Oleh :

Maman SF., S.Si, M.Biomed.

Departemen Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran
UniversitasPembangunan Nasional
Sebelum pembelahan sel seluruh
molekul DNA harus diduplikasi
Duplikasi suatu molekul DNA menjadi 2
molekul DNA disebut replikasi
Terdapat 3 model replikasi DNA:
1.Semikonservatif
2.Konservatif
3.Dispersif
REPLIKASI DNA
Replikasi DNA :
M.S. Meselson & F.W. Stahl (1958)
E. coli medium yang mengandung isotop
15
N
(isotop berat)
+ beberapa generasi
medium yang mengandung isotop
14
N
(isotop ringan)
+
sentrifugasi gradien densitas
DNA hibrid
DNA berat (
15
N) DNA ringan (
14
N)
Replikasi DNA :
Meselson & Stahl 1958
Denaturasi & Renaturasi DNA :
DNA dupleks dipanaskan pemisahan
dan perubahan sifat fisik DNA
Denaturasi peningkatan absorbans
UV DNA efek hiperkromik
Titik leleh (melting temperature = Tm)
suhu pada saat setengah dari
hiperkromasitas maksimum tercapai
Denaturasi & Renaturasi DNA :
R
e
l
a
t
i
v
e

a
b
s
o
r
b
a
n
c
e

a
t

2
6
0

n
m

P
e
r
c
e
n
t

h
y
p
e
r
c
h
r
o
m
i
c
i
t
y

Kondisi yang dapat menyebabkan
denaturasi: suhu yang tinggi, konsentrasi
garam yang rendah, pH tinggi
Apabila suhu larutan DNA, yang
terdenaturasi oleh suhu tinggi, diturunkan
sekitar 25
o
C di bawah Tm terjadi
renaturasi dupleks DNA
annealing
Denaturasi & Renaturasi DNA :
Mekanisme replikasi pada umumnya:
Kompleks duplikasi DNA berjalan
simultan dupleks DNA harus terpisah
dan mengalami unwinding
Berjalan dengan cepat
Akurat untuk menjamin integritas alur
penyampaian informasi genetik
Replikasi DNA :
Replikasi DNA :
Replikasi DNA sirkular pada prokariota
disebut sebagai replikasi u (membentuk
struktur seperti u)
Struktur u menunjukkan adanya pemisahan
untai DNA asal yang disertai sintesis DNA
komplementer membentuk DNA baru
Replikasi DNA :
Replikasi DNA dimulai dari suatu tempat
khusus yang disebut origin of replications
replikasi berjalan ke dua arah menjauhi
tempat inisiasi gelembung replikasi
Replication origins:
Pada eukaryota: ratusan hingga ribuan
banyak gelembung replikasi
Pada prokariota: hanya satu satu
gelembung replikasi
Replikasi DNA :
Percabangan pada gelembung replikasi
disebut garpu replikasi
Garpu replikasi tempat tumbuhnya DNA
baru

Replikasi DNA :
Tahap Elongasi
Arah replikasi: 5 3
DNA polimerase hanya dapat menambahkan
nukleotida pada ujung 3 untai DNA yang
baru perlu primer RNA

