohol ini diteteskan ke atas sediaan, sehingga bagian yang terlapis darah tertutup seluruhnya. Metanol atau alkohol ini berfungsi dalam proses fiksasi yaitu untuk membunuh sel-

sel pada sediaan tersebut tanpa mengubah posisi (struktur) organel yang ada di dalamnya. Dari literatur lain disebutkan, tujuan fiksasi adalah untuk menghentikan proses metabolisme secara cepat, mencegah kerusakan jaringan, mengawetkan komponen-komponen sitologis dan histologist, mengawetkan keadaan sebenarnya, dan mengeraskan (Rudyatmi, 2011). Perbedaan pulasan giemsa dengan pulasan wright yaitu dengan pulasan giemsa, granul basofil tidak terlihat karena granula akan larut dan pulasan ini baik untuk melihat bentuk dari eritrosit. Sementara itu, pulasan wright baik untuk darah yang banyak mengandung sel sel muda dan sediaan sumsum tulang karena struktur plasma dan inti lebih jelas terlihat. May Grunwald Giemsa Merupakan pewarnaan yang biasanya digunakan untuk mewarnai bone marrow smear dan peripheral blood film. Dengan prinsip Romanowsky, yaitu : o Methylene blue: Pewarna alkali (basic) mewarnakan nukleus dan beberapa struktur sitoplsma dengan warna biru atau purple.(struktur DNA & RNA). o Eosin: Mewarnakan struktur sitoplasma dengan warna orange merah (struktur protien dengan warna kuning), tetapi apabila suatu struktur sitoplasma mengambil kedua pewarna, warna pink atau lilac akan terhasil mewarnakan sturktur itu.

E. Alat dan Bahan a. Alat Pipet tetes Objek glass Jembatan pengecatan Botol semprot Beaker glass

b. Bahan Aquades Darah

Reagen Pewarna Giemsa Zat warna giemsa Methanol absolut 1g 10 ml

Buffer Phosphat pH 6,4 Bufer fosfat ini terdiri dari KH2PO4 dan Na2HPO4 KH2PO4 Na2HPO4 Aquades 6,63% 3,20% 1L

F. Prosedur
1. Pembuatan Hapusan Darah Tipis: 1. Menyentuhkan ujung objek glass lain yang bersih pada ujung objek glass yang telah ditetesi darah dengan posisi sudut 450,tarik mundur menyentuh tetesan darah (untuk meratakan penyebaran darah). 2. Setelah tetesan darah melebar ( 3 cm), dorong ujumg objek glass lain , ke arah depan dengan cepat dan merata hingga hapusan terlihat tipis. 3. Mengeringkan hapusan darah di udara terbuka. 4. Memberi tanda pada kaca benda yang ada hapusan darahnya.

2. Pewarnaan Giemsa 1. Letakkan sediaan apus pada dua batang gelas di atas bak tempat pewarnaan. 2. Fiksasi sediaan apus dengan metanol absolut 2 3 menit. 3. Genangi sediaan apus dengan zat warna Giemsa yang baru diencerkan. Larutan Giemsa yang dipakai adalah 5%, diencerkan dulu dengan larutan dapar. Biarkan selama 20 30 menit. 4. Bilas dengan air ledeng, mula-mula dengan aliran lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan zat warna. Letakkan sediaan hapus dalam rak dalam posisi tegak dan biarkan mengering.

G. Interpretasi Hasil Hasil pewarnaan dengan Giemsa: Eritrosit berwarna merah muda Nukleolus lekosit berwarna ungu kebiru-biruan Sitoplasma lekosit berwarna sangat ungu muda Granula dari lekosit eosinofil berwarna ungu tua Granula dari lekosit netrofil dan lekosit basofil berwarna ungu.
DAFTAR PUSTAKA

Arjatmo Tjokronegoro. 1996. Sediaan Apus Darah Tepi. Available on: http://digilib.unimus.ac.id/files/disk1/107/jtptunimus-gdl-faridapras-5318-2bab2.padaf (diakses pada 15 Maret 2014) Budiwiyono I. 1995.Apusan Darah. Available on: http://digilib.unimus.ac.id/files/disk1/139/jtptunimus-gdl-maryovegas-6908-2babi.padaf (diakses pada 15 Maret 2014) Budiwiyono, Imam. 1995. Prinsip Pemeriksaan Preparat Hapus Darah Tepi. Dalam : Imam BW, Purwanto AP ed. Workshop Hematologi III. Keganasan Hematologik. Pembacaan Preparat Darah Hapus (Workshop Hematologi III). Bagian PK FK Undip. Semarang. Online. Available on:

http://sketsaistjourney.wordpress.com/2013/03/23/hemoglobin-dan-apusan-darah/, (diakses pada 3 Maret 2014) Rudyatmi,Eli. 2011. Bahan Ajar Mikroteknik. Semarang: Jurusan Biologi FMIPA UNNES. Available on: http://mahendrabio.blogspot.com/p/laporan-praktikum-mikrotekpembuatan.html (diakses pada 15 Maret 2014)