TRANSGENIC MICE
DARI KONSEP MENJADI SALAH SATU METODA
UNTUK MEMPELAJARI FUNGSI GEN **
PENDAHULUAN
Berbagai penelitian untuk menyingkap fungsi suatu gen telah banyak dilakukan.
Walaupun para ahli telah dapat menginsersikan fragmen DNA atau gen yang ingin
dipelajari dengan metode transfeksi pada sel-sel tertentu yang dikultur di media kultur
tertentu, tetapi mereka belum puas karena sering hasil yang diperoleh secara invitro
berbeda dengan hasil yang diperoleh secara invivo. Para ahli ingin mempelajarinya
langsung pada mahluk hidup yang utuh (invivo).
Ada 2 cara untuk mempelajari fungsi gen tertentu secara langsung pada mahluk
hidup yaitu dengan cara transgenik dan penginaktifan gen (gene disruption / gene knock
out)1. Pada organisma transgenik, gen atau fragmen DNA yang dimasukkan bisa
merupakan gen atau fragmen DNA yang memang terdapat didalam organisme tersebut
(endogen) dengan tujuan untuk mendapatkan ekspresi yang lebih kuat (overekspresi gen)
dan bisa pula gen atau fragmen DNA yang tidak terdapat pada organisma tersebut
(eksogen). Pada tehnik gene disruption atau knock out gene, gen tertentu yang akan
dipelajari yang terdapat di dalam organisma tersebut dibuat menjadi tidak aktif.
Tikus transgenik telah banyak digunakan secara luas di dalam penelitian
biomedik. Riwayat tikus transgenik dimulai ketika Palmitter pada tahun 1981
memasukan gen thymidine kinase dari virus herpes ke dalam sel telur tikus yang telah
dibuahi (zygot).2,3 Beberapa makalah tentang tikus transgenik telah dipublikasikan oleh
Palmitter (1986)4, Jaenisch (1988)5 dan Hanahan (1989)6. Gordon dkk pada tahun 1983
2
telah mengembangkan tehnik yang lebih baik dan fleksibel yaitu dengan menyuntikkan
gen yang akan diamati secara langsung ke dalam pronucleus telur tikus yang telah
dibuahi/ fertilized eggs (zigot)7. Metode untuk membuat tikus transgenik makin
disempurnakan oleh Hogan dkk pada tahun 1994.8
Makalah ini akan membicarakan metoda yang terakhir dikembangkan oleh Hogan
dkk untuk memasukkan fragmen DNA atau gene secara langsung ke dalam pronukleus
zigot tikus dan cara untuk memproduksi tikus transgenik.
DEFINISI
Tikus transgenik adalah tikus yang mempunyai genom (susunan gen) yang telah
dimodifikasi secara artifisial melalui rekayasa genetik (genetic engineering) dan dapat
diteruskan kepada turunannya.1,2
Fragmen DNA atau gen yang dimasukkan kedalam suatu sel akan diligasikan
secara ujung ke ujung (end to end) kesuatu tempat tertentu di dalam suatu kromosom
secara acak oleh ensim ligasi intraselular sehingga gen atau fragmen DNA itu akan
tersusun secara tandem2,9 (Gb-1). Telur tikus yang telah dibuahi (fertilized eggs) atau
zigot yang pronukleusnya disuntikkan fragmen DNA akan berkembang menjadi tikus
dengan banyak sel-sel tubuhnya mengandung fragmen DNA atau gen yang dimasukkan
tersebut. Fragmen DNA atau gen yang dimasukkan ini akan menempel dan tersusun
secara tandem pada tempat tertentu di dalam suatu kromosom individu transgenik (host)
tersebut secara random.2,3 Bila kromosom yang telah dimodifikasi ini hadir pada sel-sel
kelamin (sel telur dan sperma) maka tikus tersebut akan meneruskan kromosom yang
telah dimodifikasi ini ke tikus turunannya. Tikus yang susunan gennya telah berubah
secara permanen ini dikenal sebagai tikus transgenik (transgenic mice), sedangkan gen
yang dimasukkan tersebut disebut sebagai transgen.3
gen gen gen gen
Gambar-2. Ada 2 metoda pembuatan tikus transgenik: (1) metoda insersi transgen kedalam ES cells
(kiri) dan (2) metoda pronuclear microinjection.
pronukleus telur tikus yang sudah difertilisasi (fertilized egg/zygote), (2) Embryonic
4
Stem (ES) cell electroporation and subsequent blastocyst injection yaitu insersi transgen
kedalam sel induk embrionik (embryonic stem cells/ES cells) yang dilanjutkan dengan
pemasukkan ES cells kedalam blastokista. Makalah ini akan menguraikan cara membuat
tikus transgenik dengan metoda pronuclear microinjection.