Replikasi DNA :
Replikasi DNA :
Replikasi DNA :
Primer RNA
Mengawali sintesis DNA karena DNA
polimerase memerlukan ujung 3-OH bebas
untuk penambahan nukleotida
Panjang primer tergantung spesies
berkisar 1-60 nukleotida
Sintesis primer RNA dikatalisis oleh primase
dan RNA polimerase
Replikasi DNA :
Primer RNA :
Primase sintesis primer RNA pada lagging
strand
Primase & RNA polimerase bekerja sinergistik
sintesis primer RNA pada leading strand
Setelah sintesis DNA berjalan primer RNA
disingkirkan dan diganti dengan basa DNA
oleh DNA polimerase
Replikasi DNA :
Mengawali sintesis DNA dengan RNA
Arah replikasi kedua untai DNA adalah searah
kedua untai DNA disintesis dengan cara
yang berbeda (semidiskontinu):
Leading strand: sintesis berjalan dari 5
3 secara kontinu sesuai arah garpu replikasi
Lagging strand: sintesis berjalan dari 5
3 secara diskontinu dengan cara back & fill
disebut fragmen Okazaki
Replikasi DNA :
21
REPLIKASI DNA
Replikasi DNA :
Fragmen Okazaki:
Pada E.coli: 1000-2000 nukleotida
Pada eukaryota: 100-200 nukleotida
Disambung oleh DNA ligase
Replikasi DNA :
DNA ligase
Menyambung fragmen Okazaki
Mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara ujung 3-OH pada DNA
yang satu dengan ujung 5-P pada DNA
yang lain
Perlu energi dari hidrolisis:
NAD
+
NMN
+
+ AMP (pada E. coli)
ATP PPi + AMP (pada eukariota)
Replikasi DNA :
Replikasi DNA :
DNA polimerase mengkatalisis sintesis
untai DNA yang baru
Komponen yang diperlukan untuk reaksi
polimerisasi:
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Mg
2+

Primer RNA (ujung 3-OH bebas)
Cetakan (template) DNA

Replikasi DNA :
Reaksi polimerisasi terjadi melalui
serangan nukleofilik ujung 3 terhadap
atom Po pada nukleotida trifosfat
Pada saat nukleotida trifosfat ditambahkan
terlepas 2 molekul fosfat yang disertai
energi eksorgenik mendorong energi
endorgenik untuk pembentukan ikatan
antar nukleotida
DNA
n
+ dNTP DNA
n+1
+ PPi
Replikasi DNA :
Replikasi DNA :
Replikasi DNA Prokariota
Tahap Inisiasi
Replikasi dimulai pada daerah OriC
Beberapa protein terlibat pada tahap
inisiasi replikasi
Replikasi DNA Prokariota :
DnaA terikat pada situs 9 nt
+
OriC terbuka pada daerah AT-rich
+
pengikatan kompleks DnaB (helikase)-DnaC
DnaC-DnaC
+
unwinding DNA
(dipertahankan oleh SSBP)
+
pembentukan primer RNA
+
Replikasi DNA
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Inisiasi
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Inisiasi
Protein yang diperlukan pada inisiasi
replikasi DNA:
DnaA membuka heliks DNA pada OriC
DnaB (helikase) unwinding DNA
memerlukan ATP
Tahap Inisiasi
DnaB (helikase)
pd prokariota ada 2: helikase II (utk
lagging strand) & prot Rep (utk leading
strand)

Helikase II Protein Rep
Leading
strand
Lagging
strand
3
5
5
3
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Inisiasi
SSBP (single stranded binding protein)
mempertahankan DNA tetap dalam bentuk
untai tunggal
Tidak perlu ATP
Helikase II
Protein Rep
3
5
5
3
SSBP
Replikasi DNA Prokariota :
DnaC diperlukan untuk pengikatan
DnaB pada OriC
DnaG (primase) sintesis primer RNA
DNA girase (DNA topoisomerase II)
membentuk negative supercoiled DNA
untuk membebaskan tegangan torsional
yang disebabkan oleh aktivitas helikase
membantu proses unwinding berikutnya

Replikasi DNA Prokariota :
Replikasi DNA Prokariota :
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Elongasi
Sintesis DNA dikatalisis oleh enzim DNA
Polimerase
Pada prokariota ditemukan 3 tipe DNA
polimerasi: DNA polimerase I, II dan III
Fragmen Okazaki disambung oleh DNA
ligase
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase I
Diisolasi dari E.coli oleh Arthur Kornberg
(1957)
Merupakan rantai polipeptida tunggal
BM 103 kD
N
C
fragmen kecil fragmen besar (fragmen Klenow)
Eksonuklease 53 Eksonuklease 35 Polimerase
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase I :
Aktivitas:
Polimerase 5 3:
Penambahan basa yang komplementer
dengan cetakan
Mensintesis DNA 20 nukleotida
Kecepatan: 10 nukleotida/detik
Tingkat kesalahan 1 x 10
-4

Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase I :
Aktivitas:
Proof reading: eksonuklease 3 5
Diaktifkan oleh nukleotida ujung 3
yang tidak berpasangan
Hidrolisis oleh
eksonuklease 3 5
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase I :
Aktivitas:
Proof reading: eksonuklease 3 5
Mencegah kesalahan selama proses
replikasi
Tingkat kesalahan 1 x 10
-4




Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase I :
Aktivitas:
Koreksi kesalahan: eksonuklease 53
Memotong hingga 10 nukleotida dari
ujung 5
Berperan pada:
Sistem perbaikan DNA pada mutasi
akibat UV dan mutagen kimia
Pemotongan primer RNA

Replikasi DNA Prokariota :
Hidrolisis oleh
eksonuklease 5 3
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase II
BM 90 kD
Aktivitas:
Polimerase
Eksonuklease 35
Lebih berperan pada perbaikan DNA
Kecepatan: 5-10 nukleotida/detik
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase III
Merupakan enzim untuk replikasi DNA
kromosomal
BM 900 kD
Merupakan suatu holoenzim, terdiri atas
>10 subunit protein subunit o, u, c
sebagai core enzyme

Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase III
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase III
Aktivitas utama:
Polimerisasi
Subunit o
Sintesis DNA hingga ribuan nukleotida
Kecepatan: 1000 nukleotida/detik
Eksonuklease 35
Subunit c
Editor utama replikasi DNA ketelitian
replikasi meningkat hingga 200 kali
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase III
Aktivitas subunit lain:
Subunit partisipasi pd inisiasi replikasi
Subunit | 2 molekul subunit ini
mcengkram DNA cetakan (sliding clamp)

Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase III
Aktivitas subunit lain:
Subunit _, , o, o, t, loader clamp
Subunit u berperan pada interaksi
subunit o dengan subunit lain

Replikasi DNA Prokariota :
Koordinasi sintesis leading & lagging strand
Replikasi DNA Prokariota :
Koordinasi sintesis leading & lagging strand
Replikasi DNA Prokariota :
Koordinasi sintesis leading & lagging strand
2 molekul DNA polimerase III didekatkan
oleh subunit t
Besar lengkung DNA bertambah saat
sintesis lagging strand
Setelah fragmen Okazaki selesai
disintesis DNA polimerase lagging
strand dipindahkan untuk mensintesis
fragmen berikut
Replikasi DNA Prokariota :
Koordinasi sintesis leading & lagging strand
Lodish et al., Molecular Cell Biology, 4
th
edition
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Terminasi
Pada lokus Ter (T) berseberangan
dengan OriC (Promotor)
Lokus Ter terdiri atas sekuens
GTGTGTTGT berikatan dengan protein
Tus terminasi sintesis DNA
Ikatan protein Tus Ter berinteraksi
dengan DnaB menghambat aktivitas
helikase DnaB

Replikasi DNA Prokariota :
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Terminasi
Replikasi searah jarum jam: melalui Ter E,
Ter D, Ter A dan berhenti pada Ter C atau
Ter B atau Ter F
Replikasi berlawanan arah jarum jam:
melalui Ter F, Ter B, Ter C dan berhenti
pada Ter A atau Ter D atau Ter E

Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Terminasi
Replikasi DNA Eukariota
Siklus sel terbagi menjadi 4 fase: fase M,
fase G
1
, fase S, fase G
2

Replikasi DNA eukariota berlangsung pada
fase S siklus sel sebelum pembelahan sel
pada fase M
Replikasi DNA Eukariota :
Tahap Inisiasi
Replication origin pada eukariota: ARS
(autonomously replicating sequence)
terdiri atas 100-200 bp mengandung
sekuens kaya-AT
Protein Origin Recognition Complex (ORC)
analog DnaA pada E. coli berikatan
dengan ARS
Tahap Elongasi
Ada 5 tipe DNA polimerase pada eukariota:
DNA polimerase o, , , o dan c
Sintesis leading dan lagging strand
dilakukan oleh enzim polimerase yang
berbeda
Replikasi DNA Eukariota :
DNA polimerase o
Terdapat di nukleus; > 250 kD
Aktivitas:
Replikasi DNA 53
Sintesis 100-200 nukleotida lagging
strand
Kecepatan: 50 nukleotida/detik
Primase
Sintesis primer RNA: 5-15 nukleotida

