KEG saya f- heid- pet evicnkti; rebtfe, T8 / Ai2o1q

Sperma-Mediated Gene transfer: Konsep dan Kontroversi, 2012, 43-55 43

Metodologi Sperma-Mediated Gene transfer

Yidong Niu *
Peking University Rakyat Rumah Sakit, Cina
Abstrak: Penangkapan DNA eksogen dan transfer telur oleh sel sperma adalah
dua proses penting dalam SMGT. Selama dua dekade terakhir, efisiensi
penangkapan molekul DNA eksogen oleh sel sperma telah ditingkatkan oleh
berbagai pendekatan, seperti penggunaan liposom. elektroporasi. Triton-X atau
DMSO-diperlakukan spermatozoa, vektor virus, dan nanopartikel magnetik.
Testis-dimediasi transfer gen (IMGT) adalah varian alternatif novel SIAGT
digunakan untuk menghasilkan hewan transgenik in vivo. Bab ini menyajikan
latar belakang dan fitur dari kedua bentuk non-virus dan virus SMGT, bersamasama dengan TMGT, seperti yang dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir.
Selain itu, mode pembuahan oleh sperma transgen-bearing dibahas.

Kata kunci: Pria sel germinal, SMGT, TMGT, vektor virus, Liposome, Linker,
Elektroporasi, magnatofection, IVF, ICSI, Al, GIFT, Nature kawin.

PENDAHULUAN
Teknik utama dalam sperma-dimediasi transfer gen (SMGT) dapat ditelusuri
kembali ke 1971. ketika kemampuan menangkap molekul DNA asing dengan
spermatozoa pertama kali dilaporkan [1]. Dalam protokol itu, spermatozoa kelinci
ejakulasi diinkubasi langsung dengan [3H] timidin berlabel SV40 DNA_ dan
kemudian genom heterolog diidentifikasi dari sel sperma dan ovum setelah
inseminasi buatan (Al). Namun. Penelitian ini telah diabaikan untuk waktu yang
lama sampai dua studi independen ditemukan kembali bahwa spermatozoa bisa
mengambil molekul DNA asing dan mengirimkan mereka ke oosit dan keturunan
akhir 1980-an [2. 3]. Sejak tahun 1989, meskipun ada keraguan serius dan
kontroversi [4. 5]. beberapa mekanisme molekuler yang tidak biasa memberikan
kontribusi untuk SMGT telah dijelaskan, seperti menangkap eksogen DNA [6] dan
RNA [7] molekul oleh spermatozoa dan penyisipan fragmen asing ke kromosom
sperma [8]. Selain itu, efisiensi SMGT di beberapa eksperimen dilaporkan jauh
lebih tinggi daripada mereka yang dengan metode lain dan tingkat setinggi 88%
[9]. Oleh karena itu, SMGT menawarkan keuntungan besar bagi transgenesis.
Teknik SMGT sederhana pada prinsipnya, yang melibatkan interaksi DNA eksogen
dengan spermatozoa. tetapi mekanisme di balik proses tampaknya sederhana ini
telah terbukti menjadi rumit [10] _ Karena metode SMGT menggunakan DNA
telanjang dianggap tidak begitu efisien untuk transgenesis, pendekatan lain yang

dikembangkan berturut-turut, selama dua puluh tahun terakhir, untuk

meningkatkan efisiensi menangkap eksogen DNA oleh spermatozoa, seperti
lipofection [11], elektroporasi [12], penggunaan Triton-X atau DMSO-diperlakukan
spermatozoa [13, 14] dan penerapan virus atau magnet nanopartikel vektor [1517]. Sebuah rata-rata alternatif novel SMGT adalah testis dimediasi transfer gen
(TMGT). Teknik ini in vivo memperkenalkan molekul DNA eksogen langsung ke
testis melalui suntikan [18], dan tingkat setinggi 41% dan 37% dari transgenesis
dapat diperoleh di Fl dan F2 tikus keturunan [19]. Sampai saat ini, SMGT dan /
atau TMGT telah digunakan untuk menghasilkan hewan transgenik di berbagai
spesies, seperti ikan [20], amfibi [21]. yg setuju [22]. mamalia [3, 19, 23], dan
beberapa invertebrata [2, 24, 25].