1. Persiapan Transgen
Fragmen DNA atau gen yang akan dimasukkan ke dalam pronukleus zigot harus
mengandung promoter, complete protein coding region, sedikitnya satu intron dan
polyadenylation site.11
Transgen ini didapatkan dan di amplifikasi dari suatu genom organisme tertentu
dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Produk PCR kemudian
ditanam pada daerah kloning (cloning site) vector plasmid dengan menggunakan ensim
ligase. Vector yang mengandung transgen ini kemudian ditransfeksikan kedalam bakteri
tertentu dengan tehnik heat shock. Bakteri kemudian ditanam dan ditumbuhkan pada
media agar (agar plate). Setelah tumbuh, bakteri kemudian diperbanyak (dibiakkan) pada
media agar yang cair. Plasmid yang mengandung transgen kemudian diisolasi dari bakteri
yang telah dilisiskan dengan tehnik tertentu. Fragmen transgen ini kemudian diisolasi dari
plasmid dengan menggunakan ensim restriksi (restriction enzyme) dikuti dengan
pemisahan dan pemurnian pada gel agarosa dan dilanjutkan dengan isolasi fragmen DNA
dari gel agarosa (Gb-2).
5
Bentuk linier dari DNA transgen akan meningkatkan efisiensi integrasi transgen
tersebut pada genom tikus hostnya
2. konsentrasi DNA
Konsentrasi DNA yang rendah akan menurunkan efisiensi pengintegrasian
transgen. Sebaliknya konsentrasi yang terlalu tinggi bersifat toksik bagi zigot.
Konsentrasi DNA yang dianjurkan adalah 1.5-2 nanogram/mikroliter
3. kemurnia DNA
DNA yang diinseriskan harus bebas dari semua kontaminasi termasuk sisa
phenol, etanol atau ensim)
4. buffer DNA
Buffer yang dipakai untuk melartkan DNA juga berperan dalam meningkatkan
efisiensi pengintegrasian transgen pada hostnya. Pelarut yang sering dipakai
adalah TE buffer yang mengandung 1mM EDTA.
Tikus ini dipakai untuk mengawini tikus betina untuk mendapatkan zigot. Tikus
yang dipakai berumur 6-8 minggu dan mempunyai penampilan reproduksi yang
baik. Setelah dipakai mengawini superovulated female mice tikus jantan ini
diistirahatkan beberapa hari.
3. Kelompok tikus betina yang dibuat hamil palsu (pseudopregnant female mice)
Kelompok ini adalah tikus betina yang akan menerima zigot yang telah
diinsersikan transgen kedalam pronukleusnya. Tikus ini dikawinkan dengan tikus
dari kelompok sterile male mice dan dicek ada tidaknya plug kopulasi (copulation
plug) besok paginya. Tikus yang dipakai berumur 6-8 minggu dengan berat badan
antara 25-35 gram. Untuk mempermudah transfer zigot disarankan untuk
menggunakan tikus yang mempunyai infundibulum yang besar agar
mempermudah proses transfer, misalnya strain ICR.
4. Kelompok tikus jantan yang disteril (sterile male mice)
Kelompok ini adalah kelompok tikus jantan yang telah disterilkan dengan cara
vasektomi (Gb-3). Tikus ini akan dikawinkan dengan tikus betina pseudopregnant
female mice. Tikus yang dipakai berumur sediktinya 2 bulan. Sebelum dipakai
sebaiknya tikus ini dicek ke ”steril” annya.
