"Denaturasi, Renaturasi, dan Perbaikan DNA"

Denaturasi DNA
Denaturasi adalah untai ganda molekul DNA yang dapat dipisahkan dengan perlakuan suhu
maupun senyawa alkali sehingga konformasinya berubah dan dapat hampir menjadi
acak.Tingkat denaturasi DNA tergantung pada tingginya suhu. Perubahan tingkat denaturasi
DNA dapat diikuti dengan memperlakukan DNA pada suhu yang bertingkat, kemudian
diukur absorbansinya (A) pada panjang gelombang 260. Perlu diketahui bahwa basa asam
nukleat menyerap dengan kuat cahaya pada panjang gelombang 260. Kurva hubungan antara
peningkatan suhu dengan suhu dengan nilai A
260
menunjukkan perubahan tingkat denaturasi
DNA. Banyaknya cahaya dapat diserap oleh molekul DNA tergantung pada struktur
molekulnya. Semakin teratur molekulnya maka semakin sedikit cahaya yang diserap. Oleh
karena itu nukleotida bebas menyerap cahaya lebih besar daripada molekul DNA untai
tunggal atau RNA. Nilai serapan cahaya oleh molekul DNA dengan struktur DNA tetapi
dengan konsentrasi yang sama (50mg/ml) adalah sebagai berikut :
DNA untai ganda A
260
= 1,0
DNA untai tunggal A
260
= 1,37
Nukleotida bebas A
260
= 1,60

Beberapa hal penting dalam kurva diatas antar lain :
1. Nilai A
260
tidak berubah sampai keadaan suhu yang umumnya dijumpai pada sel hidup
dialam.
2. Peningkatan nilai A
260
terjadi dalam kisaran 6 sampai 8C.
3. Nilai A
260
maksimum sekitar 37% lebih besar dibandingkan dengan nilai awalnya.
Aspek Fisiologis Denaturasi DNA
Proses denaturasi DNA sebenarnya juga terjadi dalam kondisi fisiologis dan bahkan
merupakan bagian dari proses fisiologis yang penting. DNA sebenarnya merupakan struktur
yang dinamis. Bagian tertentu struktur gelembung untai tunggal. Fenomena ini disebut
breathing. Dalam aktivitas fisiologis jasad hidup, keadaan semacam ini sangat penting artinya
karena DNA dapat berinteraksi dengan banyak protein, misalnya dalam proses replikasi dan
transkripsi. Fenomena breathing lebih banyak terjadi pada bagian yang kandungan A T nya
lebih tinggi. Dengan adanya breathing maka protein yang terlibat dalam proses replikasi dan
transkripsi dapat berinteraksi dengan molekul DNA.




Renaturasi DNA
Renaturasi adalah proses pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan
terdenaturasi. Renaturasi merupakan suatu proses yang dapat terjadi secara in vivo maupun in
vitro. Renaturasi in vitro merupakan suatu fenomena yang sangat berguna untuk analisis
molekuler, misalnya untuk mengetahui kesamaan atau kedekatan genetis antara suatu
organisme dengan organisme lain, untuk mendeteksi macam RNA tertentu, untuk mengetahui
apakah suatu urutan nukleutida tertentu ada lebih dari satu pada suatu jasad, serta untuk
mengetahui lokasi spesifik suatu urutan nukleutida pada genom . Dalam bagian ini
merupakan proses renaturasi secara in vitro.
Tahapan renaturasi :
1. Untai tunggal DNA (sense) bertemu dengan untai tunggal lainnya (antisense) secara acak
2. Jika urutan Nukleotida kedua untai tunggal tersebut komplementer, maka akan terjadi ikatan
hidrogen dan terbentuk struktur untai ganda pada suatu bagian. Pembentukan ikatan hidrogen
kemudian akan dilanjutkan pada bagian yang lain secara cepat sehingga terbentuk struktur
untai ganda yang lengkap
Tahapan yang menentukan kecepatan renaturasi bukan proses pembentukan untai gandanya
melainkan proses tumbukan antara molekul untai tunggal dengan untai tunggal yang lain.
Renaturasi dipengaruhi oleh hambatan friksional. Proses ini berlangsung secara acak
sehingga sangat ditentukan oleh konsentrasi DNA.
Syarat Renaturasi
1. Konsentrasi garam cukup tinggi (0,15 sampai 0,5 M). Ion Na+ yang bersifat positif
akan menetralkan gugus fosfat DNA yang bermuata negatif sehingga tidak terjadi
saling tolak antar untaian DNA yang satu dengan untaian DNA yang lain.
2. Suhu renaturasi harus cukup tinggi (20 sampai 25C dibawah nilai Tm).
3. Konsentrasi DNA, semakin tinggi konsentrasinya maka probabilitas tumbukan antar
molekul untai tunggal DNA menjadi semakin besar.
4. Kecepatan perlakuan renaturasi. Jika suatu molekul DNA didenaturasi dengan
perlakuan suhu tinggi kemudian suhunya diturunkan secara cepat, maka probabilitas
molekul DNA sense untuk berpasangan dengan molekul antisense secara akurat akan
lebih kecil. Oleh karena itu proses renaturasi biasanya dilakukan dengan menurunkan
suhunya secara bertahap.