METODE PENYERAPAN EKSOGEN DNA OLEH MALE KUMAN SEL

Strategi SMGT saat mempekerjakan dua kelas metode, metode virus berbasis
dan nonviral, untuk mempromosikan penyerapan gen eksogen oleh
spermatozoa. Bab ini menyajikan latar belakang dan fitur dari kedua dua metode
yang dikembangkan untuk transfeksi spermatozoa untuk menghasilkan mamalia
transgenik oleh SMGT.

Metode Viral Berbasis

Kebanyakan vektor virus yang digunakan dalam SMGT berasal dari adenovirus,
retrovirus dan lentivirus, meskipun vektor virus lainnya dapat digunakan. Proses
dasar dimana vektor virus diperkenalkan ke sel target termasuk inkubasi, injeksi,
dan langkah-langkah lainnya, yang akan dijelaskan di bawah metode nonviral.
Adenoviral (Ad) Vektor Karena mekanisme masuknya nuklir sangat efisien
adenovirus (Ad) dan patogenisitas rendah untuk host, vektor adenoviral telah
menjadi alat populer untuk transfer gen ke dalam sel mamalia. Produksi vektor
Iklan tidak membutuhkan kemampuan laboratorium khusus dan titer tinggi
mudah diperoleh. Ketika dibangun dengan penghapusan tertentu rendering
kekurangan replikasi virus, vektor Iklan memiliki kapasitas kloning relatif besar.
Tidak seperti vektor lainnya, adenovirus dapat menginfeksi baik membagi dan
membelah sel dalam sel secara siklus-independen. (Disebut generasi pertama,
Gambar. IA) vektor Iklan yang paling umum digunakan adalah El (awal gen 1)
dihapus vektor Iklan [26]. Gen eksogen dirancang untuk menyisipkan di tempat
El wilayah, yang menempatkan di ujung kiri genom Ad. Karena El produk sangat
penting untuk replikasi virus, El-melengkapi. baris sel, seperti 911 [27] atau C6
[28], harus digunakan untuk menyebarkan vektor (Gambar. 1B). Jika daerah yang
tidak perlu untuk replikasi in vitro, E3, dihapus, kapasitas kloning dapat
meningkat menjadi 8,2 kb (Gambar. 1A) [29].

Gambar 1: Struktur Skema Generasi Pertama Adenoviral (Ad) Vektor (A) dan
Prosedur Iklan Vector Mediated Gene Transfer SMGT atau TMGT (B). A. kiri dan
kanan mengulangi terminal terbalik (ITR) yang dilambangkan dengan persegi
hitam. Lokasi dari unit transkripsi awal dan akhir yang muncul dan bawah panah.
Para sises insert tergantung pada sises dari penghapusan ditunjukkan oleh & El
dan LIE3. Kapasitas transgen maksimal vektor Iklan generasi pertama adalah
sekitar 8,2 kb. B. Vektor shuttle dan backbone plasmid yang linearised dan
kemudian transfected ke garis sel pembantu, garis seperti 911 sel. Di dalam sel,
plasmid bergabung dan genom digabungkan direplikasi dan dikemas menjadi
partikel adenoviral.
Blanchard dan Boekelheide pertama dilaporkan sukses transfer adenovirusdimediasi gen in vitro ke dan ekspresi transgen kuat lacZ terdeteksi di kedua
Sertoli dan sel Leydig kecuali sel germinal setelah pemberian vektor Iklan ke
testis tikus dewasa dengan suntikan intratesticular atau gen testis-dimediasi
Transfer (TMGT) [30]. Lainnya in vivo dan in vitro upaya belum memberikan bukti
dari 'infeksi spermatozoa atau sel spermatogenik ketika vektor Iklan yang
langsung disuntikkan ke tikus testis [31, 32]. Sampai saat ini, hanya satu studi
oleh Farre et al. laporan bahwa gen eksogen dapat disampaikan ke babi
spermatozoa dan sampai batas tertentu dalam keturunan setelah inseminasi
buatan (Al) atau fertilisasi in vitro jika spermatozoa diinkubasi dengan vektor
Iklan in vitro [33]. Pada tahun 2007. Takehashi et al. Berhasil terinfeksi sel induk
spermatogonium dari tikus reporter ROSA26 Cre dengan Cre mengekspresikan
vektor Iklan in vitro, dan sel-sel induk spermatogonium yang terinfeksi
ditemukan reinitiate spermatogenesis setelah transplantasi ke tubulus
seminiferus subur penerima testis [16]. Namun. mereka tidak memperoleh
keturunan transgenik. Sebuah penelitian yang lebih baru dengan injeksi intratestis adenovirus mengekspresikan protein fluorescent (GFP) transgen hijau juga