4. Larutan kultur yaitu larutan D-PBS atau larutan lainnya yang ditambahkan
bovine serum albumin (BSA), asam piruvat dan antibiotik (penisilin dan
streptomisin)
5. Larutan kultur yang mengandung ensim hyaluronidase
6. Inkubator (temperatur 37C, dengan kelembaban 95% dan mengandung
5% CO2)
7. Surgical set termasuk watchmaker’s forceps
8. Alkohol 70%
9. Stereomikroskop
10. Mouth controlled pipette (Gb-4)
11. 35 mm petri dish
B. Alat dan bahan yang dipakai untuk menginsersikan transgen ke pronukleus zigot
1. Holding pipette (Gb-5) yaitu pipet yang dipakai untuk “memegang” zigot
selama proses penyuntikan transgen ke dalam pronukleus zigot. Untuk ini
diperlukan Borosilicate glass capilary dan mechanical pipette puller
2. Injection pipette (Gb-5) yaitu pipet yang dipakai untuk memasukkan
transgen kedalam pronukleus zigot. Untuk ini diperlukan glass capillary
tubing dengan internal glass filament dan mechanical pipette puller.
Analisa ada tidaknya transgen di dalam ”calon” tikus transgenik (tikus yang
berkembang dari zigot yang diinsersikan transgen) dapat dilakukan menggunakan
Southern blot, Northern blot dan Western Blot.
Gambar-6. Cara memegang tikus (kiri) dan cara penyuntikan hormon intraperitoneal (kanan)
2. Isolasi dan pengumpulan telur tikus yang dibuahi (zigot) dari superovulated
female mice dengan plug kopulasi positif.
Superovulated female mice dengan plug positif dimatikan dengan cara cervical
dislocation (Gb-7). Setelah disemprot dengan alkohol 70% rongga perut dibuka
dan saluran telur (oviduct) diangkat (Gb-8) dan diletakkan dalam medium kultur.
Telur tikus yang telah dibuahi (zigot) diisolasi dari saluran telur (oviduct) dengan
cara merobek saluran telur tersebut di bawah mikroskop. Saluran telur yang
banyak mengandung zigot akan tampak menggelembung (Gb-9). Zigot yang telah
dibebaskan dari saluran telur kemudian diletakkan dalam medium kultur yang
mengandung ensim hyaluronidase di dalam 35mm petri dish selama beberapa
menit (1-2 menit). Ensim hyaluronidase ini berfungsi untuk menghilangkan sel-
sel kumulus yang menempel pada permukaan zigot. Setelah dicuci dalam media
kultur yang tidak mengandung hyaluronidase telur-telur tikus yang telah dibuahi
(zigot) (Gb-10) dikumpulkan dalam 35mm petri dish yang mengandung media
kultur dan diinkubasi dalam inkubator 37C dengan kelembaban 95% dan
mengandung 5% CO2.
Gambar-10 Telur tikus di dalam media kultur pada 35mm petri dish
Petri dish injection chamber diisi dengan sedikit media kultur dan ditutup dengan
paraffin oil (Gb-12).
Gambar-12 Petri dish injection chamber yang mengandung media kultur dan
ditutup dengan paraffin oil
Telur tikus yang dibuahi (zigot) ditransfer dari 35mm petri dish ke petri dish
injection chamber dengan menggunakan mouth controlled pipette. Zigot yang
ditransfer haruslah normal yang ditandai oleh adanya 2 pronukleus dan 2 polar
bodi (Gb-13).
Gambar-13 Zigot yang normal mengandung 2 pronukleus (kiri) dan zigot dalam ”genggaman”
holding pipette, sementara injection pipette tampak dibawah zigot (kanan)
Zigot tanpa pronukleus atau pronukelus lebih dari 2 adalah tidak normal dan tidak
dapat digunakan. Pada saat hendak disuntik zigot di ”pegang” oleh holding
pipette. Setelah injection pipette ditusukan ke dalam pronukleus zigot, transgen
kemudian dipompakan ke dalam pronukleus (Gb-14).
12
PENUTUP
Telah diuraikan tentang pengertian tikus transgenik, penggunaan dan tahap
kegiatan yang harus dilakukan untuk membuat tikus transgenik. Pembuatan tikus
transgenik memerlukan proses yang panjang dan waktu, biaya serta tenaga yang cukup
banyak. Sebagai suatu metoda penelitian invivo tehnik ini sekarang telah banyak
digunakan dibanyak tempat di dunia.
RUJUKAN