Replikasi DNA Eukariota :
DNA polimerase o
Terdapat di nukleus; 170 kD
Aktivitas:
Replikasi DNA 53
Replikasi seluruh cetakan DNA
sintesis leading strand
Eksonuklease 35
Aktivitas proofread
Replikasi DNA Eukariota :
DNA polimerase c
Terdapat di nukleus; 256 kD
Aktivitas:
Replikasi DNA 53
Tidak membentuk kompleks dengan
PCNA
Berperan pada perbaikan DNA dan
sintesis DNA pada celah antar fragmen
Okazaki

Replikasi DNA Eukariota :
DNA polimerase c
Aktivitas:
Eksonuklease 35
Aktivitas proofread utama
Eksonuklease 53
Berperan pada perbaikan kerusakan
DNA akibat radiasi UV

Replikasi DNA Eukariota :
DNA polimerase |
Polimerase yang paling kecil (36-38 kD)
Fungsi: untuk perbaikan DNA

DNA polimerase
Terdapat di mitokondria; 160-200 kD
Fungsi: replikasi DNA mitokondria


Replikasi DNA Eukariota :
DNA polimerase
Sintesis leading strand mendahului sintesis
lagging strand setelah sintesis leading
strand mencapai 2/3 dari kromosom
mitokondria cetakan lagging strand
terpapar mulai bereplikasi dengan arah
yang berlawanan
Leading strand menggantikan cetakan
untuk lagging strand D-loop
Replikasi DNA Eukariota :
Replikasi DNA mitokondria
Replikasi DNA Eukariota :
PCNA
Merupakan protein trimerik
Hanya terdapat pada nukleus sel yang
berproliferasi
Berperan sebagai clamp kompleks DNA
polimerase o - PCNA sintesis leading
strand
Analog subunit | DNA polimerase III pada
E.coli
Replikasi DNA Eukariota :
RNase H1 & FEN (Flap Endonuclease-1)
RNase H1 memotong primer RNA
meninggalkan ribonukleotida pada ujung
5 di dekat DNA disingkirkan oleh FEN
Celah yang terbentuk akan diisi oleh DNA
polimerase o
Replikasi DNA Eukariota :
Replication factor C (RFC)
Berikatan dengan DNA polimerase o
Membantu asosiasi DNA dengan PCNA

Replication factor A (RFA) = Replication
protein A (RPA)
Analog SSBP pada replikasi DNA
prokariota
Replikasi DNA Eukariota :
Replikasi DNA Eukariota :
Replikasi DNA Eukariota :
Kromosom linier menimbulkan masalah
pada akhir replikasi (end replication
problem):
lagging strand tidak dapat lengkap
disintesis
kromosom menjadi semakin pendek
setelah setiap kali replikasi
+
Dapat diatasi dengan telomer
Replikasi DNA Eukariota :
Pada akhir replikasi terdapat celah (gap)
pada ujung lagging strand setelah primer
RNA disingkirkan
Untuk mengatasi masalah ini sel eukariota
mereplikasi ujung kromosomnya
disebut telomer
Replikasi DNA Eukariota :
Telomer
Mengandung sekuens berulang pada
manusia: 5-TTAGGG-3
Disintesis oleh telomerase
Replikasi DNA Eukariota :
Telomerase
Merupakan reverse transcriptase
Mengandung komponen protein dan RNA
RNA berfungsi sebagai cetakan
Penambahan telomer mengimbangi
pemendekan kromosom akibat replikasi
Telomere binding protein melindungi ujung
kromosom dari nuklease
Replikasi DNA Eukariota :