menghasilkan ekspresi GFP hanya di Sertoli sel [34]. Hasil ini sesuai dengan
laporan di studi-studi sebelumnya, dan menunjukkan bahwa infeksi adenoviral
dapat menyebabkan perubahan dalam fungsi sel Sertoli mengakibatkan
gangguan dalam struktur tubulus seminiferus dan kelangsungan hidup sel
germinal [34]. Gordon menyarankan bahwa integrasi germline cenderung kurang
sering dengan vektor Iklan dibandingkan dengan metode lain, meskipun ada
kemungkinan untuk memberikan gen eksogen ke dalam germline dengan vektor
Iklan [35]. Pada saat ini, data dari kebanyakan studi menunjukkan bahwa vektor
Iklan tidak dapat mempromosikan penyerapan DNA eksogen atau RNA oleh
spermatozoa, apalagi mengantarkan mereka ke generasi berikutnya. Jadi vektor
iklan tidak mungkin digunakan untuk SMGT pendekatan yang melibatkan
inkubasi langsung sel sperma dengan vektor.

Retroviral Vektor
Retrovirus adalah salah satu andalan pendekatan terapi gen saat ini, dan biologi
retrovirus telah dipahami relatif baik. Mereka berisi reverse transcriptase yang
memungkinkan integrasi ke dalam genom inang. Kebanyakan vektor retroviral
yang berasal dari y-retroviral genus, dan disebut vektor atau vektor retroviral
oncorectroviral sederhana. Pada vektor. hanya ada struktur genom gag-pol-env
sederhana. Meskipun vektor retroviral membutuhkan pembelahan sel untuk
transduksi, mereka memiliki sejumlah keuntungan bagi transgenesis dan terapi
gen: efisiensi tinggi integrasi dan gen mentransfer dan mudah produksi vektor
[36].
Pada tahun 1985, dua studi independen menunjukkan bahwa gen eksogen dapat
disampaikan ke dalam sel germline oleh vektor retroviral [37, 38]. Kemudian,
Nagano et al. menunjukkan bahwa vektor retrovirus bisa mentransfer gen
eksogen ke dalam sel induk spermatogonium. Para penulis ditransduksi sel induk
spermatogonium dengan vektor retroviral baik in vitro maupun in vivo selama
proses transplantasi, dan kemudian dibangun kembali spermatogenesis yang
dipertahankan selama enam bulan di penerima tubulus seminiferus [39].
Selanjutnya, penelitian in vitro berikutnya mereka menunjukkan bahwa vektor
retrovirus bisa memberikan gen lacZ menjadi sel-sel induk spermatogonium dari
kedua orang dewasa dan tikus dewasa mengakibatkan integrasi stabil dan
ekspresi gen IacZ di 2% -20% dari sel induk [40]. Percobaan serupa juga berhasil
dilakukan pada tikus [41]. Setelah hati-hati menyelidiki faktor yang
mempengaruhi transduksi retroviral dari spermatogonium, termasuk status
proliferasi sel yang terinfeksi, jenis amplop virus, jenis retrovirus long terminal
repeat, dan metode pengiriman virus, De Miguel dan Donovan menunjukkan (a)
yang banyak vektor retrovirus banyak digunakan dapat digunakan untuk berhasil
transduce spermatogonium pada efisiensi yang tinggi, dan (b) manfaat dari
vektor retrovirus menargetkan zat menarik bagi testis [15]. Kanatsu-Shinohara
tikus ditransduksi stem spermatogonium et al. Sel-sel di situ dengan mikroinjeksi
retrovirus dalam tubulus seminiferus dewasa, dan memperoleh keturunan
transgenik dengan efisiensi rata-rata 2,8% setelah kawin dengan perempuan

yang normal [42]. Para penulis meningkatkan teknik dengan mikroinjeksi vektor
retrovirus ke testis secara langsung mengatasi kelemahan in vitro transduksi
pendekatan [42]. Vektor retroviral ditingkatkan, PLNCX2, berasal dari Moloney
murine leukemia virus (MoMuLV) dan telah dirancang untuk pengiriman gen dan
ekspresi [43]. Selain itu, penelitian yang lebih baru dalam yak telah
menunjukkan bahwa vektor PLNCX2 berguna untuk menghasilkan hewan
transgenik oleh SMGT [44].