Perbaikan DNA
DNA sebagai materi genetic yang selalu mengalami berbagai reaksi kimia dan selalu
melakukan kopi DNA. Perubahan struktur DNA ini disebut mutasi DNA yang dapat terjadi
pada saat proses replikasi DNA. Untuk menstabilkan hal tersebut maka DNA memiliki
kemampuan untuk memperbaiki (repair) kesalahan yang terjadi pada dirinya sendiri. Jika
mutasi DNA yang terjadi cukup banyak dan DNA tidak sempat untuk memperbaiki (repair)
dirinya sendiri maka akan terjadi kelainan ekspresi genetic bahkan menyebabkan terjadinya
penyakit genetik. Konsumsi makanan yang bergizi serta istirahat yang cukup memungkinkan
tubuh untuk dapat melakukan repair DNA.
DNA repair merupakan suatu mekanisme perbaikan DNA yang mengalami kerusakan /
kesalahan yang diakibatkan oleh proses metabolisme yang tidak normal, radiasi dengan sinar
UV, radiasi ion, radiasi dengan bahan kimia, atau karena adanya kesalahan dalam replikasi
DNA. Mekanisme perbaikan yang terdapat ditingkat selular secara garis besar disesuaikan
dengan jenis kerusakan yang tentu saja terkait erat dengan jenis factor penyebabnya. Sel-sel
menggunakan mekanisme-mekanisme perbaikan DNA untuk memperbaiki kesalahan-
kesalahan pada sekuens basa molekul DNA. Kesalahan dapat terjadi saat aktivitas selular
normal, ataupun dinduksi. DNA merupakan sasaran untuk berbagai kerusakan: baik eksternal
agent maupun secara spontan.
Apabila ada kesalahan / kerusakan DNA, sel mempunyai dua pilihan :
1. Kesalahan tersebut diperbaiki dengan cara mengaktifkan DNA repair. Namun apabila
kesalahan yang ada sudah tidak mampu lagi ditanggulangi, sel memutuskan untuk
beralih ke pilihan kedua.
2. Apabila DNA tidak mampu diperbaiki lagi, akibat dari adanya kesalahan yang fatal
maka akan dimatikan daripada hidup membawa pengaruh yang buruk bagi
lingkungan sekelilingnya. Kemudian sel dengan DNA yang normal akan meneruskan
perjalanan untuk melengkapi siklus yang tersisa yaitu S (sintesis) G2 (Gap 2) dan M
(Mitosis).
Proses perbaikan DNA itu harus melibatkan berbagai macam komponen, yang sangat
berperan penting dalam mekanisme perbaikan DNA tersebut. Komponen-komponen yang
terlibat dalam mekanisme perbaikan DNA dapat dijelaskan secara rinci pada penjelasan
berikut ini.
Komponen yang Terlibat dalam Proses DNA Repair

Repair system Enzim/protein Repair sistem Enzim/protein
Base excision
DNA glycosylase
Mismatch
Dam metilase
AP Endonuklease MutS,MutL,MutH
DNA Polymerase I Exonuclease
DNA ligase DNA Helicase II
Nucleotid exicion
UVrA,UVrB,UVrC SSB Protein
DNA polymerase I DNA plomerase III
DNA Ligase DNA Ligase
Mekanisme DNA repair
Pada dasarnya perbaikan DNA dapat dikelompokkan menjadi 3 yaitu :
1. Demage reversal : penggantian secara langsung, photoreactivation merupakan cara
perbaikan DNA dengan melibatkan pembuangan atau pembalikan DNA yang rusak
oleh sebuah enzim tunggal yang tergantung oleh cahaya. Pada bakteri E. Coli enzim
itu dikodekan oleh gen phr. Adanya kerusakan pada suatu segmen pirimidin (timin
dan sitosin) yang telah berpasangan (dimer) pada suatu struktur DNA, akan
mengaktifkan suatu proses perbaikan dimana suatu kompleks protein enzim
fotoreaktif akan memutuskan ikatan hydrogen tetapi tanpa memutuskan ikatan
fosfodiester antar nukleotida. Perubahan urutan akan diperbaiki dengan pergantian
sesame nukleotida dengan basa pirimidin, dan akan diikuti proses penangkupan
kembali celah yang semula tercipta.
2. Demage removal : proses ini lebih kompleks karena melibatkan replacing atau
penggantian dengan dipotong-potong. Pada excision repair diawali dengan proses
pengidentifikasian ketidaksesuaian sekuen / urutan DNA dalam suatu proses
pengawasan yang dilakukan oleh endonuklease perbaikan DNA. Kompleks enzim
tersebut akan menginisiasi proses pemisahan DNA heliks utas ganda menjadi suatu
segmen utas tunggal. Proses ini akan diakhiri dengan pertautan kembali antara dua
utas tunggal tersebut untuk kembali menjadi bagian dari heliks utas ganda, dengan
perantaraan enzim DNA ligase.
3. Demage tolerance : Mentoleransi kesalahan.Hal ini dilakukan bila kesalahan tidak
dapat diperbaiki sehingga kesalahan terpaksa ditoleransi dan yang terotong adalah
kedua strand. Mekanisme ini adalah sebentuk replikasi rawan kesalahan (error-phone)
yang memprbaiki kerusakan-kerusakan pada DNA tanpa mengembalikan sekuens
basa awal. Tipe perbaikan ini bisa dipicu oleh kerusakan DNA dalam tingkat tinggi.
Pada bakteri E. Coli, system tersebut diatur oleh gen-gen recA dan umu yang
dihipotesiskan mengubah fidelitas (ketepatan) polymerase DNA setempat. Dalam rose
situ, polymerase melakukan replikasi melewati kerusakan DNA, sehingga
memungkinkan sel untuk bertahan hidup atau sintas. Jika sel tersebut berhasil sintas
melalui seluruh kerusakan DNA, besar kemungkinan sel itu mengandung satu atau
lebih mutasi.
Ada 3 tipe demage removal yaitu :
a. Base excision repair, hanya 1 basa yang rusak dan digantikan dengan yang lain.
Basa-basa DNA dapat dirusak melalui deaminasi. Tempat kerusakan basa tersebut dinamakan
denganAbasic site atau AP site. Pada E.coli enzim DNA glycosilase dapat mengenal AP
site dan membuang basanya. Kemudian AP endonuklease membuang AP site dan Nukleotida
sekitarnya. Kekosongan akan diisi dengan bantuan DNA Polymerase I dan DNA Ligase.
DNA polymerase I berperan didalam mensintesis atau menambahkan pasangan basa yang
sesuai dengan pasangannya.sedangkan DNA Ligase berperan dalam menyambungkan
pasangan basa yang telah disintesis oleh DNA polymerase I.

Base Excision Repair

b. Nucleotide excision repair, adalah memotong pada bagian / salah satu segmen
DNA, dari DNA yang mengalami kerusakan. Kerusakan nukleotida yang disebabkan oleh
sinar UV, sehingga terjadi kesalahan pirimidin dimer (kesalahan dua basa tetangga). Pada E.
Coli terdapat protein yang terlibat dalam proses pembuangan atau pemotongan DNA yang
mengalami kerusakan, protein tersebut adalah UVrA, UVrB, UVrC, setelah protein tersebut
mengenali kesalahan, maka nukleotida yang rusak tersebut dihilangkan (dipotong) sehingga
terjadi kekosongan pada segmen untaian nukleotida tersebut. Selanjutnya untuk mengisi
kekosongan tersebut maka RNA polymerase I mensintesis nukleotida yang baru untuk
dipasangkan pada segmen DNA yang mengalami kekosongan tadi, tentu saja dengan bekerja
sama dengan DNA ligase dalam proses penyambungan segmen DNA tersebut.

Nucleotide Excision Repair

c. Mismatch repair. Pada tahap ini yaitu memperbaiki kesalahan-kesalahan yang
terjadi ketika DNA disalin. Selama replikasi DNA, DNA polymerase sendirilah yang
melakukan perbaikan salah pasang. Polimerase ini mengoreksi setiap nukleotida terhadap
cetakannya begitu nukleotida ditambahkan pada untaian. Dalam rangka mencari nukleotida
yang pasangannya tidak benar, polymerase memindahkan nukleotida tersebut kemudian
melanjutkan kembali sintesis, (tindakan ini mirip dengan mengoreksi kesalahan pada
pengolah kata dengan menggunakan tombol delete dan kemudian menuliskan kata yang
benar). Protein-protein lain selain DNA polymerase juga melakukan perbaikan salah pasang.
Para peneliti mempertegas pentingnya protein-protein tersebut ketika mereka menemukan
bahwa suatu cacat herediter pada salah satu dari protein-protein ini terkait dengan salah satu
bentuk dari kanker usus besar. Rupanya cacat ini mengakibatkan kesalahan penyebab
kanker yang berakumulasi di dalam DNA. Pada intinya mekanisme perbaikan mismatch ini
mendeteksi terlebih dahulu pasangan basa yang tidak cocok (matched) atau tidak
berpasangan dengan benar. Kesalahan berpasangan basa atau mismatch dapat terjadi saat
replikasi ataupun rekombinasi DNA, dimana untuk memperbaiki basa yang tidak
berpasangan, terlebih dahulu harus diketahui pasangan basa mana yang mengalami kesalahan
basa pada untai DNA. Caranya segmen DNA yang membawa basa yang salah dibuang,
sehingga terdapat celah (gap) di dalam untai DNA. Selanjutnya dengan bantuan enzim
polymerase celah ini akan diisi oleh segmen baru yang membawa basa yang telah diperbaiki,
yang kemudian dilekatkan dengan bantuan enzim ligase.


Mismatch Repair